本发明涉及一种疫苗制备，具体涉及表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白表达载体及疫苗制备方法。
背景技术：
1、猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒感染引起的一种高度传染性的猪肠道病毒性疾病，以呕吐、严重腹泻和2周以内仔猪的高死亡率为主要特征，在全世界均有报告。猪经口感染tgev强毒后可以在血清中检测到igg和iga抗体，猪肠道和血清中也可检测出tgev iga抗体和抗体分泌细胞，肠外接种tgev则无法检出，此外tgev弱毒株不论是口服或肠外接种均不能检测到iga抗体和抗体分泌细胞。
2、申请号为：cn201710972807.5的发明专利公开了一种egfp标记的、抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重组屎肠球菌疫苗株及其应用。所述的疫苗株以从猪肠道结肠段分离获得的屎肠球菌作为疫苗抗原传递活载体，其中含有egfp标记的组成型表达tgev s蛋白d抗原位点和pedvs蛋白中和表位区ps420蛋白的重组表达载体。由上述重组屎肠球菌疫苗株制备得到的抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的二价口服疫苗可达到一次免疫预防两种疾病的目的，且具有绿色环保、高效安全、益生性好等特点。
3、申请号为：cn201810455189.1的发明专利公开了一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎(tge)s基因重组腺病毒的制备方法，本发明对传统的复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacad5 cmv k-n pa进行改造，使其能够瞬时表达两个独立的基因，然后将猪传染性胃肠炎病毒(tgev)的纤突蛋白的优势抗原a、d位点的dna序列与结核分枝杆菌ag85a基因插入到改造后的穿梭质粒pacad5 cmv k-n pa-ires，获得重组质粒pacad5 cmv k-n pa sad-ires-ag85a，该重组质粒与复制缺陷型腺病毒骨架dna pacad 59.2-100线性化后，共同转染ad-293细胞，通过同源重组包装产生复制缺陷型重组腺病毒rad-sad-ires-ag85a，进一步经纯化、扩增、分装等步骤得到免疫原性增强型猪传染性胃肠炎s基因重组腺病毒。
4、在临床tgev的防控中，tgev威胁的主要猪群是哺乳仔猪，特别是2周龄以内的哺乳仔猪，因此对哺乳仔猪的保护主要依赖于被动乳源性免疫。仔猪通过吸收初乳免疫球蛋白igg获得循环的被动抗体可以保护新生仔猪不受全身性感染，但是确不能保护肠道感染，而乳源性iga抗体在肠道中稳定，可以提供最有效的保护。因此能够诱导产生iga的抗体才能提供最有效的保护，而目前的弱毒疫苗和灭活疫苗均不能诱导动物产生iga抗体，因此开发一种能够诱导免疫动物广谱性黏膜免疫的tgev疫苗对tgev的防控具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种猪传染性胃肠炎重组活载体疫苗及其制备方法，本发明可以通过口服、肌肉注射等多种方式免疫，而通过口服免疫可以诱导免疫动物产生igg和iga抗体，可以为仔猪提供最有效的免疫保护。
2、为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
3、设计一种表达猪传染性胃肠炎病毒s蛋白表达载体，构建步骤具体方法如下：
4、步骤1：以tgv sc2021株s蛋白序列为基础，在n段插入mdamkrglccvlllcgavfvsntpa分泌信号肽序列，在c末端添加组氨酸标签，将原来c末端ciplllfcccstgccgcigclgscchsics序列替换为gsg柔性肽，氨基酸序列如seq id no.1所示；
5、步骤2：按照sus scrofa密码子特点进行序列优化后，优化后的序列如seq idno.2所示；
6、步骤3：合成并定向插入到pdc316-mcmv-egfp载体的ecorⅰ和hindⅲ酶切位点之间，构建好的载体命名为pdc316-tge-s。
7、进一步的，猪传染性胃肠炎重组活疫苗制备方法，制备步骤具体如下：
8、s101：radv-ts株p1代病毒制备；
9、s102：radv ts株p3-p5代病毒制备；
10、s103：制得纯化病毒；
11、按照常规方法传代293a细胞至孔板，置二氧化碳培养箱中培养，取radv ts株 p4、p5代病毒和纯化病毒使用2%血清dmem进行10倍梯度稀释至1012，稀释后接种传代的293a细胞，每个稀释度接种8孔，接种后置二氧化碳培养箱中培养，将培养后的96孔板置于倒置显微镜下观察各稀释度孔是否出现细胞病变，记录各稀释度细胞病变孔数量，根据reed-muench方法计算radv ts株 p4、p5代和纯化病毒的tcid50。
12、进一步的，s101具体步骤如下：
13、按照常规方法传代293a细胞至12孔板，细胞汇合度50%左右时使用转染试剂转染pdc316-tge-s质粒和pbhgloxdele13cre质粒，转染试剂使用6ul，pdc316-ped-s质粒和pbhgloxdele13cre质粒各1ug；
14、转染后将细胞置37℃，5%二氧化碳培养箱中培养。每日观察细胞状态。转染后每日观察，转染后5天观察到特异性病变嗜斑，然后继续培养至细胞病变达48小时，将细胞置-80℃反复冻融三次，12000rpm离心，-80℃保存，计为radv-ts株p1代病毒。
15、进一步的，s102具体步骤如下：
16、按照常规方法传代293a细胞至96孔板中，取-80℃保存的radv ts株p1代病毒使用无血清dmem细胞培养液进行10倍梯度稀释，取101～108稀释度的接种于加有293a细胞悬液的培养孔中，每个孔添加100ul病毒稀释液，每个稀释梯度24孔；加入病毒稀释液后置37℃，5%二氧化碳培养箱中培养每日观察，待最低稀释度出现病变嗜斑后取单嗜斑孔病毒液接种293a进行扩大培养，培养至细胞病变至80%时收获病毒，-80℃反复冻融1次，12000rpm离心5min，取上清分装后-80℃保存，记为radv ts株p3代病毒；
17、取radv ts株p3代病毒按照常规方法接种293a细胞继续培养扩繁至radv ts株p5代病毒，所有收获病毒均置于-80℃保存；
18、按常规方法传代293a细胞至t175细胞瓶，待细胞生长成致密单层之后除去细胞培养液，接种0.5ml radv ts株p3代病毒，37℃细胞培养箱吸附60分钟，然后往接种后的细胞瓶中加入30ml 2%小牛血清的dmem培养液，37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞90%以上细胞出现细胞病变后收获病毒液，12000rpm离心10分钟，取上清加入到100kd超滤离心管中，5000rpm离心至原来体积的1/10后加入0.1m 磷酸盐缓冲液至原体积，5000rpm离心至原体积的1/100，最后按照5：1的比例添加甘油后分装并置于-80℃保存，制得p4代病毒。
19、本发明还公开了一种猪传染性胃肠炎重组活载体疫苗，所述猪传染性胃肠炎重组活载体疫苗通过上述所述的一种猪传染性胃肠炎重组活载体疫苗制备方法制得。
20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21、本发明在实际的使用中通过以tgv sc2021株s蛋白序列为基础，在n段插入mdamkrglccvlllcgavfvsn tpa分泌信号肽序列，在c末端添加组氨酸标签，将原来c末端ciplllfcccstgccgcigclgscchsics序列替换为gsg柔性肽，按照sus scrofa密码子特点进行序列优化后，合成并定向插入到pdc316-mcmv-egfp载体的ecorⅰ和hindⅲ酶切位点之间从而构建了一种新的tgevs蛋白融合蛋白，并构建了一种能够表达所述融合蛋白的重组腺病毒疫苗。该疫苗可以通过口服、肌肉注射等多种方式免疫，而通过口服免疫可以诱导免疫动物产生igg和iga抗体，可以为仔猪提供最有效的免疫保护。