专利名称：可诱导、双重稳定p53表达的细胞株及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种可诱导、双重稳定P53表达的细胞株及其构建方法和应用。
背景技术：
骨肉瘤是一种好发于青少年的恶心骨肿瘤，发病年龄主要集中在10-20岁之间， 在临床住院治疗的恶性骨肿瘤病人中占35%-44%，因其恶性程度高、转移早，疗效差，一直是临床骨科医生研究的难点、焦点和热点。随着新辅助化疗的积极开展配合积极的手术治疗如保肢手术的开展，使骨肉瘤的生存质量和预后明显改善，国外五年生存率已达到了 80% 以上，国内较好的骨肿瘤治疗中心五年生存率达到了 60%左右，与国外还存在不小的差距， 究其原因1.治疗的巨额花费患者难以承受而放弃治疗和中途停止治疗，2.部分病人因为肺部和远处转移、局部复发和化疗、放疗的严重毒副作用和并发症，及产生耐药问题而影响了这些方法的临床推广和应用。寻求一种经济、安全、有效、毒副作用小或者可以减少或降低现有药物剂量的方法用于骨肉瘤的治疗成为患者、临床医生、生物学家和药物学家共同的愿望。P53是重要的肿瘤抑制基因，自从该基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。人们最初认为P53基因是一种癌基因，但随着近十年研究的深入，P53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了 P53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，骨肉瘤中P53突变率为75%，主要集中在5 9外显子，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。该基因转录的P53蛋白可以修复细胞DNA损伤，在损伤不能修复的情况下阻滞细胞周期，诱导细胞的凋亡。P53与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂，其中P53参与调控的基因已超过160种，许多化疗药物都直接或间接的通过调节P53来达到使肿瘤细胞凋亡的目的。 而HPV 16型E6蛋白具有泛素化降解P53蛋白的作用，通过调节转染入细胞内的E6基因的表达，来调节细胞内P53蛋白含量。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可诱导、双重稳定P53表达的细胞株，本发明的第二个目的是提供上述的细胞株的构建方法，本发明的第三个目的是提供上述的细胞株在筛选预防或治疗骨肉瘤的药物中的应用。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案
可诱导、双重稳定P53表达的细胞株，该细胞株访)于2010年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :C201075。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案 可诱导、双重稳定P53表达的细胞株的构建方法，该方法包括以下的步骤
(1)将HPV 16型E6基因编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；
(2)将步骤(1)得到的重组表达载体和表达调控系统转染入宿主细胞中，筛选得到可诱导、双重稳定P53表达的细胞株。作为进一步的改进，所述的表达调控系统为Clontech公司的1Tet-Off advanced 系统。作为进一步的改进，所述的真核表达载体具体为Tet-OfT advanced系统中的 pTRE-tight 质粒。作为进一步的改进，所述的宿主细胞为U-20S细胞。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案
上述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株用于筛选预防或治疗骨肉瘤的药物中的应用。一种筛选预防或治疗骨肉瘤的药物的细胞模型，该细胞模型采用上述的可诱导、 双重稳定P53表达的细胞株。实验证明，本发明的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株U_20SE6tet6可通过多西环素调节E6基因的表达，间接改变U-20SE6tet6细胞内P53含量，为筛选治疗骨肉瘤的药物的P53相关作用机制的研究提供实验平台。
图 1 为 Clontech 公司 p^Tet-Off Advanced 系统质粒构象。图2为Clontech公司pTRE_Tight质粒，E6基因插入于多克隆位点(MCS)。图3为U_20SE6tet6细胞显微镜下200 X图像。图 4 为 western blot 结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1、重组表达载体pTRE-HA-E6的构建
构建带HA标签的含E6基因的质粒pHA-E6。首先用限制性内切酶Bgl II和EcoR I 将pCl neo质粒进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化收集，得到含巨细胞病毒早期即刻增强子/启动子的cDNA。同时将不包含启动子的pEGFP-1质粒也用限制性内切酶Bgl II和EcoR I双酶切，酶切产物同样进行琼脂糖凝胶电泳纯化收集，用 DNA连接酶连接上述得到的产物，即得到插入了巨细胞病毒早期即刻增强子/启动子的 pEGFP-Ι质粒。HPV 16型E6基因从宫颈癌Siha细胞基因组中PCR扩增获得(正向引物 5，-GAAACCGGTTAGTATAAAAGC-3，；反向引物，5，-CCATGGTAGATTATGGTTTCT-3，)。将获得的 E6基因的cDNA克隆到含HA标签的Bluescript KS质粒中，以Β ο I和Not I限制性内切酶进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化收集获得含HA标签的HA-E6酶切产物，同时以Bio I 和Not I限制性内切酶对插入巨细胞病毒早期即刻增强子/启动子后的pEGFP-1后质粒进行双酶切，将纯化收集的酶切产物与HA-E6酶切产物以DNA连接酶进行连接，即获得pHA_E6 质粒。将PHA-E6质粒和pTRE-Tight质粒分别用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切，分别纯化分离酶切产物，通过DNA连接酶，将HA-E6基因片段插入到pTRE-Tight质粒EcoR I钝尾和BamH I之间，从而获得重组目的质粒pTRE-HA_E6。实施例2可诱导、双重稳定P53表达的细胞株U_20SE6tet6的构建
将骨肉瘤U-20S细胞接种于6孔板上，密度约30万个/孔。以Lipofectamine 2000 将Clontech公司的pTet-Off质粒转染入U-20S细胞，继续培养48小时后收获细胞，接种于多块IOcm细胞培养皿中，从低到高递增浓度(0，50，100，200，400，800 μ g/ml) G418筛选稳定转染pTet-Off基因的细胞克隆，发现200 μ g/ml以上浓度G418筛选5天后细胞基本死亡，遂以200 μ g/ml筛选培养2周，获得有G418抗性的细胞克隆。再以Lipofectamine 2000瞬时转染含荧光素酶报告基因的四环素响应元件pTRE-luc表达质粒到上述细胞，通过荧光素酶报告基因活性强弱，筛选活性最高的受四环素严格调控的细胞克隆做下一步转染母细胞。挑选30个细胞克隆接接种于6孔板，1天后以Lipofectamine 2000将转染了 HPV 16 E6蛋白基因pTRE-HA-E6质粒和携带潮霉素抗性基因的pTk-Hyg质粒共同转染上述细胞，以G418 200 yg /ml和潮霉素IOOyg /ml培养筛选，最终筛选到一个稳定转染的细胞克隆，命名为U-20SE6tet6细胞，图3所示为U-20SE6tet6细胞显微镜下200X图像。该细胞株于2010年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO :C201075。实施例3可诱导、双重稳定P53表达U_20SE6tet6细胞对多西环素反应性分析将实施例2中获得的U-20SE6tet6细胞培养于MCCOy’S 5A +10%胎牛血清的培养基中，
培养基中以G418 IOOyg /ml和潮霉素50 μ g /ml维持，将处于生长对数期的细胞经胰酶消化后计数，以20万个/孔接种于6孔板中，加入上述培养基定容至2ml体积，置于37°C 含5% CO2培养箱中。M小时后，更换培养基，取细胞生长良好的板内5孔加入多西环素，使多西环素浓度分别为0，0. 1，1，5，20ng/ml，培养基定容至^iil，继续置于培养箱中培样48小时。48小时后提取细胞核蛋白，通过western blot分析细胞P53蛋白含量变化，如图4所
7J\ ο结果表明随着加入多西环素的浓度增加，P53蛋白浓度增加，当多西环素达到 5ng/ml和20ng/ml时，P53浓度达到最大。可诱导、双重稳定P53表达的骨肉瘤细胞株 U-20SE6tet24构建成功，可通过四环素调节E6的表达来间接调节P53蛋白含量。
权利要求
1.可诱导、双重稳定P53表达的细胞株，其特征在于该细胞株(U-20SE6tet6)于2010 年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C201075。
2.根据权利要求1所述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株的构建方法，其特征在于该方法包括以下的步骤(1)将HPV16型E6基因编码基因插入真核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；(2)将步骤(1)得到的重组表达载体和表达调控系统转染入宿主细胞中，筛选得到可诱导、双重稳定P53表达的细胞株。
3.根据权利要求2所述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株的构建方法，其特征在于表达调控系统为Clontech公司的Tet-Off advanced系统。
4.根据权利要求2所述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株的构建方法，其特征在于真核表达载体具体为Tet-Off advanced系统中的pTRE-tight质粒。
5.根据权利要求2所述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株的构建方法，其特征在于宿主细胞为U-20S细胞。
6.根据权利要求1所述的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株用于筛选预防或治疗骨肉瘤的药物中的应用。
7.一种筛选预防或治疗骨肉瘤的药物的细胞模型，该细胞模型采用权利要求1所述的细胞株。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种可诱导、双重稳定P53表达的细胞株及其构建方法和应用。可诱导、双重稳定P53表达的细胞株，该细胞株(U-2OSE6tet6)于2010年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOC201075。实验证明，本发明的可诱导、双重稳定P53表达的细胞株U-2OSE6tet6可通过多西环素调节E6基因的表达，间接改变U-2OSE6tet6细胞内P53含量，为筛选治疗骨肉瘤的药物的P53相关作用机制的研究提供实验平台。
文档编号A61P35/02GK102168069SQ201010580028
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者杨迪生, 苗旭东, 陶惠民 申请人:浙江大学医学院附属第二医院