一种可稳定表达目标产物的枯草芽孢杆菌及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种可稳定表达目标产物的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、普鲁兰酶（pullulanase，ec 3.2.1.41)是一类去分支酶，可催化未修饰底物的α -1,6 -糖苷键的水解。普鲁兰酶广泛应用于各种工业领域。在淀粉工业中，普鲁兰酶和淀粉酶可以提高淀粉的糖化效率，降低成本。目前淀粉工业以淀粉为原料，原料中的淀粉含有近四分之三的支链淀粉。此外，普鲁兰酶在制药和饲料工业中也发挥着突出的作用。

2、枯草芽孢杆菌菌株安全性强，被美国食品药品监督局 (us food and drugadministration，fda) 认定是公认的安全菌株 (generally recognized as safe，gras)。因为拥有生理生化特征清晰，遗传操作较为简单，分泌及表达能力强，培养发酵较为方便等优点，枯草芽孢杆菌还作为优良的底盘细胞，被改造为微生物细胞工厂，用于生产工业酶、维生素、功能糖、保健品及药物前体等目标产物，表现出了强大的工业生产应用能力。大量的研究证明基因组整合表达保证了异源性遗传物质稳定的维持，基因组整合表达更能稳定的构建合成代谢途径和调控网络。2002–2003年，首次报道了针对枯草芽孢杆菌基因组的缩减工作，敲除了原细胞中原噬菌体相关基因，敲除了332个非必需基因，缩减了 7.7%的基因组，并未明显造成菌株生长缺陷，且中心碳代谢流和亲本菌株基本相同；文献（enhancedrecombinant protein productivity by genome reduction in bacillus subtilis；takuya morimoto,ryosuke kadoya,keiji endo,masatoshi tohata,kazuhisa sawada,shengao liu,tadahiro ozawa,takeko kodama,hiroshi kakeshita,yasushi kageyama,kenji manabe,shigehiko kanaya,atsutoshi ara,katsuya ozaki, and naotakeogasawara；dna res.2008 apr; 15(2): 73–81）采用将枯草芽孢杆菌mgb874基因组精简与优化的方法提高目标产物纤维素酶和蛋白酶的胞外产量；文献（chromosome positioneffects on gene expression in escherichia coli k-12；jack a. bryant, laura e.sellars, stephen j. w. busby, and david j. lee；nucleic acids res.2014 oct 13;42(18): 11383–11392）的研究结果指出基因组整合位置、基因的拷贝数等多方面影响基因的表达。但基因组数据庞大，如何在枯草芽孢杆菌中更好的利用基因组稳定高效的表达目标产物是一项复杂而艰巨的任务。

3、因此，需要进一步探索使用枯草芽孢杆菌基因组高效表达目标产物的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一株稳定表达目标产物枯草芽孢杆菌菌株，为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案。

2、本发明提供一种可稳定表达目标产物的枯草芽孢杆菌，其在枯草芽孢杆菌的基因组中整合有表达目标蛋白的基因元件，所述的基因元件依次是：启动子、目的基因、终止子元件，所述启动子为芽孢杆菌的启动子；所述整合是指将表达目标蛋白的基因元件在枯草芽孢杆菌基因组上的amye或ytxe或ytrf或nprb或trpp位点中一个或多个位点上插入实现。

3、优选地，所述启动子是p43启动子、hapii启动子、papre启动子、prpsd启动子、pacoa启动子或702promoter。

4、具体地，所述目的基因是提高的普鲁兰酶产量相关的普鲁兰酶基因。

5、在具体实施方式中，在枯草芽孢杆菌的基因组的amye位点和ytxe位点均插入有普鲁兰酶基因表达框；在枯草芽孢杆菌的基因组的amye位点、ytrf位点和ytxe位点均插入有普鲁兰酶基因表达框；在枯草芽孢杆菌的基因组的amye位点、ytrf位点、ytxe位点和trpp位点均插入有普鲁兰酶基因表达框；或在枯草芽孢杆菌的基因组的amye位点、ytrf位点、ytxe位点和nprb位点均插入有普鲁兰酶基因表达框。

6、优选地，在所述枯草芽孢杆菌中还单独或同时过表达大分子转运蛋白基因，以进一步提高普鲁兰酶的胞外酶活。

7、进一步优选地，在所述枯草芽孢杆菌中还同时过表达枯草芽孢杆菌comea或yvbw中的一个或两个基因。

8、本发明提供所述的枯草芽孢杆菌在制备目标蛋白中的应用。具体地，所述目标蛋白是普鲁兰酶。

9、在具体实施方式中，所述应用是通过摇瓶发酵或发酵罐内发酵来实现。

10、具体地，所述摇瓶发酵的条件，将种子液接种于发酵培养基于37 ℃下 200 r/min振荡培养进行发酵；或所述发酵罐发酵的发酵条件为恒温37 ℃、用氨水和乳酸进行ph调节保持ph 7.0，通气量为400 l/h，初始转速400 rpm，并以do 30%反馈调节转速，最高为850rpm；优选地，当发酵过程中溶氧开始上升时开始补料，当菌体湿重和普鲁兰酶酶活都不再上升时发酵结束。

11、本发明在 ytxe、ytrf、trpp三个位点首次尝试插入外源基因进行表达，本发明中使用的策略也可以促进枯草芽孢杆菌的基础研究和生物技术应用，具有应用前景。进一步地，通过同时过表达枯草芽孢杆菌comea或yvbw中的一个或两个基因的方法进一步提高了目标产物的产量，因而更具应用前景。

技术特征：

1.一种可稳定表达目标产物的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌的基因组中整合有表达目标蛋白的基因元件，所述的基因元件依次是：启动子、目的基因、终止子元件，所述启动子为芽孢杆菌的启动子；所述整合是指将表达目标蛋白的基因元件在枯草芽孢杆菌基因组上的amye或ytxe或ytrf或nprb或trpp位点中一个或多个位点上插入实现。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子是p43启动子、hapii启动子、papre启动子、prpsd启动子、pacoa启动子、hapii启动子或702promoter。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述目的基因是提高的普鲁兰酶产量相关的普鲁兰酶基因。

4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在枯草芽孢杆菌的基因组的amye位点和ytxe位点均插入有普鲁兰酶基因表达框；

5.如权利要求1至4任一项所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在所述枯草芽孢杆菌中还单独或同时过表达大分子转运蛋白基因，以进一步提高普鲁兰酶的胞外酶活。

6.如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在所述枯草芽孢杆菌中还同时过表达枯草芽孢杆菌comea或yvbw中的一个或两个基因。

7.如权利要求1至6任一项所述的枯草芽孢杆菌在制备目标蛋白中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述目标蛋白是普鲁兰酶。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述应用是通过摇瓶发酵或发酵罐内发酵来实现。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件，将种子液接种于发酵培养基于37 ℃下 200 r/min 振荡培养进行发酵；

技术总结
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种可稳定表达目标产物的枯草芽孢杆菌及其应用。具体是在出发菌株基因组amyE或ytxE或ytrF或nprB或trpp等位点上插入一个或多个目的基因；同时过表达comEA或yvbw等基因中的一个或多个达到高效表达目标蛋白的目的。构建的枯草芽孢杆菌工程菌株在发酵78h胞外普鲁兰酶表达量高达3.2g/L，酶活可达2465 U/ml，该方法构建的工程菌株传代稳定且表达量可达传统高拷贝质粒的效果。

技术研发人员：郑宏臣,柏文琴,付晓平,董文康,甄杰,宋诙,王德信
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/4/29