专利名称：一种具有拮抗趋化因子受体ccr5的活性多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多 肽及其制备方法和应用。
背景技术：
艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)侵入人体后，破坏人体免疫功能而使人体发 生一系列不可治愈的感染和肿瘤，最后导致患者死亡的传染病。艾滋病由于其传播快、难治 愈和缺乏有效的治疗药物等特点正在全世界范围内及我国较大规模地传播，已引起世界各 国高度重视，成为了二十世纪的瘟疫。但目前国内外市场尚无有效的艾滋病治疗药物，且现 有抗艾滋病药物副作用较大，价格昂贵。目前市面上的抗艾滋病药物主要是相关蛋白酶的 抑制剂，主要有逆转录酶抑制剂，其中包括核苷类逆转录酶抑制剂(NPTI)和非核苷类逆转 录酶抑制剂(NNRTI)代表药物有拉米夫定、阿巴卡韦、泰诺福韦、双肽芝、Trivizir等药物， 和蛋白酶抑制剂代表药物有奈非那韦、安普那韦、吲哚那韦、罗品那韦、利托那韦等。由于这 些药物都存在干扰人体正常酶类代谢、毒副作用较大和容易产生病毒耐药性等缺点，所以 人类要战胜艾滋病这个二十世纪的瘟疫急需要新型机制的抗病毒药物。随着对HIV感染机制研究的不断深入，科学家们对HIV病毒感染细胞的机制已经 逐步阐明。能阻断HIV感染细胞任何一个生活周期的途经都有可能用来治疗艾滋病，所以 了解HIV感染细胞机制的研究对新型抗艾滋病药物的开发十分重要。伴随着趋化因子受体作为HIV病毒进入细胞的共受体的发现，作为趋化因子受体 天然配体的趋化因子及其类似物成为了研究的热点。趋化因子是一大类能使细胞发生趋化 运动的小分子细胞因子，其作用是控制和调节白细胞的趋化运动及免疫功能，在机体的免 疫反应调节中起重要作用。趋化因子之间的结构和功能相似，分子量多在8-12KD之间，对 嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等多种细胞均有趋化作用。目前己发现的趋化因子有50 多种，它们的典型特征是有保守半胱氨酸残基的结构同源性和能与特异的G蛋白偶联的 受体结合的特性。到目前为止，许多趋化因子的三维结构已经通过X光晶体衍射和NMR核 磁共振技术的方法确定，研究结果表明趋化因子单体的三维空间结构都是高度一致的。病毒巨口耆细胞炎个生蛋白—II (virus macrophage inflammatory protein-II, vMIP-II )是由人疱疹病毒8的K4基因编码的一种病毒趋化因子，与人CC类趋化因子有较 大的同源性，是人趋化因子的类似物。vMIP - II与趋化因子受体结合后不引起胞内Ca2+迅 速内流，故不引起信号传导，从而对趋化因子与相应受体的结合起到拮抗作用。vMIP — II 和CC、C)(C趋化因子受体都能结合，所以对趋化因子有广谱的拮抗作用。vMIP-II不同于其 他趋化因子的一个独特特点是它能够拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等 在内的多种趋化因子受体，特别是对CCR5和CXCR4有较高的亲和力。vMIP- II通过对HIV/SIV的共受体CCR5/CXCR4的封闭和阻断，能够有效的阻止病毒感染靶细胞，是一种比较理 想的病毒进入抑制剂。vMIP-II的广谱趋化因子受体封闭的作用，使vMIP-II成为一种广谱 的HIV进入抑制剂。多肽是一类在氨基酸构成及其连接方式上与蛋白质相同，但在某些性质方面又有 别于蛋白质的物质，如其空间结构较简单、稳定性较高、免疫原性较低或无免疫原性等。多 肽药物最理想的模式是具有人源蛋白分子的结构，以免引起免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中治疗艾滋病药物缺乏，提供一种具有拮抗趋化 因子受体CCR5的活性多肽。本发明的另一目的是提供上述多肽的制备方法。本发明的又一目的是提供上述多肽的应用。本发明通过以下技术手段实现上述目的
一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多肽，命名为C25P，具有SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列或者具有通过在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替换一个或多个氨基 酸残基所得到的氨基酸序列，具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性。上述多肽的制备方法，包括以下步骤
(1)在蛋白质数据库检索成熟形式的趋化因子序列，利用基于结构的多重序列分析，寻 找VMIP- II受体结合的高度保守区；
(2)利用计算机软件进行分子模拟，预测多肽的空间结构；
(3)排除无关残基的干扰，确定要合成的目标多肽的序列；
(4)固相合成法合成目标多肽，纯化；
(5)检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。其中步骤(1)中，蛋白质序列检索自SWISS-PR0T蛋白质数据库，采用成熟形式 的趋化因子序列，(http://us. expasy. org/sprot)。蛋白质序列多重对齐比较分析采用 Informax Vector NTI Version 9· 0 软件包完成。步骤(2)中分子模拟采用SWISS-MODEL建模程序进行，为目前最常用、准确度最高 的建模程序。空间建模采用“First Approach Mode”过程。步骤(4 )中纯化是指用HPLC进行纯化。步骤(5)中检验多肽的生物活性包括三项实验多肽趋化和趋化抑制实验，即通 过检验多肽本身的趋化活性以及它对生理性趋化因子的阻断作用来观察多肽对受体的功 能；细胞内钙流实验，是通过研究多肽对趋化因子受体的信号转导的影响，来观察多肽对受 体的功能；抗HIV活性实验，通过细胞病毒共培养实验，来观察多肽抗SIV病毒感染细胞能 力。上述多肽作为CCR5受体拮抗剂在抗炎药物开发以及作为制备治疗艾滋病的先导 药物中的应用。上述多肽在制备免疫调节药物或增加机体免疫系统功能的药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明多肽具有较好的抗趋化因子受体CCR5活性，同时能够有效保护免疫系统机能，并且免疫原性弱，还能够有效刺激机体免疫系统，增加T淋巴细胞功能，增强免疫作用。我们的研究表明，多肽C25P对PHA刺激的T淋巴细胞早期活化抗原⑶69的表达 具有促进作用；对PHA刺激的T淋巴细胞增殖也具有促进作用，并能促进T淋巴细胞进入分 裂周期，且呈剂量依赖性。提示多肽C25P对T淋巴细胞功能具有增强作用，促进其发挥免 疫效应。昆明种小鼠经长期腹腔注射多肽C25P后检测抗体滴度，并不引起昆明种小鼠产生 中和抗体，表明多肽C25P对小鼠的免疫原性较弱。多肽C25P能明显提高小鼠的胸腺指数、 脾脏指数，增加淋巴细胞转化率，T细胞计数显著性增强，并能促进细胞因子的分泌，说明多 肽C25P具有刺激小鼠免疫系统、增加T淋巴细胞功能，增强免疫的作用。多肽C25P使小鼠 外周血⑶3+、⑶4+、⑶8+ T细胞计数显著性增强，而⑶4+/⑶8+比值仍处于正常水平；同时 体外检测到小鼠血清细胞因子IL-2、IFN-Y和IL-10都有增加趋势，而且淋巴细胞凋亡无 显著变化，提示多肽C25P可能非特异性地增加机体的免疫系统功能。
图1 :VMIP - II与其它CCR5受体结合因子的多重序列对比分析方框内为排除标 准，黑色圆点示高度保守的区域；
图2: vMIP-II的CCR5理论结合位点在分子表面位置； 图3 =VMIP-II的CCR5理论结合位点示意图； 图4 多肽C25P分子建模，三维结构预测图； 图5 多月太C25P HPLC图； 图6:多肽C25P质谱图7 多肽C25P的趋化活性实验(ri=3)，*表示与阳性对照组相比P<0. 05 ； 图8 多肽C25P对MIP — 1 β引起细胞趋化的抑制率； 图9 :100ng/ml多肽作用后与对照组的趋化指数比较(n=3)； 图10 多肽C25P对PBMC胞内钙浓度的影响，选自lOOng/ml浓度组具有代表性结果； 图11 不同浓度的C25P对CCR5特异性因子MIP — 1 β引起的钙流的影响； 图12 :C25P抑制合胞体形成实验的各组合胞体形成数； 图13 :C25P抑制合胞体形成实验的各组抑制率； 图14 多肽C25P抗体滴度的测定。
具体实施例方式实施例1多肽设计
蛋白质序列检索自SWISS-PROT蛋白质数据库，采用成熟形式的趋化因子序列 (http://us. expasy. org/sprot)。蛋白质序列多重对齐比较分析采用Informax Vector NTI Version 9.0软件包 完成。采用其中的AlignX过程对影响趋化因子受体结合的残基进行预测分析先选用与某 一受体特异结合的人源性趋化因子序列进行基于结构的多重序列对齐分析，在全部趋化因 子序列中均存在或保守取代的残基即可能是与该受体结合有关的残基(即标准结合残基模 型的建立)。再将vMIP-II的序列引入标准结合残基模型中进行多重序列比较分析从而得 出vMIP-II与该受体结合有关的残基(即vMIP-II与受体结合可能有关的残基)。为了最大可能的除去无关残基的干扰，利用与vMIP-II同源性较高，但不与该受体结合的趋化因子 作为排除标准，排除作为排除标准亦存在的残基，从而得到与受体结合高度相关的残基。从结果可以看出vMIP-II与CCR5趋化因子受体结合位点主要在其核心骨架，主要 的位点有 P21，K45, R46, V50 (图 1)。进一步利用 Informax Vector NTI Version 9· O 软 件进行了这些位点的空间位置观察，结果显示vMIP-II结合CCR5受体的特异性残基P21， K45，R46，V50。从位点空间位置看这些保守的位点均在分子表面(图2，图3)，有较大的可能 是分子直接的结合位点。尤其有K45，R46这两个带正电荷的氨基酸组成的正电区，在所有 的结合CCR5的趋化因子中均存在，而不能结合CCR5的趋化因子却不存在这样的一个区域， 所以这两个残基对CCR5的结合可能有重要作用。根据上面序列分析和残基空间位置分析结果，我们初步设计了分别对应CCR5受 体结合理论位点的多肽。考虑到分子空间结构在分子间作用的重要地位，我们通过对目的 多肽进行了空间三维结构的预测验证了目的多肽是否能够很好的重现类似于趋化因子相 应部位的空间结构。目的多肽的空间建模采用了目前最常用、准确度高的SWISS-MODEL建 模程序进行，空间建模采用“First Approach Mode”过程。分子预测的结果显示多肽C25P (序列为PQVLSWYPTSQLCS KPGVIFLTKRG)与νΜΙΡ — II相应区域结果相似。多肽的分子结 构预测图见图4。实施例2多肽的合成、纯化 (1)多肽合成与纯化
多肽采用Fmoc —固相法在多肽合成仪上合成，将反应瓶用100%乙醇充分清洗后，加 入约40ml的5%的二甲基二氯硅烷放置通风橱中过夜使反应瓶硅烷化，经乙醇粗洗后，置 于-80°C冰箱30min冷却反应瓶，再次用乙醇洗涤，烘干备用；称取0. 5mmol Wang's resin 0.7130g置于反应瓶中；加入3倍于树脂体积的DCM溶液，溶胀30分钟后排空液体。然后 在多肽合成仪上按偶连氨基酸、茚三酮反应检测和α —氨基脱保护的循环从C端到N端进 行，直到全部氨基酸残基都偶连上去。偶连完成后，取下反应瓶用DCM清洗，抽干树脂后用 预冷的切割液，切割下来的多肽用HPLC进行纯化。多肽纯化在WaterseOOE高压液相色谱 仪上，用Kromasil 100-5C18柱子进行高压反相色谱，将收集的目的峰多肽冻干保存。通过 Fmoc 一固相法合成法成功合成了来源于νΜΙΡ — II的多肽C25P，通过纯化冻干后获得冻 干粉5. 3mg。(2)多肽的纯度检测
为了进一步检验合成的多肽是否达到进行活性实验所需的纯度，利用HPLC进行 了纯度分析。(使用仪器类型液相色谱，仪器型号Waters600E，柱温室温，柱型号 kromasill00-5C18，梯度方式高压梯度，检测器紫外。)取微量多肽C25P的冻干粉溶于 50%甲醇与50%双蒸水的混合液中溶解，使终浓度小于0. lmg/ml。用HPLC的微量上样器 按25ul上样到Kromasil 100-5C18柱子中，用0. 5ml/min的流速按90%乙晴 10%乙晴做 线形梯度洗脱，用220nm波长检测。合成纯化后的多肽C25P峰面积占总面积的95. 1805%， 也即是多肽C25P的纯度为95. 18%，见图5。
权利要求
1.一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多肽，其特征在于具有SEQ ID N0:1的氨基 酸序列或者具有通过在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中缺失、加入、插入和/或替换一个或多个 氨基酸残基所得到的氨基酸序列。
2.权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)在蛋白质数据库检索成熟形式的趋化因子序列，利用基于结构的多重序列分析，寻 找vMIP- II受体结合的高度保守区；(2)利用计算机软件进行分子模拟，预测多肽的空间结构；(3)排除无关残基的干扰，确定要合成的目标多肽的序列；(4)固相合成法合成目标多肽，纯化；(5)检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。
3.根据权利要求2所述多肽的制备方法，其特征在于步骤(1)中，蛋白质序列检索 自SWISS-PR0T蛋白质数据库，采用成熟形式的趋化因子序列，http://us.expasy.org/ sprot，蛋白质序列多重对齐比较分析采用hformax Vector NTI Version 9. O软件包完 成。
4.根据权利要求2所述多肽的制备方法，其特征在于步骤(2)中分子模拟采用 SWISS-MODEL建模程序进行，空间建模采用“First Approach Mode”过程。
5.根据权利要求2所述多肽的制备方法，其特征在于步骤(4)中纯化是指用HPLC进行纯化。
6.根据权利要求2所述多肽的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述检验多肽的生物 活性包括趋化和趋化抑制实验、细胞内钙流实验及抗HIV病毒活性实验。
7.权利要求1所述多肽作为CCR5受体拮抗剂在抗炎药物开发以及作为制备治疗艾滋 病的先导药物中的应用。
8.权利要求1所述多肽在制备免疫调节药物或增加机体免疫系统功能药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有拮抗趋化因子受体CCR5的活性多肽，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID NO:1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替换一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列。本发明还公开了这种多肽的制备方法，包括在数据库中搜索相关蛋白质序列，进行多重对齐比较分析，筛选出vMIP-Ⅱ受体结合的高度保守区，通过分析模拟手段排除无关残基干扰，确定目的多肽序列，固相合成法合成，最后检验其生物活性。本发明的多肽可作为CCR5受体拮抗剂用于抗炎药物开发以及作为治疗艾滋病的先导药物，也可以作为免疫调节作用药物或增加机体免疫系统功能的药物应用。
文档编号A61K38/17GK102146132SQ201010580008
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者何滔, 叶石敦, 孙晗笑, 张光, 李秀英, 汤曼莉, 莫雪梅 申请人:暨南大学