本发明属于生物工程领域，具体涉及一种抗微纳米气泡大肠杆菌的构建及其在高效固碳合成丁二酸中的应用。
背景技术：
1、丁二酸(succinic acid)是重要的c4平台化合物，研究表明，微生物利用还原tca途径厌氧固定1mol的co2理论上可参与合成1mol丁二酸，可作为工业co2废气减排及高值转化的有效手段，具有重要的环境与经济价值。但常压下co2在水中溶解度极低，发酵过程中直接通入的co2气体绝大部分以气泡的形式快速溢出，导致厌氧生物合成丁二酸过程对co2气体利用效率极低。因此厌氧发酵固碳合成丁二酸普遍以碳酸盐或碳酸氢盐作为主要的co2供体，而通入的co2气体仅起到维持厌氧状态的作用，不仅增加了发酵成本，而且大量溢出的co2气体形成了二次温室气体排放，严重削弱了生物法固碳合成丁二酸的环境价值。
2、微纳米气泡(mnbs)是一类直径100nm～50μm的微型气泡。微纳米气泡具有常规气泡所不具备的物理与化学特性，主要表现为：气泡比表面积大，表面有较高的ζ电势，存在的表面斥力，阻碍了小气泡融合成为大气泡溢出；溶于水中气泡体积逐渐缩小，表面压力逐渐增大，使气体溶解速度加快；微纳米气泡在液体中上升速度极慢，可在液体中长时间停留。因此，微纳米气泡有利于促进co2溶解，显著减少co2的逃逸(journal of cleanerproduction，2024，457：142230)。但是由于微纳米气泡收缩时双电层中积累的电荷密度急剧增加，一旦气泡破裂，聚集在双电层界面处的大量离子会立即释放其化学能，形成大量的活性氧和自由基(langmuir:the acs journal of surfaces and colloids，2021，37(16):5005-5011)。zhang等人报道，mnbs破裂产生的自由基会破坏包括dna、rna、蛋白质和脂质等生物大分子，从而影响细胞活力(food reviews international,2023,39(7):4213-4235)。韩振尧通过检测发现co2纳米气泡的崩塌产生的是羟基自由基(纳米气泡稳定性及其产生羟基自由基的机理与应用研究[d].南宁：广西大学，2023)。而当水中co2-mnbs的浓度达到20％时会产生更多的羟基自由基，对海洋中华微杆菌sinomicrobium oceani wh-15的生长具有明显的抑制作用(process biochemistry,2023,126:117-124)。由此可见，增强菌体对微纳米气泡的抗性对于提升细胞利用co2固碳合成丁二酸具有重要的价值。因此，研究如何提高细胞对mnbs产生自由基的耐受性，对于优化生物过程和提高生物转化效率具有重要意义。这些发现不仅有助于我们理解微纳米气泡在生物系统中的作用机制，也为开发新的生物技术提供了潜在的策略。
3、生物被膜是细菌在生物和非生物表面形成的生物聚集体，由胞外多糖、蛋白质和dna等组成，可以帮助细菌增强对外部环境压力的抵抗。生物被膜是细菌在大多数生态系统中普遍存在的生活方式，为细菌的生存提供了有利的保护。curli菌毛在大肠杆菌生物被膜的形成中发挥重要作用，是细胞外基质位于细胞表面的蛋白质聚集体。csga是curli的主要亚基，csga可溶单体蛋白经细菌表达后被分泌到细菌胞外，经过自组装，在菌体表面形成具有β-折叠结构的淀粉样纤维，与大肠杆菌的接触面的初始黏附有关。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对固碳合成的丁二酸生产菌株难以耐受co2微纳米气泡这一缺陷，导致丁二酸厌氧生物合成过程对co2气体利用效率极低、依赖碳酸盐的供给等方面的不足，提供一种抗微纳米气泡的重组大肠杆菌的构建方法并实现其在高效固碳合成丁二酸方面的应用。本发明希望通过构建对co2微纳米气泡具有抗性的丁二酸生产菌株，应用于微生物固碳合成丁二酸，从而大幅提高细胞对co2气体的实际利用效率，使co2气体能在厌氧发酵过程中完全取代碳酸盐或碳酸氢盐用于丁二酸的合成。
2、为了实现本发明的目的，本发明提供了一种抗微纳米气泡大肠杆菌的构建及其在高效固碳合成丁二酸方面的应用，具体技术方案如下：
3、一种抗微纳米气泡大肠杆菌在固碳合成丁二酸中的应用；其中，所述的抗微纳米气泡大肠杆菌表达了csga基因；所述的固碳合成丁二酸为利用co2微纳米气泡合成丁二酸。其中，所述csga基因为抗微纳米气泡关键基因，其为淀粉样纤维蛋白csga亚基形成的关键基因，与curli的β-折叠结构密切相关。
4、优选地，所述的微纳米气泡为唯一的co2供给方式，并且发酵过程中不提供任何碳酸盐或者碳酸氢盐，结合加压发酵的方式提高大肠杆菌的固碳效率。所述的抗微纳米气泡大肠杆菌为具有产丁二酸能力并含有淀粉样纤维蛋白关键基因csga的过表达重组菌株。
5、其中，所述的微纳米气泡的直径为100nm-50μm。
6、其中，所述的csga基因来源于大肠杆菌。优选地，所述的csga基因的gene id为949055。
7、其中，所述的抗微纳米气泡大肠杆菌，其出发菌为产丁二酸的大肠杆菌。
8、其中，所述的出发菌为大肠杆菌escherichia coli ber 208，保藏编号为cctccno:m 2012351，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
9、其中，所述的抗微纳米气泡大肠杆菌按照如下方法构建得到：扩增csga基因，克隆至质粒载体中构建得到重组质粒，导入出发菌中，即得escherichia coli ber208-csga。
10、其中，所述的质粒载体为pdonor、pjn105、pucp20或pherd20t中的任意一种。优选为pdonor质粒。
11、进一步优选地，所述的重组质粒采用如下方式构建：
12、(1)以大肠杆菌基因组为模板，利用pcr扩增体系扩增csga基因片段，pcr产物片段回收；
13、(2)以质粒pdonor为模板，利用pcr体系扩增载体片段，pcr产物片段回收，pcr产物电泳后回收的载体片段和基因片段，利用同源重组法连接体系，将前述经pcr扩增的载体片段和基因片段连接；
14、(3)将连接产物利用cacl2转化法转化至e.coli dh5α，挑取阳性克隆做菌落pcr验证，将正确的阳性克隆培养后提取重组质粒。
15、其中，所述的抗微纳米气泡大肠杆菌固碳合成丁二酸，按照如下方法进行：将所述的抗微纳米气泡大肠杆菌接种至装有发酵培养基的发酵罐中，使初始od550为0.4-0.6，加入诱导剂，并向发酵罐中通入微纳米气泡形式的co2气体，置换空气完成后，利用微纳米气泡形式的co2气体维持发酵罐内的绝对压力恒定，采用闭气恒压的模式进行发酵，当发酵液中葡萄糖浓度低于1g/l时，停止发酵。
16、其中，所述的发酵培养基，其配方包括：甜菜碱0.07-0.17g/l，(nh4)2hpo4 2.1-3.1g/l，kcl 0.1-0.2g/l，nh4h2po4 0.82-0.92g/l，mgso4 0.15-0.24g/l，fecl3 1.1-1.8g/l，cocl2 0.2-0.35g/l，cucl2 0.1-0.2g/l，zncl2 0.3-0.5g/l，na2moo4 0.4-0.6g/l，mncl20.2-0.45g/l，h3bo3 0.07-0.09g/l，葡萄糖60-100g/l；优选地，所述的发酵培养基，其配方为：甜菜碱0.12g/l，(nh4)2hpo4 2.6g/l，kcl 0.15g/l，nh4h2po4 0.87g/l，mgso4·7h2o0.37g/l，fecl3·6h2o 2.4g/l，cocl2·2h2o 0.3g/l，cucl2·2h2o 0.15g/l，zncl2·4h2o0.5g/l，na2moo4·2h2o 0.5g/l，mncl2·4h2o 0.5g/l，h3bo3 0.075g/l，葡萄糖60-100g/l。
17、所述的发酵，发酵温度为35-38℃，发酵ph为6.5-6.8；优选为37℃。
18、所述的诱导剂为d-阿拉伯糖，在培养基中的添加浓度为3-8g/l，优选为5g/l；
19、所述的绝对压力恒定至0.14-0.2mpa，通过控制微纳米气泡形式的co2进气速率为0.005-0.1vvm维持压力恒定。
20、其中，所述的发酵ph通过流加碱液控制，所述的碱液，为koh水溶液或naoh水溶液，其浓度为5-8mol/l，优选为5mol/l。
21、优选地，将抗微纳米气泡大肠杆菌种子液接种至发酵罐中，所述的种子液，其od550≥4.0，接种量为5％～10％v/v。
22、进一步优选地，所述的抗微纳米气泡大肠杆菌固碳合成丁二酸的具体方法为：将新鲜的发酵培养基加入发酵罐中，并进行高压蒸汽灭菌。利用微纳米气泡发生器向发酵罐中通入微纳米气泡形式的co2气体，置换空气，随后将抗微纳米气泡大肠杆菌的种子液接入发酵罐中，使发酵液中初始的菌体浓度od550达到0.4-0.6，随后加入诱导剂；待发酵罐中全部空气被co2气体置换完成后，关闭排气出口，通过微纳米气泡发生器补充co2并维持发酵罐内的绝对压力恒定在0.14-0.2mpa，并通过流加碱液控制ph6.5-6.8，进行厌氧发酵，固碳合成丁二酸，其它相关发酵操作参数参见专利cn117551706a；
23、有益效果：
24、本发明提供了一种抗微纳米气泡大肠杆菌的构建方法并探究其在高效固碳合成丁二酸方面的应用。通过构建有抗微纳米气泡关键基因质粒的重组质粒，将重组质粒转入产丁二酸大肠杆菌体内，构建得到淀粉样纤维蛋白(curli)形成能力强的过表达菌株。采用该抗微纳米气泡大肠杆菌菌株进行厌氧固碳合成丁二酸的过程中，与出发菌株相比，该抗微纳米气泡菌株在加压发酵模式下能够耐受微纳米气泡，能够保持良好的丁二酸生产性能，co2利用效率显著提高，且在发酵过程中不再补充任何的碳酸盐或碳酸氢盐，有利于降低生物基丁二酸的发酵成本。