本发属于生物制氢领域，特别涉及一种基于氮限制的巴氏梭菌-类球红细菌耦合发酵产氢方法及其应用。
背景技术：
1、随着全球能源需求增长和环境问题加剧，氢能作为清洁能源备受关注。微生物发酵制氢因其原料来源广泛（如农业废弃物、有机废水）和环境友好性成为研究热点。
2、当前主流的两步法发酵产氢体系通常采用暗发酵产氢菌（如梭菌属）与光合产氢菌（如红假单胞菌属）协同作用：暗发酵阶段通过厌氧代谢将葡萄糖转化为氢气和有机酸，光发酵阶段则利用光合细菌将有机酸进一步转化为氢气。然而，两类微生物的最佳产氢条件存在显著差异——暗发酵菌通常在30-37 ℃、ph 5.5-6.5、无光照条件下高效产氢，而光合细菌需30-35℃、ph 7.0-8.0、光照（2000-10000lux）环境；此外，暗发酵菌依赖谷氨酸钠等有机氮源维持代谢活性，而光合细菌可通过固氮酶实现自养生长，氮源过量反而抑制其产氢能力。上述矛盾导致直接共培养体系产氢效率低下（<4.0 mol h2/mol葡萄糖），迫使工业界采用分布式两步法。传统两步法（如clostridium +rhodobacter）的最大产氢得率一般小于7 mol h2/mol葡萄糖，远低于理论极限（12 mol h2/mol葡萄糖）。
3、目前，通过暗发酵产氢菌和光合细菌二步法发酵葡萄糖产氢的已报道最高氢气得率为9.4 mol h2/mol葡萄糖，该方法使用超嗜热菌thermotoga neapolitana dsm 4359和沼泽红假单胞菌 rhodopseudomonas palustris42ol。然而，该产氢体系具有诸多限制因素，如暗发酵阶段需要维持80℃的高温，且需要持续通入二氧化碳，能量消耗巨大；且第一步暗发酵完成后，需离心分离、营养补加及灭菌等多道工序，导致成本飙升及规模化应用困难。综上，亟需开发一种兼具高得率、低能耗、免灭菌特性的两步法产氢工艺，以突破现有技术瓶颈并推动生物制氢产业化进程。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于氮限制的巴氏梭菌-类球红细菌耦合发酵产氢方法。
2、本发明的另一目的在于提供上述基于氮限制的巴氏梭菌-类球红细菌耦合发酵产氢方法的应用。
3、本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于氮限制的巴氏梭菌-类球红细菌耦合发酵产氢方法，包括如下步骤：
4、（1）将活化的巴氏梭菌在无氮培养基、且在氩气环境中进行暗发酵产氢；
5、（2）接着将步骤（1）得到的培养液的ph值调节为7.0～8.0，选择性灭菌后接入活化的类球红细菌，在氩气环境中进行光发酵产氢。
6、步骤（1）中所述的巴氏梭菌优选为巴氏梭菌（ clostridium pasteurianum）dsm525。
7、步骤（1）中所述的活化的巴氏梭菌优选通过如下步骤制备得到：将巴氏梭菌接种于种子培养基，得到培养液，在氮气环境下避光静置培养至od600为1.0～1.6；接着固液分离，得到的菌体使用无氮溶剂洗涤，得到活化的巴氏梭菌。
8、所述的种子培养基为含氮培养基，包括ms培养基和rcvbn种子培养基。
9、所述的ms培养基的组成如下：一水葡萄糖2 g/l，谷氨酸钠1 g/l，nacl 5 g/l，k2hpo42 g/l，kh2po40.5 g/l，微量元素浓缩液10 ml/l，ph=6.0，溶剂为水；
10、微量元素浓缩液的成分如下：cacl2·2h2o 0.2 g/l，mgcl2·6h2o 2 g/l，fecl2·4h2o 40 mg/l，zncl21mg/l，mncl2·4h2o 1 mg/l，cucl2·2h2o 0.6 mg/l，na2moo41 mg/l，alcl31 mg/l，cocl2·6h2o 4 mg/l，硼酸饱和溶液20 μl，浓度为37%wt的盐酸20 μl，生物素0.04 mg/l，叶酸 0.04 mg/l，维生素b60.2 mg/l，核黄素0.1 mg/l，维生素b10.1 mg/l，烟酸0.1 mg/l，维生素b120.1 mg/l，对氨基苯甲酸 0.1 mg/l，泛酸 0.1 mg/l，溶剂为水。
11、所述的rcvbn种子培养基的组成如下：一水葡萄糖2 g/l，谷氨酸钠5 g/l，基本盐溶液50 ml/l，浓度为0.2 m的pbs 20 ml/l，维生素溶液1 ml/l，ph=7.0，溶剂为水；
12、基本盐溶液的成分如下：mgso4·7h2o 4 g/l，cacl2·h2o 1.5 g/l，feso4·7h2o0.236 g/l，na2edta 0.4 g/l，微量元素液20 ml/l，溶剂为水；
13、微量元素液的成分如下：mnso4·h2o 0.21 g/l，h3bo30.28 g/l，cuso4·5h2o0.004 g/l，znso4·7h2o 0.024 g/l，namoo4·2h2o 0.075 g/l，溶剂为水；
14、维生素溶液的成分如下：烟酸10 g/l，维生素b15 g/l，生物素0.1 g/l，溶剂为水。
15、所述的接种的量优选为培养液体积的5～10%。
16、所述的氮气环境为顶空气体为氮气。
17、所述的培养的体系优选如下：20 ml培养液/120 ml西林瓶。
18、所述的培养的温度优选为37±1 ℃。
19、所述的培养的时间优选为8～16 h。
20、所述的固液分离的方式优选为离心。
21、所述的无氮溶剂指的是不含有氮元素的溶剂，包括但不限于水、pbs、无氮培养基。
22、步骤（1）中所述的无氮培养基是不含氮源、但含碳源的培养基，优选为r-n(-)-ar培养基。
23、所述的r-n(-)-ar培养基的组成优选如下：一水葡萄糖2 g/l，基本盐溶液50 ml/l，浓度为0.2 m的pbs 20 ml/l，维生素溶液1 ml/l，ph=5.0～6.5，溶剂为水；ph优选为5.5；
24、基本盐溶液的成分如下：mgso4·7h2o 4 g/l，cacl2·h2o 1.5 g/l，feso4·7h2o0.236 g/l，na2edta 0.4 g/l，微量元素液20 ml/l，溶剂为水；
25、微量元素液的成如下分：mnso4·h2o 0.21 g/l，h3bo30.28 g/l，cuso4·5h2o0.004 g/l，znso4·7h2o 0.024 g/l，namoo4·2h2o 0.075 g/l，溶剂为水；
26、维生素溶液的成分如下：烟酸10 g/l，维生素b15 g/l，生物素0.1 g/l，溶剂为水。
27、步骤（1）中所述的氩气环境为顶空气体为氩气。
28、步骤（1）中所述的暗发酵的条件优选为37±1 ℃避光静置培养24～48 h。
29、步骤（2）中所述的ph值优选为7.5。
30、步骤（2）中所述的选择性灭菌指的是可以灭菌，也可以不灭菌。
31、所述的灭菌的条件优选为115～121 ℃灭菌15～20 min；更优选为115 ℃灭菌20min。
32、步骤（2）中所述的类球红细菌优选为类球红细菌（ rhodobacter sphaeroides）zx-5。
33、步骤（2）中所述的活化的类球红细菌优选通过如下步骤制备得到：将类球红细菌接种于种子培养基，得到培养液，在氮气环境下光照培养至od600为4.5～5.5；接着固液分离，得到的菌体使用无氮溶剂洗涤，得到活化的类球红细菌。
34、所述的种子培养基为含氮培养基，包括rcvbn种子培养基和r-b-2gm培养基。
35、所述的r-b-2gm的组成如下：丁酸钠1.1 g/l，谷氨酸钠2 g/l，基本盐溶液50 ml/l，浓度为0.2 m的pbs 20 ml/l，维生素溶液1 ml/l，ph=7.0，溶剂为水；
36、基本盐溶液的成分如下：mgso4·7h2o 4 g/l，cacl2·h2o 1.5 g/l，feso4.7h2o0.236 g/l，na2edta 0.4 g/l，微量元素液20 ml/l，溶剂为水；
37、微量元素液的成分如下：mnso4·h2o 0.21 g/l，h3bo30.28 g/l，cuso4·5h2o0.004 g/l，znso4·7h2o 0.024 g/l，namoo4·2h2o 0.075 g/l，溶剂为水；
38、维生素溶液的成分如下：烟酸10 g/l，维生素b15 g/l，生物素0.1 g/l，溶剂为水。
39、所述的接种的量优选为培养液体积的5～10%。
40、所述的氮气环境为顶空气体为氮气。
41、所述的培养的体系优选如下：20 ml培养液/120 ml西林瓶。
42、所述的培养的条件优选为30±1 ℃、7500～8500 lux光照培养24～48 h；更优选为30±1 ℃、8000 lux光照培养48 h。
43、所述的固液分离的方式优选为离心。
44、所述的无氮溶剂指的是不含有氮元素的溶剂，包括但不限于水、pbs、无氮培养基；优选为r-n(-)-ar培养基。
45、步骤（2）中所述的活化的类球红细菌的接种量优选按其在培养液初始od600=2.5～3.5计算；更优选按其在培养液初始od600=3.0计算。
46、步骤（2）中所述的光发酵产氢的条件优选为30±1 ℃、7500～8500 lux光照培养2～4天；更优选为30±1 ℃、8000 lux光照培养3天。
47、本发明中所述的水优选为去离子水。
48、上述基于氮限制的巴氏梭菌-类球红细菌耦合发酵产氢方法在氢气制备中的应用。
49、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
50、1、本发明所提供的产氢体系产氢得率达到9.81 mol h2/mol葡萄糖，为目前最高水平。
51、2、本发明所提供的产氢体系中，巴氏梭菌发酵液无需经过离心去除菌体及额外营养液添加等操作，只需要简单调整ph，就可以直接进行类球红细菌光发酵产氢培养。
52、3、本发明通过氮限制既抑制菌体过度增殖、节省碳源流向，又同时诱导固氮酶高表达，开辟氢化酶之外的第二条高效产氢途径，从而在降低氮源成本的同时进一步提升氢气产量。
53、4、传统流程必须依赖115 ℃、20 min以上的高温灭菌来抑制杂菌，既耗能又增加设备复杂度，本发明利用“缺氮+氩气”双重选择压力，自发构建对产氢梭菌有利、对外源嗜氢菌抑制的微生态屏障，可在完全免灭菌的条件下稳定运行，产氢效率仅下降5%左右，显著降低了能耗与操作成本，为后续免灭菌连续发酵及规模化放大奠定了工艺基础。