一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法与流程

本发明属于细胞工程，特别涉及一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法。

背景技术：

1、传统的单克隆细胞株构建方法主要有经过迷你细胞池的传统流程和经过bulkpool的快速流程。经过迷你细胞池的传统流程包括：表达载体的构建，细胞转染，细胞恢复，迷你细胞池筛选和单细胞筛选。其中，迷你细胞池筛选包括：迷你细胞池构建，高表达迷你细胞池筛选，高表达迷你细胞池扩增，高表达迷你细胞池fed-batch培养与评估。而单细胞筛选包括：流式细胞仪筛选单细胞、单细胞拍照溯源，高表达单细胞筛选，高表达单细胞扩增，高表达单细胞fed-batch培养与评估。整个流程需要4个月的高通量随机筛选，才能够获得表达量基本满意的单克隆细胞株。bulkpool的快速流程包括：表达载体的构建，细胞转染，细胞恢复和单细胞筛选。其中bulkpool的快速流程中的单细胞筛选流程与经过迷你细胞池的传统流程中的单细胞筛选过程相同。经过bulkpool筛选单克隆细胞株的快速流程减少了迷你细胞池筛选步骤，可有效缩短工艺时间。但是使用bulkpool的快速流程获得的单克隆细胞株表达量普遍偏低，而且需要增加筛选通量。

2、因此，亟需找到一种可以高效、快速、特异性构建高表达单克隆细胞株的方法。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的不足，本发明提供一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法。该方法首次采用定向筛选单细胞取代了传统随机性筛选单细胞，筛选通量较快速筛选流程减少一半、表达量提高41.7%，能够有效提高单细胞筛选效率，获得更高表达量的单细胞株，是一种高效、特异性，适用于工业化生产的细胞株构建方法。

2、本发明提供一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法，包括：用含目的基因和gs基因的外源载体转染宿主细胞，经细胞恢复培养后，得到待筛选细胞培养液；将荧光染料alexa fluortm488与蛋氨酸亚氨基代砜混合后，再与待筛选细胞培养液混合，使得荧光染料alexa fluortm488、蛋氨酸亚氨基代砜以及待筛选细胞培养液的阳性转染细胞中的gs蛋白形成三元偶联物，得到alexa fluortm488荧光标记的细胞，经孵育后，离心去上清，将剩余细胞沉淀重悬，得到细胞悬液；将细胞悬液用流式细胞仪特异性地定向筛选荧光强度高的细胞，得到gs蛋白高表达的单克隆细胞株，即为目标蛋白高表达的单克隆细胞株。

3、谷氨酰胺在细胞的生长和代谢中具有重要作用，谷氨酰胺合成酶（glutaminesynthetase, gs）催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，是哺乳动物体内谷氨酰胺形成的唯一途径。蛋氨酸亚氨基代砜（methionine sulfoximine,msx）是gs的竞争性抑制剂，可与谷氨酸竞争性的与gs的活性位点结合，从而抑制gs催化谷氨酸和氨合成谷氨酰胺。

4、发明人惊讶地发现，荧光染料alexa fluortm488能够与蛋氨酸亚氨基代砜结合，是因为与蛋氨酸亚氨基代砜的结构中含有1个-nh2，可以通过-nh2与alexa fluortm488发生特异性的结合有关。而msx是gs的竞争性抑制剂，因此alexa fluortm 488和蛋氨酸亚氨基代砜偶联复合物又可以特异性的与细胞内的gs蛋白结合。

5、本发明首次将alexa fluortm488与msx特异性偶联后，进入细胞内再与gs特异性偶联，并应用于单细胞筛选，该方法提高了标记的特异性，实现了对高表达细胞株的定向筛选。利用gs的表达量与目的蛋白的表达量成正相关关系。因此，通过特异性地筛选迷你细胞池中荧光强度高的细胞，最终单克隆的表达量比快速筛选方法提高41.7%，筛选通量减少一半。

6、根据本发明的具体实施方式，荧光标记的细胞培养液中，荧光染料alexafluortm488的浓度为1.1~1.2 mg/ml。

7、根据本发明的具体实施方式，荧光标记的细胞培养液中，蛋氨酸亚氨基代砜的浓度为20~30 μm。

8、根据本发明的具体实施方式，待筛选细胞培养液的细胞密度为0.8~1.2 e6cells/ml。

9、根据本发明的具体实施方式，孵育的温度为18-25 ℃。

10、根据本发明的具体实施方式，孵育的时间为24 h。

11、根据本发明的具体实施方式，宿主细胞选自dg44、ns0、chos、chok1、cho-gs ko、hek293细胞中的任意一种。

12、根据本发明的具体实施方式，细胞恢复培养为根据宿主细胞类型，采用适应性的选择培养基培养外源gs基因高表达，内源gs基因不表达的细胞至细胞活率完全恢复。

13、根据本发明的具体实施方式，宿主细胞为敲除gs基因的宿主细胞，选择培养基为不含谷氨酰胺的生长培养基。

14、根据本发明的具体实施方式，生长培养基包括cd cho fusion、dynamis、cd cho、actipro、cho maxc、media c plus中的任意一种。

15、本发明的有益效果为：

16、本发明提供的细胞株构建方法，特别引入了单细胞定向筛选方法，具体地，利用荧光染料alexa fluortm488与蛋氨酸亚氨基代砜之间，以及蛋氨酸亚氨基代砜与细胞内gs蛋白之间可发生特异性偶联，进而使荧光染料alexa fluortm 488、蛋氨酸亚氨基代砜与含目的基因和gs基因的宿主细胞混合，形成荧光染料alexa fluortm 488/蛋氨酸亚氨基代砜/gs的三元偶联物特异性标记表达gs蛋白的细胞，利用gs的表达量与目的蛋白的表达量成正相关关系，通过特异性的筛选荧光强度高的细胞，即gs蛋白表达量高的细胞，进而筛选得到目的蛋白表达量高的细胞。该方法提高了标记的特异性，能够实现对目的蛋白高表达单细胞细胞株的定向筛选，同时显著降低筛选通量，极大地提高了筛选效率。

17、本发明提供的细胞株构建方法，通过将单细胞定向筛选方法与传统bulkpool的快速筛选方法相结合，形成了一套全新的细胞株构建方法体系，该方法工艺周期较快速筛选方法缩短至少2周，是一种适用于工业化生产的细胞株构建方法。

技术特征：

1.一种单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的细胞培养液中，荧光染料alexa fluortm 488的浓度为1.1~1.2 mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的细胞培养液中，蛋氨酸亚氨基代砜的浓度为20~30 μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待筛选细胞培养液的细胞密度为0.8~1.2 e6 cells/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为18-25 ℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为24 h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自dg44、ns0、chos、chok1、cho-gs ko、hek293细胞中的任意一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞恢复培养为根据宿主细胞类型，采用适应性的选择培养基培养外源gs基因高表达，内源gs基因不表达的细胞至细胞活率完全恢复。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为敲除gs基因的宿主细胞，所述选择培养基为不含谷氨酰胺的生长培养基。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生长培养基包括cd cho fusion、dynamis、cd cho、actipro、cho maxc、media c plus中的任意一种。

技术总结
本发明公开了一种快速的高表达单克隆细胞株构建方法，包括：用含目的基因和GS基因的外源载体转染宿主细胞，经细胞恢复培养后，得到待筛选细胞培养液；将荧光染料Alexa Fluor<supgt;TM</supgt; 488与蛋氨酸亚氨基代砜混合后，再与待筛选细胞培养液混合，得到荧光标记的细胞，经孵育后，离心去上清，将剩余细胞沉淀重悬，得到细胞悬液；将细胞悬液用流式细胞仪特异性地定向筛选荧光强度高的细胞，得到GS蛋白高表达的单克隆细胞株，即为目标蛋白高表达的单克隆细胞株。本发明方法提高了标记的特异性，能够实现对目的蛋白高表达单克隆细胞株的定向筛选，同时显著降低筛选通量，缩短了工艺周期，极大地提高了筛选效率。

技术研发人员：焦鹏,房磊,石茜
受保护的技术使用者：上海碧博生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/12