本发明属于生物检测，尤其涉及一种基于dna条形码的野外啮齿类动物血吸虫感染检测方法。
背景技术：
1、基于dna条形码的野外啮齿类动物血吸虫感染检测是一种先进的生物检测技术，该技术结合了dna条形码技术与血吸虫感染检测的特点，为野外啮齿类动物的血吸虫感染监测提供了有力工具。首先，dna条形码是一种特定的dna片段序列，具有足够的可变性以确定物种出身。这种技术利用生物体dna中一段保守的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的片段，对物种进行快速准确的鉴定。对于野外啮齿类动物，dna条形码技术帮助研究人员快速识别并区分不同的物种，为后续的血吸虫感染检测提供基础数据。
2、血吸虫病是由血吸虫寄生于人或哺乳动物体内引起的寄生虫病，具有传染性和地方性。在野外环境中，啮齿类动物常常是血吸虫的重要宿主。因此，对野外啮齿类动物进行血吸虫感染检测，对于了解血吸虫病的传播规律、预防和控制疫情具有重要意义。在啮齿类动物血吸虫感染检测时，涉及的血吸虫种类主要有日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫，它们都是寄生在脊椎动物血管内的吸虫，能够通过皮肤、黏膜与疫水接触等方式感染啮齿类动物，引起严重的血吸虫病。在检测过程中，需要针对这些血吸虫的种类和特点，采取相应的检测方法和措施，以确保检测的准确性和有效性。此外，虽然中国主要流行的是日本血吸虫，但曼氏血吸虫和埃及血吸虫也可能在某些地区出现，因此在检测时也需要考虑这些潜在的风险。
3、随着生态学研究的深入，对野外动物感染血吸虫的情况进行准确、快速的检测显得尤为重要。dna条形码技术作为一种基于dna序列信息的生物标记方法，具有在物种识别和分类方面的独特优势。然而，对于某些血吸虫种类，由于dna条形码数据库的不完整，以及野外采样过程中样本污染、保存条件不佳等问题，影响了检测的准确性。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于dna条形码的野外啮齿类动物血吸虫感染检测方法，具备提高准确率的优点，解决了现有技术的问题。
2、本发明是这样实现的，一种基于dna条形码的野外啮齿类动物血吸虫感染检测方法，包括以下步骤：
3、步骤s1，样本采集与保存：通过笼捕法采集野外啮齿类动物样本,从野外啮齿类动物样本体内分离出血吸虫样本，并对采集血吸虫样本的器具的无菌处理、血吸虫样本的即时封装和低温保存，以减少样本污染和dna降解的可能性；
4、步骤s2，血吸虫dna提取与pcr扩增：提取样本中的血吸虫dna，利用特异性引物进行pcr扩增，获取目标dna片段；
5、步骤s3，dna条形码测序与比对鉴定：将扩增得到的dna片段进行测序，获得血吸虫的dna条形码，结合现有数据库与文献报道，构建全面的血吸虫dna条形码数据库，并通过生物信息学手段对测序结果进行比对和鉴定；
6、步骤s4，多重pcr验证与质量控制：采用多重pcr、实时荧光定量pcr辅助手段进行验证；对于疑似污染的样本，进行重复检测和质量控制，以确保结果的可靠性；
7、步骤s5，感染情况统计与分析：根据检测结果，对野外啮齿类动物的血吸虫感染情况进行统计和分析，得到检测结果。
8、作为本发明优选的，步骤s1，样本采集与保存包括以下步骤：
9、步骤s1.1，准备采集器具并进行无菌处理：确保所有用于采集样本的器具，使用无菌包装或一次性器具，或在使用前对器具进行严格的消毒处理，以避免引入外部污染；
10、步骤s1.2采集啮齿类动物样本：在野外使用笼捕法采集野外啮齿类动物样本，捕鼠笼间距设置大于50米，笼内放置生葵花籽作为诱饵，每天上午检查是否成功捕获到样本，成功采集到啮齿类动物的捕鼠笼，不能再次用于本次采集工作，根据采集样本的具体类型和要求，按照预定的采集方法和操作规范进行采集，确保采集过程中不引入杂质或污染；
11、步骤s1.3采集血吸虫样本：将采集的啮齿动物样本带回实验室，使用颈椎脱位法进行安乐死处理，解剖样本，观察内脏器官，是否有血吸虫感染导致的可见病变，切开肝门静脉，经腹主动脉灌注生理盐水200毫升，将生理盐水悬浮液在10000 rpm离心1分钟，取沉淀物；
12、步骤s1.4对采集的样本进行即时封装：在采集完成后，立即将样本放入1.5毫升离心管中，并进行密封处理，确保容器的密封性良好，防止样本在保存过程中受到外界环境的污染或dna降解；
13、步骤s1.5对封装好的样本进行低温保存：将封装好的样本放入低温环境中进行保存，通常选择冷藏或冷冻方式，低温保存减缓样本中dna的降解速度，从而保持样本的稳定性和可分析性，同时，对保存环境进行定期监测和维护，确保温度稳定且适宜。
14、作为本发明优选的，步骤s2包括以下步骤：
15、步骤s2.1准备血吸虫样本：选取含有血吸虫的生物样本，确保样本的新鲜度和完整性，以便后续dna提取的有效性；
16、步骤s2.2样本处理与破碎：取样本，加入200微升缓冲液ga和20微升tianampgenomic dna kit no.dp304，在56摄氏度下进行恒温金属浴，直至溶液完全清澈、透明，充分释放样本中的dna，便于后续的提取操作；
17、步骤s2.3提取血吸虫dna：从处理后的血吸虫样本中提取dna，确保提取过程中dna的完整性和纯度；
18、步骤s2.4设计并合成特异性引物：根据目标dna片段的序列信息，设计特异性引物，并委托专业机构进行引物的合成，确保引物的准确性和特异性；
19、步骤s2.5配置pcr反应体系：按照pcr实验要求，准备dna模板、引物、dntps、酶，构建pcr反应体系；
20、步骤s2.6进行pcr扩增：将配置好的pcr反应体系放入pcr仪中，设置合适的扩增条件，启动pcr扩增程序，获取目标dna片段；
21、步骤s2.7验证pcr产物：通过电泳或其他适当的检测方法，验证pcr产物的质量和大小，确保扩增的目标dna片段符合预期。
22、作为本发明优选的，步骤s3，dna条形码测序与比对鉴定，包括以下步骤：
23、步骤s3.1，dna片段测序：将扩增后的dna片段进行纯化，确保片段的质量和纯度，然后，使用高通量测序技术对这些片段进行测序，以获得精确且全面的dna序列信息；
24、步骤s3.2，构建dna条形码数据库：收集并整理现有的血吸虫dna条形码数据，同时结合文献报道中的血吸虫dna序列信息，将这些数据整合到一个数据库中，构建出全面的血吸虫dna条形码数据库；
25、步骤s3.3，测序结果比对：将测序得到的dna条形码与已构建的数据库中的序列进行比对，通过生物信息学软件，自动完成这一比对过程，找出与测序结果相似的dna序列；
26、步骤s3.4，血吸虫种类鉴定：根据比对结果，结合血吸虫dna条形码数据库中的物种信息，对测序的dna片段进行种类鉴定，通过比对相似度和特定序列特征，确定该dna片段所对应的血吸虫种类；
27、步骤s3.5，鉴定结果分析与确认：对鉴定结果进行进一步的生物信息学分析，包括统计分析和聚类分析等，以确认鉴定结果的准确性和可靠性。
28、作为本发明优选的，步骤s3.1，dna片段测序包括以下步骤：
29、步骤s3.1.1纯化dna片段：将扩增后的dna片段进行细致的纯化操作，通过特定的化学方法或物理方法去除杂质和多余物质，确保dna片段的质量和纯度达到测序要求；
30、步骤s3.1.2准备测序样本：经过纯化的dna片段需要进一步处理，包括片段的末端修复、接头连接以便后续测序时能够准确捕捉dna序列信息；
31、步骤s3.1.3高通量测序技术操作：将准备好的测序样本加载到高通量测序仪上，利用测序仪的工作原理对dna片段进行测序，测序过程涉及对dna片段的连续读取和记录，通过捕捉荧光信号或其他信号来获取dna的碱基序列；
32、步骤s3.1.4分析测序数据：测序完成后，获得大量原始测序数据，需要进行质量控制和数据分析，包括去除低质量序列、比对参考基因组、检测变异位点，以获得精确且全面的dna序列信息。
33、作为本发明优选的，步骤s3.2包括以下步骤：
34、步骤s3.2.1收集血吸虫dna条形码数据：通过各大生物数据库、实验室已发表的数据集以及实验成果，广泛搜集血吸虫dna条形码数据，确保数据来源的多样性和可靠性，为后续分析提供充足的素材；
35、步骤s3.2.2整理现有数据：对收集到的血吸虫dna条形码数据进行清洗和格式化处理，去除重复、错误或不完整的数据，确保数据的质量和一致性，为后续的数据整合和分析奠定基础；
36、步骤s3.2.3收集文献报道中的血吸虫dna序列信息：查阅相关文献，从中提取血吸虫dna序列信息，可能包括序列的来源、特征以及与其他物种的对比，有助于丰富和完善dna条形码数据库的内容；
37、步骤s3.2.4整合数据到数据库：将经过整理和提取的血吸虫dna条形码数据整合到一个统一的数据库中，数据库应具备高效的数据存储和检索功能，方便后续的数据查询和分析；
38、步骤s3.2.5构建全面的血吸虫dna条形码数据库：在整合数据的基础上，构建出一个全面、系统的血吸虫dna条形码数据库，所述数据库能够反映血吸虫种群的遗传多样性，为后续的物种鉴定、分类以及生态学研究提供有力的数据支持。
39、作为本发明优选的，步骤s3.3，测序结果比对，包括以下步骤：
40、步骤s3.3.1，数据准备：将测序得到的dna条形码序列进行清洗和格式化，确保序列数据的准确性和一致性，为比对做好数据准备；
41、步骤s3.3.2，选择比对工具：从现有的生物信息学软件中，根据研究需求和数据特点，选择合适的dna序列比对工具；
42、步骤s3.3.3，设定比对参数：根据比对工具的要求和实验目的，设定合适的比对参数，包括比对算法、比对模式、比对阈值；
43、步骤s3.3.4，执行比对操作：将准备好的dna条形码序列输入比对工具，启动比对程序，让工具自动完成与数据库中序列的比对过程；
44、步骤s3.3.5，结果查看与分析：比对完成后，查看比对结果，找出与测序结果相似的dna序列，并对这些相似序列进行进一步的分析和评估。
45、作为本发明优选的，步骤s4，多重pcr验证与质量控制，细化为以下步骤：
46、步骤s4.1.提取目标dna片段：根据实验需求，从样本中提取特定的dna片段，作为多重pcr的模板；
47、步骤s4.2.设计多重pcr引物：针对目标dna片段，设计多对特异性引物，以在单一pcr反应中同时扩增多个目标序列；
48、步骤s4.3.配置多重pcr反应体系：将提取的dna模板、引物、pcr酶、缓冲液等按照一定比例混合，形成多重pcr反应体系；
49、步骤s4.4.进行多重pcr扩增：将配置好的多重pcr反应体系放入pcr仪中，按照设定的温度和时间程序进行扩增，使目标dna片段得到大量复制；
50、步骤s4.5.实时荧光定量pcr辅助验证：利用实时荧光定量pcr技术，对多重pcr产物进行实时监测和定量分析，以验证扩增结果的准确性和可靠性；
51、步骤s4.6.疑似污染样本的识别与处理：在pcr过程中，若发现疑似污染的样本，如非特异性扩增或异常信号，需进行进一步识别和处理；
52、步骤s4.7.重复检测疑似污染样本：对疑似污染的样本进行重复多重pcr检测，以排除偶然因素导致的假阳性或假阴性结果；
53、步骤s4.8.质量控制与结果分析：对多重pcr和实时荧光定量pcr的结果进行综合分析，确保数据的准确性和可靠性，对于不符合质量标准的样本，需进行进一步处理或排除。
54、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
55、本发明通过构建全面的血吸虫dna条形码数据库，能够更准确地识别不同种类的血吸虫，克服了以往检测手段中因数据库不完整而导致的误判问题。同时，对样本采集、处理和检测过程的严格控制，有效减少了样本污染的可能性，提高了检测的准确性。此外，多重pcr和实时荧光定量pcr等辅助手段的引入，进一步增强了检测结果的可靠性，为野外啮齿类动物血吸虫感染的监测和防控提供了有力支持。