本发明涉及生物医药工程领域，尤其涉及一种模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片及其制备方法。
背景技术：
1、肿瘤转移是导致癌症患者预后不良和疾病复发死亡的主要原因。肿瘤转移级联(tumor metastatic cascade)是描述恶性肿瘤细胞从原发部位扩散到身体远端器官并形成继发性肿瘤(转移灶)的复杂、多步骤过程。这个过程涉及癌细胞的脱落、内渗、循环、外渗和定殖等过程，并非随机发生，而是癌细胞克服重重生理屏障、主动适应和改造微环境，对身体远端器官的入侵之旅。肿瘤细胞的血液转移是最常见的肿瘤转移途径之一，涉及到肿瘤细胞从原发病灶上脱落、内渗进入血液循环、以及从血管外渗并定殖至其他器官形成转移瘤等多个复杂步骤，它们相互关联共同推动患者疾病进展。全面模拟和研究肿瘤转移级联过程，有助于深入了解癌症转移生物学，发现新的诊断标志物和治疗靶点，开发有效的抗转移治疗策略，对推动癌症疗法和医药产业发展具有重要意义。
2、传统肿瘤转移过程模拟主要依赖于体内动物模型和transwell实验法等。transwell实验是研究细胞迁移和侵袭的有力且实用的体外工具，尤其适用于高通量筛选，然而，其显著的局限性在于高度简化的体外环境与体内真实生理/病理状态的巨大差别，无法准确模拟体内复杂肿瘤微环境和转移过程，不适合实时动态监测，因此限制了它们在生物医学研究中的应用和对肿瘤转移的深入探究；动物模型、例如小白鼠模型，涉及伦理争议，与人体存在种属差异，且实验周期长，成本较高。
3、微流控技术是一门涉及在微米尺度(通常十到几百微米)的通道网络中精确操控和加工极小体积(皮升至微升)流体的科学技术与工程，它也被称为“芯片实验室”或“微全分析系统”。近年来，微流控技术因其可精确操控流体、模拟体内机械力和生化环境、易集成、高通量、便于实时监测等优点，能够在微型芯片上重现体内器官或组织的关键生理特征和功能，为模拟和研究肿瘤转移过程提供了高度仿生的实验平台。当前，微流控技术常用于模拟肿瘤微环境，构建肿瘤转移模型，在探究肿瘤转移机制方面取得进展。然而，当前肿瘤转移模型仍存在局限性：仅能够模拟肿瘤的局部微环境和肿瘤转移过程中的单一环节，缺乏对整个转移过程的系统模拟。
4、例如，哈佛大学ingber团队设计了双层微流控芯片，构建原位肺癌芯片模型，模拟肺癌细胞的侵袭过程。chen等人开发了集成六边形transwell腔室(腔室侧壁为多孔膜)的类器官芯片平台，在腔室中间培养黑色素瘤类器官，监测肿瘤细胞穿过基质和多孔膜的迁移过程，模拟肿瘤细胞向周围组织的水平迁移过程。
5、专利文献cn104830683a公开了一种用于模拟体内肿瘤细胞及其转移微环境的仿生微流控芯片。该芯片由三层pdms基片和两层多孔pdms膜组成，通过在膜上下两面分别二维培养支气管上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞，构建了气血屏障；在与膜垂直方向的两侧连接两个真空通道，模拟肺泡的收缩和扩张；以此构建了肺芯片生理模型。在此基础上，将肺癌细胞接种于支气管上皮细胞区，并且搭建神经胶质细胞、骨细胞、及肝细胞培养室，模拟肺癌细胞向特定靶器官的转移过程。该模型依据肺癌常见起源及转移好发部位设计，会漏掉其他不同起源的肺癌以及其他的肺癌转移途径。该模型构造复杂，难于制造，且其中未考虑血液、淋巴液等流体环境对肿瘤转移的影响，仅模拟肿瘤细胞向特定靶器官的侵袭过程。大连理工大学孙德贤等人发表的文章《用于肿瘤转移研究的氧浓度梯度微流控芯片》，设计制作了集成氧浓度梯度发生器的肿瘤转移微流控芯片，从上到下依次包括：防止氧气进出pc膜，和通入氧气的空腔、pdms扩散层、培养液层、细胞层以及最下方不透氧气的玻璃层，但是其仅是模拟肿瘤转移中的氧浓度微环境的变化，缺乏对整个转移过程的系统模拟。
6、综上所述，目前仍亟需开发一种能真实模拟体内肿瘤转移级联全过程的微流控装置，深入探究癌症转移机制和抗转移方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片及其制备方法，本发明微流控芯片可以模拟肿瘤原发病灶和转移微环境，在体外模拟包括肿瘤细胞内渗、循环、外渗和定殖多个阶段在内的肿瘤转移级联全过程；并不限定肿瘤细胞起源以及转移途径，更真实地接近体内转移微环境，模拟肿瘤转移级联过程。
2、为了解决上述技术问题，本发明提供的模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片及其制备方法是这样实现的：
3、一种模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片，从下到上依次包括：基底1、中层多孔薄膜2和盖片3；所述基底1上贴着中层多孔薄膜2的一面设置有u型通道4，所述盖片3上贴着中层多孔薄膜2的一面设置有左侧通道5和右侧通道6；所述基底1、中层多孔薄膜2和盖片3贴在一起，所述左侧通道5与所述u型通道4的左侧通道重叠，所述右侧通道6与所述u型通道4的右侧通道重叠；所述左侧通道5用于肿瘤细胞的培养，所述右侧通道6用于为肿瘤细胞外渗和定殖生长提供空间，所述u型通道4用于模拟血管结构功能和流体环境，为肿瘤细胞内渗、循环和外渗提供环境条件；所述左侧通道5中的肿瘤细胞可以穿过通道和多孔薄膜在u型通道4和右侧通道6中迁移。
4、本发明设置u型通道4、左侧通道5和右侧通道6，系统模拟肿瘤原发组织和转移过程的微环境，左侧通道5中的肿瘤细胞可以在u型通道4和右侧通道6中迁移，能够全面模拟肿瘤细胞的侵袭、内渗、循环、外渗和定殖的整个转移级联过程。相比于现有技术，本发明中的微流控芯片适用于多种癌症的转移级联全过程的模拟，更真接近体内真实的癌症血液转移过程，芯片结构简单，制造方便，成本低，易操作，使用过程中也不易出现问题。
5、可选的，所述中层多孔薄膜2的材质为多孔聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯，所述中层多孔薄膜2上均匀分布有孔径在5～15μm之间的微孔。
6、可选的，所述基底1和盖片3的材质是可透光的聚二甲基硅氧烷。
7、本发明基底和盖片以及其上的u型通道、左侧通道和右侧通道是可透光的聚二甲基硅氧烷，在标记左侧通道中的肿瘤细胞、标记u型通道中的血管内皮细胞时，方便观察到不同标记物的移动方向，以及实现对转移肿瘤细胞的观察和计数。
8、可选的，所述u型通道4高度为80～300μm，宽度为0.5～3mm；所述左侧通道5的高度为200～500μm，宽度为0.5～3mm，所述右侧通道6的尺寸与所述左侧通道5相同；所述左侧通道5和所述右侧通道6与所述u型通道4重叠部分长度为2～10mm。
9、本发明对通道高度和宽度进行限制，模拟肿瘤组织内毛细血管以及淋巴管的微环境，更好地模拟细胞在血管内迁移行为；u型通道这样的高度和宽度支持细胞团操作与低剪切力灌注，避免传统微通道的堵塞问题；重叠区长度限制，确保跨屏障迁移的动态过程可观测。左侧通道和右侧通道高度略大，模拟原发肿瘤灶或转移灶的微环境。
10、可选的，所述u型通道4两端有进液口41和出液口42，所述左侧通道5两端有进液口51和出液口52，所述右侧通道6两端有进液口61和出液口62；所述进液口41和出液口42、所述进液口51和出液口52以及所述进液口61和出液口62均设置在所述盖片3上。
11、通道的进液口和出液口都设置在盖片3上，方便通入溶液或细胞，或者提供剪切应力。
12、本发明还提供一种模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
13、基于标准光刻法制作微流控芯片基底和盖片的模具：使用su-8光刻胶在洁净的硅片上分别制作所述基底和所述盖片模具，基底模具上包含u型通道4的模型，盖片模具包含左侧通道5和右侧通道6的模型；
14、配制聚二甲基硅氧烷溶液，分别浇筑在所述基底模具和所述盖片模具中，加热固化；
15、将带通道的基底和盖片从模具表面切下，利用手动打孔器在所述上盖对应位置制作进液口41和出液口42、进液口51和出液口52以及进液口61和出液口62；
16、通过等离子体处理或以聚二甲基硅氧烷溶液为粘合剂，先将所述基底中有u型通道的一面与中层多孔薄膜封接在一起，再将所述中层多孔薄膜另一面与盖片键合，得到所述模拟肿瘤转移级联过程的微流控芯片。
17、可选的，所述配制聚二甲基硅氧烷溶液，是在聚二甲基硅氧烷单体中加入交联剂，所述聚二甲基硅氧烷单体与所述交联剂的质量比是5～15:1。
18、可选的，所述加热固化的温度是50～80℃。
19、一种微流控芯片模拟和监测肿瘤转移级联过程的方法，包括如下步骤：
20、将所述微流控芯片清洗和无菌处理后，向u型通道4中通入基质蛋白溶液，将所述微流控芯片放于37℃恒温培养箱中孵育10min～2h，然后将所述微流控芯片翻转朝下再次孵育，使所述u型通道4表面均匀涂覆上基质蛋白薄层；
21、将活细胞示踪剂标记的血管内皮细胞悬浮液通入所述基质蛋白涂覆的所述u型通道4中，翻转微流控芯片，放于培养箱中静置2～12h，使细胞粘附在u型通道4四周壁上，在所述u型通道4内填充血管内皮细胞培养基，继续培养6～24h使所述血管内皮细胞稳定并形成紧密连接；
22、将活细胞示踪剂标记的重悬肿瘤细胞的基质胶溶液通入左侧通道5中，将微流控芯片放于37℃培养箱中孵育10～30min使所述重悬肿瘤细胞的基质胶固化，在所述左侧通道5内加入肿瘤细胞专用培养基；
23、在右侧通道6内加入特殊培养基，所述特殊培养基内含有能影响肿瘤细胞迁移的生物分子；利用蠕动泵在所述u型通道4内施加流体剪切应力刺激；
24、将上述处理过的微流控芯片放于培养箱中培养，每隔12～48h更换一次左侧通道5内的肿瘤细胞培养基，每隔2～12h在荧光显微镜下实时观察并记录所述微流控芯片通道中肿瘤细胞的迁移情况和位置，计数迁移进入u型通道4以及侵入右侧通道6中的肿瘤细胞数目，实现对肿瘤转移级联过程的模拟和监测。
25、本发明血管内皮细胞和肿瘤细胞分别用不同颜色的活细胞示踪剂标记，能清晰分辨肿瘤细胞的迁移。重悬肿瘤细胞的基质胶溶液中包括单个肿瘤细胞或肿瘤细胞球。
26、可选的，所述特殊培养基内含有能影响肿瘤细胞迁移的生物分子包括高浓度的血清、细胞因子、生长因子、趋化因子中的一种或几种。
27、根据不同的肿瘤细胞，选择不同的生物分子。u型通道中也不仅限于血管内皮细胞，可以根据需要选择符合肿瘤转移微环境的细胞或基质蛋白。本发明提供基质蛋白有：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、基质胶、多聚赖氨酸等中的一种或几种。肿瘤细胞也可以选择乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠、胰腺癌等多种癌细胞。
28、本发明具有如下有益效果：
29、本发明微流控芯片整合了包括原发肿瘤病灶、以及肿瘤细胞内渗、循环、外渗和定殖多个阶段在内的肿瘤转移全流程的模拟，真实地接近体内转移微环境，可适配不同癌症种类，为肿瘤转移机制探究和抗转移药物筛选提供了有前景的平台。
30、且本发明微流控芯片，仅分上、中、下三层，仅在上层和下层有3个通道，结构简单，制造容易，在使用过程中不容易出现故障。