检测雄激素受体基因突变的核酸组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及前列腺癌ar基因检测，具体而言，涉及检测雄激素受体基因突变的核酸组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，虽然其在我国乃至亚洲地区的发病率较低，但随着我国人口老龄化及生活方式的变化，pca的发病率逐年增长，绝大多数男性患者会在2-5年的激素疗法调控后出现治疗耐药，最终发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，crpc)。研究表明由激素敏感型前列腺癌进展成为crpc主要由拷贝数变异，雄激素受体基因ar异常(ar扩增和过表达、ar突变、组成活性ar变异的表达等)导致。人类ar基因由8个外显子组成，它们编码ar蛋白，包括n端结构域(ntd)、dna结合结构域(dbd)和配体结合结构域(lbd)。研究表明在15-20％的crpc中会发生ar基因的点突变，lbd中至少有5个主要点突变，即l702h、w742c、h875y、f877l和t878a。

2、其中，t878a/s、f877l、h875y是ar基因第8号外显子第878、877、875位密码子编码的氨基酸发生突变。t878a/s会对晚期前列腺癌临床用药阿比特龙、达洛鲁胺产生耐药性，f877l突变可以在crpc的体外和体内模型中赋予对恩扎鲁胺的抗性；h875y突变也可以在去势抵抗性前列腺癌患者中检出且同样对恩杂鲁胺、达洛鲁胺产生耐药；w742l/c是ar基因第5号外显子第742位密码子编码的氨基酸发生突变。多项研究显示，ar基因的w742l突变导致比卡鲁胺耐药，比卡鲁胺由拮抗剂变为激动剂，导致携带w741l突变的ar激活；l702h是ar基因第4号外显子第702位密码子编码的氨基酸突变，l702h突变会导致ar信号的激活，对阿比特龙、达罗他胺都具有耐药性。这些基因位点突变导致ar与雌激素和孕激素类固醇和羟氟他胺结合的亲和力增加，导致激素疗法在临床治疗效果不理想。

3、倘若能够在前列腺癌治疗过程中对ar基因进行监测，通过对ar基因扩增拷贝数和高频突变位点进行检测，就可以及时的了解患者病情进展，在疾病恶化之前更改治疗方案和靶向药物，从而提高前列腺癌的治愈率。因此检测ar基因突变状态是对前列腺癌分型诊断和预后有效治疗的重要前提。

4、目前常用的低频突变检测技术包括突变扩增系统arms(amplificationrefractory mutation system)、二代测序ngs(next generation sequencing)和数字聚合酶链式反应(digital polym erase chain reaction，dpcr)等，但这些技术不能兼具灵敏度高、成本低和周期短的优点。ngs技术灵敏度可达到1％，但是该技术存在操作复杂，花费高，需要测序设备，不适合临床大规模使用的问题；数字pcr技术灵敏度可达到0.01％，但是该技术也存在通量较低(一管最高10重反应)、需要特殊仪器设备、适用范围较为单一、检测成本较高的缺点。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供检测雄激素受体基因突变的核酸组合、试剂盒及其应用以提高低频率基因变异的检测灵敏度和高特异性，提高检测效率，从而解决现有突变检测技术灵敏度低、成本高、周期长等问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了检测雄激素受体基因突变的核酸组合，其包括如下中的至少一种核酸组合：

4、用于检测ar基因第4号外显子l702h突变的第一核酸组合；用于检测ar基因第5号外显子w742c突变的第二核酸组合；用于检测ar基因第5号外显子w742l突变的第三核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子h875y突变的第四核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子f877l突变的第五核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878a突变的第六核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878s突变的第七核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878s突变和f877l突变的第八核酸组合；用于检测ar基因第8号外显子t878a突变和f877l突变的第九核酸组合；

5、第一核酸组合包括依次如seq id no.1-2所示的检测引物、seq id no.3所示的探针和seq id no.4所示的阻滞序列；

6、第二核酸组合包括依次如seq id no.5-6所示的检测引物、seq id no.7所示的探针和seq id no.8所示的阻滞序列；

7、第三核酸组合包括依次如seq id no.5-6所示的检测引物、seq id no.9所示的探针和seq id no.8所示的阻滞序列；

8、第四核酸组合包括依次如seq id no.10-11所示的检测引物、seq id no.12所示的探针和seq id no.13所示的阻滞序列；

9、第五核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.16所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.16所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；

10、第六核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.19所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列，或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.19的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；

11、第七核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.20所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；

12、第八核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.22所示的探针和seq id no.17所示的阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq idno.22所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列；

13、第九核酸组合包括依次如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.21所示的探针和seq id no.17阻滞序列；或如seq id no.14-15所示的检测引物、seq id no.21所示的探针和seq id no.18所示的阻滞序列。

14、术语“探针”是指对应于能够特异性结合dna的数个碱基至数百个碱基的核酸片段，例如rna或dna等。由于被标记，因而可以确认是否存在特定的dna。探针能够以寡核苷酸探针、单链dna探针等形式制造。

15、本发明针对低频突变基因检测将等位基因特异性扩增(arms-qpcr)技术与野生型阻滞序列(blocker)结合，构建了探针式实时荧光pcr方法，设计出针对ar基因5个突变位点的引物，探针和阻滞序列，以进一步提高低频率基因变异的检测灵敏度和高特异性。

16、本发明针对ar基因设计的检测引物具有较高的特异性，原因在于上游引物尽可能地靠近突变位点；且扩增产物不超过200bp；tm值小于探针序列及阻滞序列(blocker)，差值约5℃。

17、设计的探针序列，其tm值大于检测引物约5℃；位置与阻滞序列(blocker)3’端重叠。

18、阻滞序列(blocker)的5'端设置8-14bp与上游引物重合，tm值比检测引物高5℃左右，与探针的tm值相差0-5℃；阻滞序列的tm值在62-70℃。探针的结合位置与blocker重叠，靠近3‘端。

19、检测原理如下：

20、反应体系中，上游引物和blocker为竞争性结合关系，利用引物、探针、blocker与模板间的tm值差使blocker和野生型模板优先结合，使得野生型模板的扩增被终止，不能产生荧光信号；

21、在检测引物的退火温度条件下，而探针和相应检测引物优先与突变型模板相结合，同时扩增引物也不与野生型结合。探针在延伸过程中被切割，产生荧光信号。通过阻滞野生模板扩增的方式来进一步提高突变模板检测的灵敏度，以去除游离核酸中大量野生型背景的干扰，更好的检出肿瘤源性的耐药相关低频突变。

22、检测雄激素受体基因突变的核酸组合可以是第一核酸组合至第九核酸组合中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或九种。为了实现更多类型的ar基因突变检测，本领域的技术人员容易选择多种核酸组合。

23、在本发明应用较佳的实施方式中，探针的5’端和/或3’端具有荧光基团或淬灭基团修饰。

24、第一核酸组合至第九核酸组合中，至少一种核酸组合的探针中的至少一位核酸具有锁核酸修饰。

25、锁核酸修饰以提高探针的退火温度。本领域的技术人员容易想到设计其中的至少一个探针的碱基进行锁核酸修饰。

26、在一种可选的实施方式中，seq id no.20所示探针序列的5’端起第9位和/或第10位碱基具有锁核酸修饰；

27、在一种可选的实施方式中，seq id no.12所示探针序列的5’端起第8位-第11位中的至少一个碱基具有锁核酸修饰；

28、在一种可选的实施方式中，seq id no.12所示探针序列的5’端起第8位-第11位的碱基都具有锁核酸修饰。

29、在本发明应用较佳的实施方式中，荧光基团选自以下的一种：fitc、tet、joe、r110、fam、cy5、cy5.5、hex、vic、rox、tex-red和cy3；在一种可选的实施方式中，淬灭基团选自以下的一种：tamra、bhq-1、bhq-2、dabcyl和mgb。mgb可以提高退火温度(提高约10度)，有助于提高特异性。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，阻滞序列的3端带有如下修饰中的任一种：

31、3'-spacer c3、3'-phosphat、3'-ddc和3'-inverted dt。

32、优选为spacer c3修饰，从而更好地阻断延伸。

33、第一核酸组合至第九核酸组合中，至少一种核酸组合中的阻滞序列中的至少一位核酸具有锁核酸修饰。在一种可选的实施方式中，核糖2'位修饰为锁核酸修饰；锁核酸修饰有助于提升退火温度，提升所修饰物的稳定性，由于错配的序列稳定性更差，因此在配对过程中有助于获得更高的序列特异性。

34、在一种可选的实施方式中，seq id no.17所示阻滞序列的5’端起第15位、第17位和第18位碱基中的至少一个碱基具有锁核酸修饰；

35、在一种可选的实施方式中，seq id no.18所示阻滞序列的5’端起第15位-第18位中的至少一个碱基具有锁核酸修饰；

36、在一种可选的实施方式中，seq id no.17所示阻滞序列的5’端起第15位、第17位和第18位碱基具有锁核酸修饰；

37、在一种可选的实施方式中，seq id no.18所示阻滞序列的5’端起第15位-第18位的碱基具有锁核酸修饰。

38、第二方面，本发明还提供了一种试剂盒或基因芯片，其包括上述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合。

39、试剂盒通常将包含上述容器和一个或多个其他容器，该其他容器包含缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。容器上可以存在标签来指示该组合物用于具体的治疗或非治疗性应用，且还可以指示体内或体外使用的方向。试剂盒中的其他可选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物)、表位修复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照切片等。

40、在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

41、第三方面，本发明还提供了一种检测雄激素受体基因突变的方法，方法以非疾病的诊断为目的，其包括：采上述的检测雄激素受体基因突变的核酸组合或上述的试剂盒或基因芯片对待测样本进行扩增反应，读取扩增产物的荧光信号。

42、在一种可选的实施方式中，若所测样本的ct值小于野生型ct值，或者ct值小于40，则视为存在突变，否则视为野生型。

43、在本发明应用较佳的实施方式中，待测样本选自组织来源的dna、体液来源的细胞外囊泡dna及cfdna样本。

44、在本发明应用较佳的实施方式中，待测样本选自肿瘤细胞、血液、血浆、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、组织或胎儿早检样本中的一种或多种；

45、在一种可选的实施方式中，待测样本是血液样本、血浆样本、组织样本或细胞样本；

46、在一种可选的实施方式中，血液样本为外周血样本；

47、在一种可选的实施方式中，待测样本选自前列腺癌细胞。

48、在本发明应用较佳的实施方式中，扩增反应过程中，检测ar基因第4号外显子l702h突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测ar基因第5号外显子w742c突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测ar基因第5号外显子w742l突变时，退火温度为63.5℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子h875y突变时，退火温度为65℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子f877l突变时，退火温度为60℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子t878a突变时，退火温度为62℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子t878s突变时，退火温度为62℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子t878s突变和f877l突变时，退火温度为60℃±0.5℃；检测ar基因第8号外显子t878a突变和f877l突变时，退火温度为60℃±0.5℃。发明人经过筛选，在上述退火温度为最佳的退火反应温度。

49、在一种可选的实施方式中，扩增反应的程序如下：95-100℃，10-15min；95℃，3-5s，退火30s，循环40-45次；

50、在一种可选的实施方式中，扩增反应所采用的pcr扩增体系包括终浓度为500-2000nm的阻滞序列、50-900nm的上游检测引物、50-900nm的下游检测引物和100-500nm的探针。

51、上述扩增反应体系为单基因突变检测体系。

52、第四方面，本发明还提供了检测雄激素受体基因突变的核酸组合在制备雄激素受体基因突变检测、前列腺癌分型诊断、前列腺癌预后、疗效评估或复发监测产品中的应用。

53、通过检测目标样本的目标位点突变情况，可用于低成本快速检测前列腺癌患者ar基因突变，可以辅助诊断或诊断目标样本是否患有前列腺癌风险，也可为前列腺癌的不良预后提供参考。

54、采用本发明提供的核酸组合能够在前列腺癌治疗过程中对ar基因进行监测，通过对ar基因扩增拷贝数和高频突变位点进行检测，就可以及时的了解患者病情进展，在疾病恶化之前更改治疗方案和靶向药物，从而提高前列腺癌的治愈率。此外，检测ar基因突变状态有助于对前列腺癌分型诊断和预后有效治疗。

55、在一种可选的实施方式中，产品为试剂盒、芯片、测序文库、具有辅助诊断或诊断模块的计算机系统和诊断装置、具有预后模块、疗效评估模块或复发监测模块的计算机系统、或具有预后模块、疗效评估模块或复发监测模块的装置。

56、本发明具有以下有益效果：

57、本发明针对雄激素受体基因突变检测，将等位基因特异性扩增(arms-qpcr)技术与野生型阻滞序列(blocker)结合，构建了探针式实时荧光pcr方法，设计出针对ar基因5个突变位点的引物，探针和阻滞序列，特异的阻滞序列，特异性探针和引物阻滞了野生型的扩增，提高了检测灵敏度和准确性。

58、本发明针对ar基因设计的检测引物具有较高的特异性，原因在于上游引物尽可能地靠近突变位点；且扩增产物不超过200bp；tm值小于探针序列及阻滞序列(blocker)，差值约5℃。

59、本发明提供的探针序列，其tm值大于检测引物约5℃；位置与阻滞序列(blocker)3’端重叠。提供的阻滞序列的5'端设置8-14bp与上游引物重合，tm值比检测引物高5℃左右，与探针的tm值相差0-5℃。探针的结合位置与阻滞序列重叠，靠近3‘端。从而提高了检测特异性。

60、本发明提供的雄激素受体基因突变检测核酸组合对于ar基因突变的检测灵敏度达到0.1％，具有检测灵敏度高的优势。

61、本发明提供的雄激素受体基因突变检测核酸组合、试剂盒可以在游离dna中检测ar的突变，操作简单，检测廉价，可以大规模推广。