专利名称：表达朊病毒的稳定细胞克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自表达朊病毒蛋白PrP的MovS6细胞系并能够承受所述PrP的致病型ft^sc的复制或增殖的细胞克隆，并且还涉及其应用，特别是在评估和/或检查获得或处理生物产品的过程的有效性的体外方法中、或在评估和/或检查去污染程序的体外方法中、或在评估或筛选在调节与“非常规性可传播因子"NCTA相关的感染性上具有活性的化合物的方法中的应用。当前技术可传播性海绵状脑病(TSE)与许多以中枢神经系统(CNS)退化为特征的遗传或获得性疾病共同分为一组。在人类中最常见的形式是克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)，但是TSE也存在于许多哺乳动物中(特别是绵羊的瘙痒病和牛海绵状脑病)。这些疾病的致病因子被分类在“非常规性可传播因子”(NCTA)类别中。疾病的特征是存在被称为朊病毒蛋白(I^rP)的细胞外蛋白，其在疾病过程中转变成对蛋白酶例如蛋白酶 K有抗性的不溶形式，并在中枢神经系统中积累。这种被称为I^rPsc的病理异常形式的ft~P， 带着感染性被共纯化，并且其积累出现在组织学病变显现之前。它来自于PrP朊病毒蛋白的构象改变。已经证实，PrP编码基因的表达没有变化，其翻译也没受任何损伤(Prusiner， Biochemistry 1992;31:12277-88)。现有的数据还不能证实造成TSE的可传播性因子在血液衍生物中处于感染形式 (Brown 等，2001，Semin Hematol. ； 38(4Suppl 9) :2_6)。但是，还不能得出它不存在的结论，这种不确定性首先是由于血液中可能非常低的浓度，其次是由于在临床体征显现之前这些疾病特征性的非常长的临床沉默潜伏期。此外，NCTA超常的抗性使得不能依靠常规使用的失活方法，例如Tween-TNBP溶剂 /去污剂处理，其已被证明能够有效降低血液衍生物例如低温沉淀的血浆蛋白(因子VIII、 von Willebrand因子等)的病毒载量。由于从治疗应用的观点来看，生物产品例如血浆凝结制品的获得或处理应该包含病毒消除/失活步骤，因此血源性药物的制药工业目前正在寻求评估血源性制品传播CJD变体的理论风险。当前，常规采用的NCTA相关感染性的滴定方法，使用在金黄色仓鼠中通过脑内注射各种稀释度的带有NCTA的测试产品进行的体内滴定方法。根据对应于所执行稀释度的各个组中感染动物的数量，能够计算出感染滴度，并在未处理的参比的基础上建立给定方法的降低系数。但是，这种方法的缺点是时间长(约一年)、昂贵，并且与需要关于朊病毒消除有效性的快速结果的工业规模发展相对不相容。此外，通常需要引入浓缩感染因子的步骤，以便增加滴定方法的灵敏度。目前对造成TSE的感染因子进行浓缩的所有程序，都包括ft^sc的纯化。已经提出了用于TSE感染因子的体外滴定的其他方法通过 Western 印迹(MacGregor, Transfusion J. Medecine 2001 ；11, 3-14)或通过ELISA来检测ft^sc的技术，一般需要预先用蛋白酶K消化待分析的样品或用离液剂进行变性，以便将致病蛋白(ft^sc)与正常蛋白(I^rP)区分开。
最近，开发出了基于使用不识别PrP的ft~psc特异性抗体的另一种滴定方法 (Korth 等，Nature 1997 Nov 6, 390(6655) :74-7)。美国专利6，150，583在其一部分中描述了产生表达异源表位标记的PrP的转基因动物，所述异源表位根据朊病毒蛋白的构象，暴露或不暴露在朊病毒蛋白的表面上。在Saborio 等的文献(Nature ；2001，411，810-3)中描述的被称为 “PMCA”(蛋白质错误折叠循环扩增)的方法，设想了将源自于从被污染动物得到的组织或流体的致病型 NCTA蛋白与非致病型相接触，以便将后者转变成致病型。PMCA方法尽管仍在开发之中，但已证明至少与生物分析同样灵敏。然而，它不提供关于检测到的ft^sc的感染性的证据，并已证明难以使用血浆基质执行。此外，不确定的重复性和假阳性结果已有报道。文献WO 2005/022148描述了用于体外滴定生物制品中的NCTA的方法，被称为 “TCIA” ( “组织培养感染性分析”)，所述方法将耐受所述NCTA复制的稳定转基因细胞与生物制品相接触，然后将这些细胞培养一代或多代，以便通过NCTA的复制扩增生物制品中存在的NCTA的量。更具体来说，TCIA包括将感染性勻浆(例如羊瘙痒病株127- 的连续稀释物，以每个稀释度5个孔的比例与多孔板上的培养物中的细胞相接触。然后通过在 8到10次传代后检测ft^sc (与感染性不可分离的标志物)来评估阳性孔的数量，并通过 Spearman-Karber方法确定滴度。从相同感染性样品(脑勻浆)获得的滴度的可重复性显示出这种方法的可行性。 但是，在该体外滴定方法中使用的细胞系，即MovS6细胞系，由异源细胞群体构成。这种异质性最终容易损害细胞系的稳定性并因此损害TCIA方法的可重复性。因此，为了改进TCIA方法的长期稳定性，对于获得源自MovS6细胞系的一个或多个稳定的克隆，仍存在极大需求。发明概述本发明现在提供源自于表达朊病毒蛋白PrP的MovS6细胞系并能承受所述PrP的致病型I^psc的复制或增殖的新的细胞克隆，其特征在于至少在直至第6次传代、优选至少在第6次到第100次传代之间的时期内，它的PrPsc生产是稳定的。本发明人事实上已证实，有可能获得对感染强烈响应并显示出PrPsc生产稳定性、即PrPsc生产的水平没有显著变动的克隆。优选，源自于该克隆的感染培养物的细胞裂解物，从感染后6周开始，具有每百万个大于或等于细胞31og1(1TCID50的感染标志物滴度，优选每百万个细胞大于或等于41og1QTCID50、优选每百万个细胞大于或等于61og1QTCID50、优选每百万个细胞大于 71og10TCID50的感染标志物滴度。在本发明的一个具体实施方案中，感染培养物的细胞裂解物从第6周开始，具有大于31ogl JCID50/百万细胞、优选每百万个细胞4. 51og10TCID50至61og1(1TCID50之间的感染标志物滴度。在本发明的一个具体实施方案中，感染培养物的细胞裂解物从第6周开始，具有每百万个细胞大于31og1(1TCID50、优选每百万个细胞4. 51og10TCID50至5. 51og10TCID50之间的感染标志物滴度。在另一个实施方案中，源自于该克隆的感染培养物的细胞裂解物，从感染后6周开始，具有大于或等于21og1(1Western印迹单位/百万细胞(uWB/百万细胞)、优选大于或等于31og1(1uWB/百万细胞的感染标志物滴度。『特别优选，本发明的细胞克隆在下面公开的实验结果中被称为MovS6-4，并于 2008年2月22日保藏于法国微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures des Microorganismes)(CNCM,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,F-75724 Paris Cedex 15，法国)，保藏号为CNCM 1-3922。』本发明还涉及用于在样品中检测和/或滴定非常规性可传播因子(NCTA)的感染性的体外方法，所述因子的标志物是致病构象的蛋白，所述方法包含下列步骤i)将所述样品与上述细胞克隆相接触，ii)培养所述细胞克隆，以便通过所述NCTA的复制来扩增所述样品中存在的NCTA 的量，iii)确定样品中NCTA的存在和/或量，针对一次或多次传代进行培养步骤ii)。有利地，步骤(iii)包含下列步骤a)在步骤ii)结束时将如此扩增的NCTA与PrP和/或NCTA的基质源相接触，b)将反应介质温育，以允许PrP的非致病构象体转变成致病构象体和/或NCTA扩
+曰，c)将在步骤i)或ii)过程中可能形成的聚集体解聚，d)确定样品中NCTA的存在和/或量，步骤(a)到(c)构成了一个操作循环，在步骤(d)之前将其重复至少两次。本发明的另一个主题是用于评估和/或检查获得或处理可能被NCTA污染的生物制品或材料的过程的体外方法，在所述方法中，在所述过程的(A)上游和(B)下游将如上定义的滴定方法应用于所述生物制品或材料，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。本发明还涉及用于评估和/或检查用于生物制品或材料的去污染程序的体外方法，在所述方法中，在所述程序的(A)上游和(B)下游将如上定义的滴定方法应用于所述生物制品或材料，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。本发明的另一个主题是用于评估能够抑制感染性生物制品的感染性的化合物的体外方法，在所述方法中，在(A)存在和(B)不存在所述待评价的化合物的情况下，将如上定义的滴定方法应用于所述感染性生物制品，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。本发明的另一个主题是用于在人类对象或非人类动物对象中诊断可传播性海绵状脑病的体外方法，所述方法包含利用如上定义的方法检测来自所述对象的生物样品中作为致病构象的蛋白质的非常规可传播性因子(NCTA)的存在。本发明的细胞克隆允许长时间稳定地生产合成和标准化的朊病毒类型的感染物质，所述感染物质可立即获得，因为在感染的培养物的胞质溶胶(裂解物)和上清液中检测到它。图例说明图是放射自显影图，显示了 I^rPsc在13个克隆(编号从1至13)的细胞裂解物中的检测，其中MW是分子量指示物。发明详述定义
术语“MovS6细胞系”是指表达PrP朊病毒蛋白的细胞系，源自于对过表达羊PrP 基因的转基因小鼠的背根神经节进行的细胞分离。从中产生MovS6细胞系的过表达羊I^rP 基因的转基因小鼠，得自于过表达羊PrP基因的tg301小鼠(Vilotte等，(2001)，J. Virol. Vol. 75，ρ 5977-5984)与表达 SV40 T 抗原(Tag)的 prp0/0 小鼠(Schwarz 等，(1991)， Bio Cell vol. 73 :7-14)之间的杂交。MovS6细胞系的产生描述在文献Archer等，(2004)， J. Virol.，ρ· 482-490 中。MovS6细胞系不仅在功能性质方面、而且在生物性质方面都是异质细胞群体。事实上，从中分离到该细胞系的背根神经节组合有不同的细胞群体，特别是神经胶质细胞、各种类型的神经元等。在本发明的情形中，表述“源自于MovS6细胞系的细胞克隆”表示由属于MovS6细胞系的单一亲代细胞通过细胞分裂产生、并具有与亲代细胞一致的遗传继承的每个子代细胞。克隆可以利用本技术领域的专业人员已知的技术、例如但不限于有限稀释法或流式细胞术来分离。“PrP朊病毒蛋白”一般是通过磷脂酰糖脂(GPI)锚定在质膜上的唾液酸糖蛋白， 其天然存在于细胞中并参与其正常功能。蛋白的正常形式、即非致病型，通常被称为ft~p。 它参与胚胎中神经系统的发育。在成年人中，它基本在脑和脊髓中(神经元和神经胶质) 表达。它参与细胞分化和黏附过程。它也表现出具有抗氧化保护作用和针对程序化细胞死亡(凋亡)的保护作用。该蛋白在其他蛋白的折叠中也显示出作用。"PrP的致病型ft^sc” 一般是指非致病蛋白的同种型，并代表朊病毒疾病的标志物。这种与朊病毒蛋白的物理化学性质相关的致病型，明显对惯常的消毒和灭菌手段(热、 化学制品、酶等)产生较高抗性。因此，致病型朊病毒蛋白获得自我聚集能力，并因此能够在特别是脑中形成引起神经元死亡的沉积物。负责致病型朊病毒蛋白的复制或增殖的因子看来是致病型朊病毒蛋白本身，因为它能够“指数性增殖或倍增”，使健康型朊病毒蛋白变形成为致病型朊病毒蛋白。因此，PrP的“致病”形式是蛋白的构象与感染的人类或非人类动物中TSE的出现相关的蛋白形式。词组“能够承受所述PrP的致病型I^rPsc的复制或增殖”是指本发明的细胞克隆从非致病型朊病毒蛋白产生致病型朊病毒蛋白的能力，所述非致病型朊病毒蛋白在NCTA存在下转变成致病型蛋白。产生的致病型的朊病毒蛋白在胞质溶胶(裂解物)或培养上清液中被检测到。可以在细胞裂解物中回收该胞质溶胶中的全部或部分致病型。"NCTA感染标志物滴度”由样品中允许在50%的接种分析中发生感染的感染剂量决定。感染剂量通过感染标志物例如I^rP的滴度表现。感染标志物滴度可以通过文献WO 04/02179中描述的滴定方法来测定。感染标志物滴度也可以通过本技术领域的专业人员熟知的方法来测定。例如，将待滴定材料的连续稀释物以每组动物一个材料稀释度的比例脑内注射。根据每组动物中疾病的潜伏时间和患病动物的数量，可以利用本技术领域的专业人员已知的统计学方法，例如并优选Karber方法或Spearman-Karber方法，从中推导出感染滴度。词组“感染标志物滴度的稳定性”是指感染因子(PrPsc)的生产力不随时间显著降低，即不能测量到生产力的明显丧失。明显丧失是感染因子生产力的降低大于或等于llog10uWB/ml。“传代”一般是指将培养皿的全部或部分细胞在另一个含有新培养基的培养皿中传代培养。每次传代能够检查细胞群体的数量并为所述群体提供适量基质。在一个具体实施方案中，本发明的细胞克隆的特征在于对于非常规可传播性因子 (NCTA)的感染标志物来说，其滴度至少直至第6次传代、优选在达到至少第6到第100次传代之间的时期内是稳定的。优选，对于NCTA的感染标志物来说，本发明的细胞克隆的滴度至少在直至第7次传代、更优选至少直至第8次传代、更优选至少直至第9次传代、更优选至少直至第10次传代、更优选至少直至第11次传代、更优选至少直至第12次传代、更优选至少直至第13次传代、更优选至少直至第14次传代、更优选至少直至第22次传代、更优选至少直至第23次传代、更优选至少直至第45次传代、更优选至少直至第46次传代、更优选至少直至第47次传代、更优选至少直至第48次传代、更优选至少直至第49次传代、以及更优选至少直至第50次传代都是稳定的。术语“TCID50”是指引起50%的被测接种发生感染的感染剂量。这些剂量优选利用TCIA方法测量。术语“uWB” (Western印迹单位)是指可以通过Western印迹法检测的PrPsc的
So一般来说，在Wfestern印迹法与TCIA滴定方法之间存在灵敏度的差异。由于这种差异，大于或等于21og1(1Western印迹单位/百万细胞(uWB/百万细胞)、优选大于或等于31og1(|UWB/百万细胞的感染标志物滴度，等价于大于或等于3. 51ogl0、优选大于或等于 51og10TCID50/ml 的感染滴度。在本发明的情形中，术语“NCTA”表示任何非常规性可传播因子，例如在人类中造成家族性或散发性CJD、造成库鲁病或变异CJD、或在动物中造成天然TSE例如羊瘙痒病、牛或猫海绵状脑病、鹿的慢性消耗性疾病或貂的海绵状脑病的非常规性可传播因子，或最后是在实验上适用于实验室动物的TSE毒株。在本发明的情形中，NCTA也用术语“感染因子” 称呼。术语“样品”是指可能被NCTA污染的任何材料来源。这样的材料来源可以是例如液体、食品、饮料、化妆品或源自于遗传工程的制品、能够抑制NCTA的感染性的分子，该名单没有限制。优选它是生物样品，例如生物流体或组织或组织提取物。这样的组织可以是脑组织、脊柱组织或扁桃体组织，该名单没有限制。样品也可以是源自于人类或动物来源的组合物例如生长激素，或细胞提取物例如脑垂体提取物。这样的组合物事实上能够被NCTA 污染。在生物流体的情况下，生物流体可以是血液、淋巴、尿液或乳汁，该名单没有限制。优选，样品是血液制品或衍生物，例如血浆衍生物或血浆蛋白浓缩物。本发明的细胞克隆可以有利地用在检测和/或滴定样品中其标志物是致病构型蛋白的非常规性可传播因子(NCTA)的感染性的体外方法中。将细胞克隆于测试样品相接触将本发明的细胞克隆与可能感染有NCTA的测试样品进行接触，或与作为参比材料的含有NCTA的感染性材料、例如来自感染有NCTA例如羊朊病毒的动物的脑的提取物进行接触。所述进行接触按照本技术领域的专业人员已知的方法来实施(参见 W0/2005/022148 或例如 Archer 等，Journal of Virology, Jan. 2004，p. 482-490)。
然后将细胞克隆培养一次或多次传代，以允许NCTA复制或增殖。有利地，可以将细胞克隆与可能感染NCTA的样品在生物可接受水性溶液中的至少一个稀释物、特别是几种稀释物、最特别是连续或顺序的稀释物进行接触。这些稀释物能够导出被测试样品中感染性的定量。可以将几个克隆平行样与同样的生物制品稀释物相接触，以便给出统计学分辨率更精细的结果。细胞克隆培养(步骤ii)按照本技术领域的专业人员已知的任何技术培养可能被生物制品感染的细胞克隆的步骤，需要NCTA的复制，并因此需要扩增最初不足以进行检测的NCTA的量。在一个示例性实施方案中，执行培养细胞克隆的步骤ii)是用于通过NCTA的复制扩增所述生物样品中存在的NCTA的量，该步骤在补充有谷氨酰胺和胎牛血清(终浓度 5%)的DMEM(Dulbecco修改的Eagle培养基)+Ham-F12培养基(Life Technologies,Cergy Pontoise，法国M4 1)中进行。将细胞在37°C和5% CO2下温育。每周进行一次细胞传代(使用1比10的分传比，即培养物中只留下10份细胞中的1份)。如果生物样品含有致病型的ft~P，从细胞克隆的培养得到的产物将含有致病型 ft~P，其量大于生物样品中最初存在的量。致病形式的PrP和NCTA在感染细胞中积累，然后分泌到培养基中或暴露在细胞表面上。培养步骤ii)可以执行一次或多次传代，例如2至10次传代、优选为4至10次传代。确定阮病毒或NCTA的存在和/或量(步骤iii)方法可以直接包含确定朊病毒或NCTA的存在和/或量的步骤(步骤iii)，或与接触PrP和/或NCTA的基质源相偶联。与PrP和/或NCTA的基质源相接触(步骤a)在本发明方法的步骤ii)后，可以将从细胞培养产生的产物与步骤ii)过程中扩增的PrP和/或NCTA的非致病型构象体的基质源进行接触。该基质源可以提供成例如动物来源的制品例如健康的脑勻浆或源自于体外培养物的材料的形式。该材料可以例如来自于细胞，如MovS或N2A (Weissmann等，Q003)，PNAS vol. 100 no. 20ρ· 1666-11671)、例如Rov，或者酵母、真菌或细菌，该名单没有限制。这种源自于体外培养物的材料可以在各种细胞区室中表达，所述细胞区室例如细胞外区室(例如上清液、外来体，该名单没有限制)和/或膜和/或胞质溶胶区室(例如细胞裂解物)。该步骤的功能是允许体外扩增在步骤ii)过程中收获的PrPsc和/或NCTA，并伴有非致病型的(包含在基质中)转变成致病型，非致病型的自发转变在理论上是不可能的。因此致病型的I^rP引发了非致病型转化成致病型。在转化反应结束时，没有通过检测系统检测到未转化的非致病形式，正如将在下文中解释的。反应介质的温育和/或NCTA的扩增(步骤b)在一个优选实施方案中，在步骤(a)后，将步骤(ii)的细胞培养产物与PrP和/或 NCTA的基质源温育一段时间，所述时间足以允许至少一部分非致病型的蛋白转化成致病型的蛋白，并允许NCTA扩增。优选，每个温育步骤进行10秒至4小时之间、优选20分钟至1
9小时之间、特别优选为30分钟的一段时间。扩增介质有利地由补充有非致病型PrP的基质的缓冲液(lx PBS, 150mM NaCl, 1% Triton)(例如其体积比待扩增样品的体积大10倍)构成。聚集体分离已发现，转变成致病型的蛋白(PrPse型)能够彼此并与其他致病型的粒子(PrPse) 聚集，阻止其他非致病型的蛋白转变成致病型。这是一个缺点，因为方法因此可能因反应介质中存在的“转化灶”数量低所减缓。因此，本发明方法的步骤C)由在前述步骤过程中可能形成的聚集体解聚构成，以便释放出致病型PrP粒子，使其能够转化其他非致病型蛋白。许多方法可用于在本发明方法的步骤C)过程中将聚集体解聚。例如，可以提到的是用溶剂(例如十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、乙腈、胍、尿素、三氟乙醇、稀三氟乙酸、稀甲酸，该名单没有限制)处理，改变溶液的物理化学性质例如PH、温度、离子强度或介电常数， 以及物理方法例如超声、激光辐照、冷冻/融化、压热温育、高压、温和勻浆或可供选择的其他辐照源，该名单没有限制。优选使用超声。超声是本技术领域的专业人员已知的方法，并且由于能够增加聚集体的溶解性而常用于纯化的方法中。解聚进行一段足够的时间，以允许步骤iii)中的接触和温育/扩增过程中形成的至少一部分聚集体解聚。可能不是所有聚集体都将在一次解聚步骤的执行过程中被解聚。 在这种情况下，致病型蛋白的浓度随着解聚步骤的进程而增加。解聚步骤的持续时间可以由本技术领域的专业人员容易地确定，并且它可以取决于所选的解聚方法。优选，解聚步骤的持续时间在1秒至60分钟之间，更优选在5秒至30 分钟之间，更具体为5秒至30秒之间。有利地，将步骤a)至c)重复至少两次、优选5到100次之间、优选20至60次之间。步骤iii)至ν)的这种循环被重复2至100次，构成了一个扩增循环系列。系列也可以重复几次。在这种情况下，新的系列将从一定数量的前面系列而不是最初的NCTA样品开始。蛋白质检测检测致病型PrP蛋白的步骤d)可以通过本技术领域的专业人员已知的任何方法来进行。PrPsc的特异性检测可以利用第一步分离和ft^sc两种同种型来进行。这种分离在ft^sc的生物化学性质能够使其与非致病型蛋白区分开的基础上进行，特别是ft^sc 对基于蛋白酶的处理具有抗性并且即使在去污剂存在下溶解性也较低或不溶这个事实。因此，扩增后的第一步优选是从样品中分离PrPc (非致病、可溶的正常形式的，其可以例如通过蛋白酶处理例如蛋白酶K处理、或通过离心来进行，以便将可溶形式(PrPc)与不可溶形式(ft^sc)分离开。在一个具体实施方案中，在Western印迹之前是用蛋白酶K(PK)消化的步骤，因为它主要引起I^rPc消化，很少或不引起ft^sc消化。事实上，与相比，PrPsc的性质是对I3K更有抗性。因此随后的检测步骤不再检测到非致病型的蛋白，因为所述形式已被蛋白酶消化。检测步骤可以使用下述方法来进行免疫细胞化学(例如通过细胞标记或Facscan)或免疫化学(例如^festern印迹或ELISA分析)、SDS-PAGE步骤后的免疫印迹法、放射活性分析、荧光分析、电子显微术和用于检测聚集体的比浊测试，以及结构测试包括NMR(核磁共振)、圆二色性、拉曼(Raman)光谱、UV吸收、识别致病型的蛋白的单克隆抗体，该名单没有限制。也可以利用特异性识别致病型并且不识别非致病型蛋白的抗体来检测致病型的蛋白。这种抗体可以自身被标记，以便更容易检测。这样的抗体可以是例如15B3抗体 (Korth等，1997，Nature 1997 Nov6, 390 (6655) :74-7)。这类抗体的使用涉及通过流式细胞术检测活的感染细胞表面上存在的朊病毒蛋白。NCTA 滴定致病型的检测可以与样品中存在的PrPsc的量的测定相结合。滴定可以利用本技术领域的专业人员已知的任何滴定方法来进行。具体来说，它可以按照在文献W02005022148和W02006117483 (特别是参比例A和B)中描述的方法的模型来进行。各种稀释度和各个平行样的Western印迹的所有结果，可以利用本技术领域的专业人员已知的能够建立感染滴度的统计学方法来分析，例如Spearman-Karber方法 (Schmidt N.J.，Emmous R. W.，《病毒、立克次氏体和衣原体感染的诊断程序》(Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection)，1989，第 6 片反)。在本发明的一个实施方案中，用于计算滴度的方法是Spearman-Karber方法。该方法假定测试样品的稀释度符合几何级数，即连续稀释度之间比例恒定，并且每种稀释度以恒定体积(一般为0. 150ml)接种在至少5个孔中。最常用的稀释倍数是十进制倍数。为了可以采用Spearman-Karber公式，必需使用恒定数量的接种有每种稀释度的孔、恒定稀释倍数和一定范围的稀释度，所述稀释度范围应该足够宽，以在其一侧涵盖 100 %的孔将给出阳性反应的稀释度，在其另一侧涵盖100 %的孔将给出阴性反应的稀释度。如果不能满足这些条件中的一个或多个，有时假定对于恒定的稀释倍数来说，所执行的最后稀释度的下一个更高或更低稀释度将给出所期望的结果。这种数据的“虚构”不是基于任何理论基础，但是如果足够小心地应用，是没有危险的。但是，优选使用更适合的稀释度范围重复滴定，在数据中存在严重空缺的情况下，这是必需的。根据 Spearman-Karber 公式Log1。中值剂量=(^-(d^+dS^/ni)其中X0 =所有测试接种物为阳性的最低稀释度的倒数值的log1(l。d =稀释倍数的Iogltl，也称为“稀释级”(即稀释度对数间距之间的差值)。n,=在每个稀释度使用的测试接种物数。r, = (Iii中)阳性测试接种物数。S(^ni) =S(P)=从给出100%阳性结果的最低稀释度开始的阳性测试的比例的总禾口。求和在\稀释度处开始。估计的标准偏差使用下列公式计算
Log 标准偏差=d* V (E(p*(l-p)/(ni_l)))其中ρ = T1Zn1 =每个稀释度下阳性测试(即表现出有反应的接种物的孔)的比例。本发明的方法能够在41og、即10，000个体外感染单位的范围内定量NCTA相关的感染性。这能够例如满足用于验证获得生物制品的程序在消除NCTA方面的有效性的标准。用于检测或滴定NCTA相关感染性的方法的应用本发明还涉及将本发明的滴定方法应用在评估和/或检查用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品的过程的体外方法中。这种评估和/或检查方法的特征在于在所述过程的上游和下游，将上述本发明的滴定方法应用于生物制品，并对获得的两个滴定值进行比较。通过两个测量值之间的比较，测定了 NCTA消除的程度或NCTA降低系数。具体来说，本发明的滴定方法有能力容易地应用在用于获得或纯化生物制品、特别是血液制品例如血浆衍生物的任何类型的过程中，所述过程使用例如层析或纳滤、特别是文献EP 0 3 59 593和W002/092632中描述的层析法。因此，借助于使用促进NCTA复制的特定转基因细胞系并将所述细胞系与含有测试NCTA的感染性或潜在感染性材料相接触的滴定方法，本发明方法的执行能够评估和/或检查用于获得或处理或甚至纯化任何可能被NCTA污染的生物制品的过程(或一部分过程) 在消除该NCTA方面的有效性。在打算评估针对NCTA的有效性的过程(或一部分过程)的上游和下游，测定NCTA的量。通过比较两个测定值，确定致病因子的消除程度。因此，本发明方法的执行可以在用于获得生物制品的过程期间或在获得生物制品后消除NCTA的处理的情形下进行。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用在用于评估和/或检查材料的去污染程序的体外方法中。在这种情况下，利用本发明的滴定方法来测定含有NCTA的生物制品的 NCTA滴度。然后将该感染的生物制品与去污染材料相接触，然后将去污染程序应用于这种材料。最后，再次测定已经历过去污染程序的生物制品的滴度。将在去污染程序的上游和下游执行的两个滴度测定值进行比较，以评估去污染程序的有效性。材料可以是例如纯化用材料，特别是层析柱，或者是使用氢氧化钠消毒层析柱。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用在用于选择能够降低感染性材料的滴度的化合物的程序和/或评估所述化合物的方法中。在这种情况下，利用本发明的滴定方法来测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后将该感染的生物制品与测试化合物相接触， 然后再次测定已经历过去污染程序的生物制品的滴度。将在样品与测试化合物进行接触的上游和下游执行的两个滴度测定值进行比较。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用在用于选择能够调节NCTA的感染性的化合物的程序和/或评估所述化合物的方法中。在这种情况下，在存在、然后在不存在待评估化合物的情况下，利用本发明的滴定方法来测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。根据化合物的作用是否阻止感染周期的启动或阻断已启动的感染周期，来确定与化合物相接触的方式。在任何情况下，测定使用或不使用测试产品处理的生物制品的滴度。将执行的两个滴度测量值进行比较，以评估化合物对NCTA感染性的调节活性。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用在用于鉴定能够调节NCTA的非致病型转化成致病型、例如PrP转化成PrPse的化合物的方法中。在这种情况下，利用本发明的滴定方法来测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后将该感染的生物制品与测试化合物相接触，然后应用本发明的滴定方法以便再次测定生物制品的滴度。将在与化合物进行接触的上游和下游执行的两个滴度测量值进行比较，以便评估测试化合物的有效性。由细胞克隆产生的感染性和标准化的朊病毒类型的材料由本发明的细胞克隆产生的细胞裂解物或培养上清液，可以通过本技术领域的专业人员已知的方法标准化成每剂的感染单位数。可以制备例如感染细胞裂解物的储用物， 使其包含每毫升31og1(lTCID5(l。然后标准化的储用物的可利用性允许对不同分析结果进行严格比较。此外，可以通过冷冻、干燥、冷冻干燥或喷雾干燥使其变得稳定，任选在存在本技术领域的专业人员已知的、并根据所用的稳定化方式打算用于避免感染滴度损失的物质的存在下进行。有利地，这种细胞裂解物或培养上清液可以作为感染接种物，用在评估和/或检查用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品的过程的方法中，特别是纯化血浆衍生物的方法、更具体为层析或纳滤。有利地，这种细胞裂解物或培养上清液可以作为感染接种物，用在评估和/或检查用于对可能被NCTA污染的材料去污染的程序的方法中。有利地，这种细胞裂解物或培养上清液可以作为感染接种物，用在评估抑制NCTA 的感染性的化合物的方法中。有利地，感染性材料(即从本发明的细胞克隆制备的接种物)能够免除使用被绵羊瘙痒并或牛海绵状脑病感染的羊脑或牛脑的收集物。感染性材料可以作为感染性接种物，用在评估和/或检查材料的去污染程序的体外方法中。材料可以是例如纯化用材料，特别是层析柱。去污染步骤可以是例如使用氢氧化钠消毒层析柱。本发明还涉及将感染性材料作为感染性接种物在评估调节NCTA感染性的化合物的方法中的应用。在这种情况下，在存在或不存在能够调节NCTA这种感染性的化合物的情况下，根据本发明测试对NCTA感染性的调节能力。本发明还涉及感染性材料作为感染性接种物在评估和/或检查用于感染性材料的污染的程序、特别是P3类型的程序和设备的方法中的应用。在下面的附加描述的帮助下将会更清楚地理解本发明的方法，这些附加描述不对本发明的范围构成限制。
实施例材料和方法1°细胞和感染性材料:选择MovS6细胞(Archer F.等，2004)作为耐受NCTA复制的细胞，并将适于Tg301 转基因小鼠的127-S瘙痒病株用作天然感染源(Vilotte JL等，2001)。细胞培养在补充有谷氨酰胺(终浓度2mM)和胎牛血清(终浓度5% )的DMEM/Ham F_12(3 1)培养基中。初始感染源由200mg/ml的来自感染小鼠的脑勻浆物构成(批次LN_3326，滴度为6. 171og10uffB/ml)。2° 培养:对MovS6细胞进行培养，以便在温育15天后构建2个初级库(编号LC_19和 LC-21)。将LC-19的等分试样融化并进行3次传代培养，以便构建3个次级库，编号为 LC-46、LC-47和LC-48。将LC-46的等分试样融化并进行2次传代培养，以便构建编号为 LC-59的三级库。3°参比样品与2批MovS6细胞的体外滴定的比较将批次LC-46和LC-59细胞的等分试样融化，并平行地维持2次传代。然后使用每个这些批次的细胞，以每个孔100，000个细胞的比例平行地接种M孔格式Ocm2/孔)的滴定板。在温育M小时后，使用培养基并按照连续的10倍稀释级(从KT1至10_8)制备 LN-3326小鼠脑勻浆的连续稀释物。每种接种物的稀释度感染每个批次细胞的5个孔。将细胞与150 μ 1各种稀释度的接种物接触M小时，然后加入Iml新培养基。将细胞在培养物中继续维持72小时，直到进行第一次传代，在这时将所有细胞重新接种在IOcm2 的孔中(6孔板格式)。在继续进行细胞培养的过程中，每周一次更换培养基，并将细胞以1比10的比率传代培养。将没有重新接种的细胞以干燥沉淀的形式储存在_80°C下。这些在每次传代时储存的细胞沉淀可用于研究由细胞产生的I^rPs。产生的I^rPsc的检测直接通过^iestern印迹法进行。4.在细胞中检测PrPsc 将细胞沉淀样品融化并吸取到60 μ 1 PBS中。使用超声浴(功率15W)，通过15秒超声将细胞裂解。取出20μ 1超声过的细胞裂解物以便用蛋白酶K处理。将消化产物变性， 然后在变性条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。将迁移到凝胶中的蛋白通过电转印转移到PVDF膜上。通过与6Η4抗体(Prionics)然后与碱性磷酸酶标记的第二抗体(山羊“抗小鼠抗体”抗体)温育来检测膜上存在的ft^sc。标记的膜通过化学发光来显示。如果在放射自显影图上可以看见具有三种糖基化的I^rPsc形式的电泳分布图，样品被认为是阳性的。考虑到样品在Western印迹法所需的各种试剂中的稀释度，凝胶的道中实际装载的样品体积是4. 35 μ 1。对于通过Wfestern印迹法进行的每次分析来说，阴性对照(未感染的MovS6细胞) 与样品平行地进行处理。在每次细胞传代时，测试所有的培养板孔。当在两次连续的传代过程中，用给定稀释度的接种物接种的细胞培养物的所有平行样都被发现是ft^sc阳性时， 在随后的传代过程中不再对这些培养物进行测试。5°体外滴定的可重复性为了评估体外滴定系统的可重复性，对于每次滴定使用LC-46细胞批次的新的等分试样重复另外两次LN-33^参比样品的滴定。滴定如上所述进行。6°感染的MovS6细胞(批次LC-46)生产PrPsc的稳定性为了评估感染的MovS6细胞生产ft^sc的稳定性，将5X IO5个在融化后经历过4 次传代的细胞(批次LC-46)接种在25cm2培养瓶中的IOml培养基中，并以2. 21og10uffB的 PrPsc载量接种，即感染复数(MOI)为1 3100。将感染的培养物维持23次传代，每周一次按照1 10的分传比传代一次。在每次传代时，将来自没有重新接种的细胞的3X106个细胞的等分试样，以干燥沉淀的形式储存在-80°C下，以便能够在分析结束时通过Western 印迹对各次传代收获的细胞裂解物中的PrPsc进行滴定。如4°节中所述通过等分试样的有限稀释法测定ft^sc，并通过Western印迹法进行分析。不再显示出任何ft^sc特异性信号的第一个样品稀释度，被当做含有lfffestern 印迹单位。然后将实际装载到电泳凝胶上的等分试样体积考虑在内，将样品的滴度计算为有限稀释度的倒数。因此，放置在60μ1 PBS中的3Χ IO6个细胞对应于3Χ IO6个细胞 /0. 06ml，即50X IO6个细胞/ml。在第4节描述的flfestern印迹(WB)分析下，在稀释范围中的“未稀释”样品对应的道上观察到的信号，来自于加入到PBS中并且未稀释的4. 35μ 1细胞沉淀悬液，即0. 22 X IO6个细胞。例如，如果不再检测到信号的第一个稀释度对应于1/81 稀释度，则细胞沉淀中的 PrPsc 滴度为 81uWB/4. !35μ 1，即 81 X 1000/4. 35 = 18620uffB/ml, 即表示成十进制对数为4. 271og1(1uWB/ml，或81/0. 22uffB/百万细胞，即368uWB/百万细胞， 即表示成十进制对数为2. 571og10uffB/百万细胞。结果使用每个批次的MovS6细胞(LC-46和LC-59)滴定参比脑勻浆(LN_33^批次) 的结果概括在表1和2中。表1.使用LC-59细胞批次滴定参比的感染小鼠脑勻浆(LN_33^)
权利要求
1.源自于MovS6细胞系的细胞克隆，所述细胞克隆表达朊病毒蛋白PrP并能够耐受所述PrP的致病型ft~PSC的复制或增殖，其特征在于对非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第6次传代是稳定的。
2.权利要求1的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少在第6到第100次传代之间的时期内是稳定的。
3.权利要求1或2的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第7次传代是稳定的。
4.权利要求1到3任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第8次传代是稳定的。
5.权利要求1到4任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第10次传代是稳定的。
6.权利要求1到5任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第14次传代是稳定的。
7.权利要求1到6任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第22次传代是稳定的。
8.权利要求1到7任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第23次传代是稳定的。
9.权利要求1到8任一项的细胞克隆，其特征在于对于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物来说，所述细胞克隆的滴度至少直至第47次传代是稳定的。
10.权利要求1到9任一项的细胞克隆，其特征在于所述细胞克隆的细胞裂解物或培养上清液，从感染后6周，具有每百万个细胞大于或等于31og1(lTCID50的感染标志物滴度，优选每百万个细胞大于或等于41og1(1TCID50、优选每百万个细胞大于或等于61og1QTCID50、优选每百万个细胞大于71og1(1TCID50的感染标志物滴度。
11.前述权利要求任一项的细胞克隆，其于2008年2月22日保藏于法国微生物培养 (Collection Nationale de Cultures des Microorganismes), 1 -^ CNCM1-3922。
12.—种在样品中检测和/或滴定非常规性可传播因子(NCTA)的感染性的体外方法， 所述非常规性可传播因子(NCTA)的标记物是致病型构象的蛋白，所述方法包含下列步骤i)将所述样品与权利要求1到11之一中描述的细胞克隆相接触，ii)培养所述细胞克隆以便通过所述NCTA的复制来扩增所述样品中存在的NCTA的量，iii)确定样品中致病型蛋白和/或NCTA的存在和/或量，针对一次或多次传代进行培养步骤ii)。
13.权利要求12的方法，其中步骤(iii)包含下列步骤a)将步骤ii)结束时所扩增的NCTA与致病型蛋白和/或NCTA的基质源相接触，b)将反应介质温育，以允许非致病型构象体转变成致病型构象体和/或NCTA扩增，c)将在步骤i)或ii)期间可能形成的聚集体解聚，d)确定样品中致病型蛋白和/或NCTA的存在和/或量，在步骤(d)之前，重复步骤(a)到(c)构成的操作循环至少两次。
14.一种评估和/或检查用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品或材料的过程的体外方法，在所述方法中，在所述过程的(A)上游和(B)下游，将权利要求12和13任一项的滴定方法应用于所述生物制品或材料，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。
15.一种评估和/或检查用于生物制品或材料的去污染程序的体外方法，在所述方法中，在所述程序的(A)上游和(B)下游，将权利要求12或13任一项的滴定方法应用于所述生物制品或材料，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。
16.一种评估能够调节感染性生物制品的感染性的化合物的体外方法，在所述方法中， 在(A)存在和(B)不存在所述待评估化合物的情况下，将权利要求12和13任一项的滴定方法应用于所述感染性生物制品，并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。
17.—种在人类个体或非人类动物个体中诊断可传播性海绵状脑病的体外方法，所述方法包含利用权利要求12和13任一项中定义的方法，在来自所述个体的生物样品中检测作为致病型构象的蛋白的非常规性可传播因子(NCTA)的存在。
全文摘要
本发明涉及源自于MovS6细胞系的细胞克隆，所述细胞克隆表达朊病毒蛋白PrP并能够耐受所述PrP的致病型PrPsc的复制或增殖，其特征在于所述细胞克隆关于非常规性可传播因子(NCTA)的感染标志物的滴度在至少直至第6次传代都是稳定的。
文档编号C07K14/47GK102203615SQ200980134858
公开日2011年9月28日 申请日期2009年9月4日 优先权日2008年9月5日
发明者布鲁诺·尤 申请人:Lfb生物科技公司, 法国农业科学研究院