本发明涉及生物，具体来说，涉及一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法。
背景技术：
1、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(ph+-all)是恶性程度最高的白血病类型之一，虽有伊马替尼、达沙替尼等针对其直接致病基因bcr-abl1的靶向药物，但控制效果远逊于慢性粒细胞性白血病。靶向药物合用泛素-蛋白酶体抑制剂在临床试验中对ph+-all特别是难治病例展示出一定疗效，但一来硼替佐米为代表的泛素蛋白酶体抑制剂毒性较大，二来泛素蛋白酶体抑制剂的耐药问题也不容乐观。泛素蛋白酶体抑制剂抗肿瘤的关键机制之一是抑制iκb泛素化降解从而抑制nf-κb的核转位。鉴于此，探索新的不依赖泛素蛋白酶体的抗nf-κb新手段联合靶向药有望为ph+-all的治疗带来全新策略。
2、nlec是由肠致病性和肠出血性大肠杆菌(epec和ehec)通过一种称为iii型分泌系统(t3ss)的针状蛋白复合物注射到受感染宿主细胞中的毒力因子之一。nlec特异性切割nf-κb在p65-p50异二聚体复合体中的p65亚基，阻断nf-κb信号通路，从而抑制宿主的炎症反应。nlec蛋白具有一突出优点是不需要特殊处理即可穿越人类细胞的细胞膜到达胞质，从而规避了普通蛋白类药物难以跨膜递送的难题。研究发现添加ha标签的nlec重组蛋白保留了穿膜性和对nf-κb p65的降解能力，且能显著增强伊马替尼对ph+-all细胞株sup-b15细胞的杀伤能力，但其稳定性有待进一步提高。提高nlec蛋白稳定性增强抗nf-κb能力联合靶向药有望为ph+-all的治疗带来全新策略。
3、针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
1、针对相关技术中的问题，本发明提出一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
2、为此，本发明采用的具体技术方案如下：
3、一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，包括：
4、利用位点指引的突变形成技术构建nlec突变体，包装病毒感染细胞，并与野生型nlec比较突变掉赖氨酸后对蛋白稳定性的提升作用；
5、其中，所述nlec突变体为将nlec上的k102位点、k109位点及k123位点中的任一个赖氨酸突变为精氨酸的突变体。
6、进一步的，所述野生型nlec的体外构建包括以下步骤：
7、通过ecori/bamhi双酶切化学合成ha-nlec片段，酶切过夜；
8、胶回收酶切后ha-nlec片段并纯化；
9、t4连接酶连接ecori/bamhi酶切纯化后的plvx-tetone-puro载体，室温放置；
10、取转入stabl3感受态细胞冰上放置、热激、冰上冷却；
11、加入无amp+lb培养基摇床培养，涂板，在倒置培养；
12、挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，ecori/xhoi酶切验证，测序；
13、选取酶切及测序结果均正确的质粒，试剂盒提取转染级别的质粒；
14、包装慢病毒，感染sup-b15及z33细胞。
15、进一步的，酶切过夜的温度为37℃。室温放置时间为30min-60min。转入stabl3感受态细胞的取用量为10ul，冰上放置时间为30min-60min，冰上冷却时间为2-3min。热激温度为42℃，热激时间为90s。无amp+lb培养基的添加量为900ul，摇床培养温度为37℃，摇床培养时间为20-40min。倒置培养温度为37℃，倒置培养时间为12-16h。
16、进一步的，t4连接酶连接ecori/bamhi酶切纯化后的plvx-tetone-puro载体的体系为：
17、plvx-tetone-puro-ecori/xhoi(50ng)：4ul；
18、ha-nlec ecori/xhoi(100ng)：6ul；
19、10xt4 dna ligase buffer：2ul；
20、t4 dna ligase：1ul；
21、水：7ul。
22、进一步的，所述nlec突变体应用于制备治疗白血病的药物以及联合tki突破耐药。
23、本发明的有益效果为：通过对ha-nlec的序列进行分析，使用位点指引的突变形成技术将nlec上的k102、k109和k123中的任意一个赖氨酸突变为精氨酸的突变体，并分别包装病毒感染细胞，多西环素诱导表达结果发现与野生型nlec比较，突变掉赖氨酸后对蛋白稳定性有明显的提升作用。
1.一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，该方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，所述野生型nlec的体外构建包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，酶切过夜的温度为37℃。
4.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，t4连接酶连接ecori/bamhi酶切纯化后的plvx-tetone-puro载体的体系为：
5.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，室温放置时间为30min-60min。
6.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，转入stabl3感受态细胞的取用量为10ul，冰上放置时间为30min-60min，冰上冷却时间为2-3min。
7.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，热激温度为42℃，热激时间为90s。
8.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，无amp+lb培养基的添加量为900ul，摇床培养温度为37℃，摇床培养时间为20-40min。
9.根据权利要求2所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，倒置培养温度为37℃，倒置培养时间为12-16h。
10.根据权利要求1所述的一种利用位点指引的突变形成技术增强nlec蛋白稳定性的优化方法，其特征在于，所述nlec突变体应用于制备治疗白血病的药物以及联合tki突破耐药。