与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记及其应用的制作方法

专利名称:与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种SCAR标记及其应用，它涉及一种与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记及其应用，在洋葱育种中能够利用该标记来辅助选择洋葱雄性不育系和配套保持系，属于生物技术领域：
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技术背景
洋葱Allium c印aL.)，是世界上主要蔬菜种类之一，素有保健食品的美称。据FAO (2009)统计，世界洋葱种植面积370万公顷，产量7230万吨，在所有的蔬菜作物中，其种植面积居第二位，产量居第三位。其中，我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积超过100万公顷，总产量2107万吨，约占全世界产量的30%。洋葱不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和糖类是其具有独特风味的主要原因，从医疗保健角度来讲，洋葱具有抗血栓、促进血液循环、抗癌等功效，其营养和医疗价值逐渐被全世界所公认。
1936 年美国的 Jones 和 Emsweller [Jones, H. A. and S. L. Emsweller. 1936. A malesterile onion. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 34 :582-585.]首次在“意大利红” (ItalianRed)品种中发现雄性不育株，其不育性由单个核基因和细胞质共同控制。1943年Jones和Clarke[Jones, H. A and A. Clarke. 1943. Inheritance of male sterility in the onionand the production of hybrid seed. Proc Amer. Soc. Hort. Sci. 43 :189-194]又发现了雄性不育系。随后洋葱成为世界上最早利用杂种优势的蔬菜作物之一。质核互作控制洋葱的育性，用于洋葱杂交种生产有着极大的优势。但是，由于Ms基因或者S型细胞质高频率的存在，从一些栽培品种很难成功的得到保持系，比如“TeXasl015Y” (United States)、“ SapporoKi ”(Japan)、“Pukekohe Longkeeper ”(New Zealand)。因此，洋葱雄性不育保持系的选育是一项非常费时费力的工作。
洋葱起源于中亚地区，传入我国的历史较短。由于洋葱育种年限是白菜、萝卜等蔬菜的2-4倍，而且我国洋葱的种质资源相对匮乏，雄性不育技术在蔬菜上的利用也远落后于其他发达国家，杂交种的市场几乎是被国外品种所垄断。随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加，生产上主要以品种引进和常规品种选育为主，缺少具有我国自主知识产权的杂交一代品种，需要花费大量的外汇从国外进口种子,使洋葱的生产成本居高不下。优良雄性不育系和保持系的选育是洋葱育种中亟待解决的关键环节，也是洋葱产业化的源头工作。因此，要改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究，从而缩短育种年限，尽快选育出具有我国自主知识产权的而且满足市场需求的洋葱杂交种。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新手段，即分子标记技术。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测至IJ，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题。它包括了分子生物学研究的多项技术如DNA限制性酶切、Southern转移、分子杂交、PCR技术等。DNA分子标记是DNA水平上遗传多样性的直接反映，目前主要有以下几种标记方法限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms, RFLP)、随机扩增多态性标记(randomamplified polymorphic DNA, RAPD)、简单序列重复标记(simple sequence repeats, SSR)、扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment length polymorphisms, AFLP)。RFLP 标记需要Southern杂交，操作较为繁琐，而RAPD标记准确性和稳定性较差，均不适合于大规模的田间材料的鉴定工作，AFLP结合了 RFLP和RAPD各自的优点，方便快速，只需要极少量DNA材料，就可以快速获得大量信息，而且实验结果稳定可靠。SCAR标记操作简便、准确性高、稳定性高，不具有上述标记的缺点，成为首选的分子标记方法。所谓的SCAR标记就是指将特异性片断两端测序，合成特异性引物，进行特异性片断扩增。Havey[HaveyMJ.Diversity among male-sterility-inducing and male-fertile cytoplasms ofonion. Theor Appl Genet, 2000,101 :778-782]利用RFLP分子标记手段找出了洋葱雄性保持系系和不育系线粒体基因组之间的差异。Engelk等[Engelke T, Terefe D, TatliogluT. A PCR-based marker system monitoring CMS-(S)，CMS-(T) and (N)-cytoplasm in theonion (Allium cepa L.). TheorAppl Genet, 2003,107 :162-167]得到了鉴定洋葱 S 型、N型和 T 型细胞质的分子标记。G0kge等[G0kge AF,McCalIum J, Sato Y, Havey MJ. Molecular·tagging of the Ms locus in Onion. JAmer Soc Hort Sci, 2002，127 (4) :576-582]利用AFLP和RFLP方法标记洋葱细胞核的MS位点，构建了连锁图谱，并获得了遗传距离为O. 9cM的RFLP标记。
通过对洋葱雄性不育的研究，已经获得了基于PCR的稳定的鉴定细胞质类型的分子标记。细胞核基因型的鉴定上也已获得了一些RFLP标记，与传统的“测交、回交、自交”等方法相比，这种技术可大大缩短保持系的选育年限，提高育种效率。然而，由于RFLP分子标记在操作上较为繁琐，而且已获得的RFLP标记在材料的鉴定范围上有一定的局限性，上述的研究成果能否直接应用于我国的洋葱杂交种的研制，目前尚不清楚，需要进行大量的研究工作。基因标记的目的是实现分子标记辅助育种(Marker Assisted Selection, MAS)。无论是与细胞质还是核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作量，提高育种效率。利用与细胞核msji基因紧密连锁的标记，可检测到含有细胞核不育基因的材料，淘汰显性纯合的洋葱材料，只从持有雄性不育基因ms的单株中选择保持系，保证选择的可靠性，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高选择效果。因此，获得与洋葱细胞核ms因紧密连锁的分子标记，尤其是操作简便、准确性稳定性高的SCAR标记，对于洋葱不育系和保持系配套，选育洋葱杂交种具有重要意义。

发明内容
针对目前洋葱育种中存在的困难，发明了一种可用于辅助选育洋葱雄性不育系和配套保持系的SCAR标记。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记，其特异片段长度为357bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
所述SCAR标记引物是
正向引物5'-TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3'；[0012]反向引物5'-GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3';如 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3 所
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本发明利用AFLP标记方法以洋葱不育系118 S(msms)与具有不同遗传背景的可育材料12-12 S(MsMs)的回交一代BC1[118X (118X12-12)]为材料筛选到了与洋葱雄性不育恢复基因Ms基因紧密连锁的AFLP分子标记，通过Tail-PCR技术将该标记序列进行染色体步移后，成功的获得了与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记，将其命名为OSG-SCAR0利用OSG-SCAR标记对洋葱候选保持系材料的核基因可进行快速的判断，淘汰无该条带(MsMs)的个体,保留有条带(msms或Msms)的个体,从而保证候选材料中存在细胞核雄性不育ms的基因，减少常规育种的盲目性，以加快选育洋葱的保持系的进程，进而建立洋葱分子标记辅助育种技术体系。
所述SCAR标记的筛选过程如下
(I)以洋葱雄性不育系118 S(msms)为母本与父本自交系12-12 S(MsMs)杂交，所获Fl代S(Msms)为父本与母本不育系118 S(msms)回交，获得四个回交后代分离群体07-11812,07-11012和08_11812、08_11012，开花后根据育性判断结果分为可育群体和不育群体，其可育和不育株数比例见表I。
(2)用北京TIANGEN公司的快速基因组提取试剂盒提取洋葱基因组总DNA。
(3)采用AFLP分子标记方法筛选与洋葱恢复基因Ms紧密连锁的标记。
(4)获得AFLP标记后，通过Tail-PCR技术将该标记序列进行染色体步移后，获得能够鉴定洋葱雄性不育基因ms的SCAR标记。
(5)经过遗传分析及验证该标记的可行性，获得了与洋葱雄性不育基因ms共分离OSG-SCAR 标记。
所述SCAR标记可以作为分子标记应用于辅助选育洋葱雄性不育系和配套保持系，具体应用方式为利用SCAR标记的引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测是否扩增出大小357bp的片段，若没有扩增产物，则该待测个体的细胞核基因型为MsMs，可以作为父本系(恢复育性)，若有扩增产物，则该待测个体中含有ms，其基因型为Msms或msms可以作为筛选不育系或保持系的材料，结合申请人在此之前开发的判断细胞质育性技术(授权专利号ZL200910014679，公开号CN 101492738A)，可应用于筛选洋葱雄性不育系和保持系。
本发明的有益效果是由于洋葱是两年生植物，育种年限远远超过一年生蔬菜。洋葱育种年限长是育种工作中迫切需要解决的问题。本发明利用分子标记的技术获得了与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的OSG-SCAR标记。利用该标记可以筛选到具有洋葱雄性不育基因的单株，这对于加快洋葱的育种进程，建立洋葱分子标记辅助育种技术体系具有重要意义。其优点具体如下
I.本发明所获得的与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的OSG-SCAR标记，结果稳定、准确、操作简便，它能够准确鉴定洋葱雄性不育基因。本发明的应用可大大缩短育种年限，避免了常规育种方法中的盲目性，极大地提高了选择效率。
2.在洋葱雄性不育基因标记方面，尚未见到与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁(共分离)标记的报道。本研究获得的OSG-SCAR与洋葱雄性不育基因共分离，因此适用于广泛的不同遗传背景材料，是一个普遍性标记。[0024]3.由于OSG-SCAR标记能够直接鉴定具有不同遗传背景材料的雄性不育基因ms，因此利用该标记可以建立具有普遍意义的洋葱分子标记辅助育种技术体系，有效的加快雄性不育系和保持系的选育进程。


图I :洋葱回交一代分离群体的基因组总DNA的电泳图谱；其中S1_S8为细胞核基因型为msms的不育单株，N1-N8为细胞核基因型为Msms的可育单株。
图2 :洋葱不育池、可育池及组成基因池的单株基因组总DNA的AFLP电泳谱带图；其中s池为洋葱细胞核不育基因池，Sl-SlO为构成不育基因池的十个单株；N池为洋葱细胞核可育池，Nl-NlO为构成可育基因池的十个单株。箭头表示可育池中扩增出的特异片段。图3 :OSG-SCAR标记验证的电泳图谱；其中M为Marker ;图中1-12为父本(MsMs)的自交单株。12-24为分离群体中的不育单株(msms)。
图4 :对洋葱分离群体 07-11812,08-11812 和 07-11012,08-11012 群体进行OSG-SCAR标记验证的部分电泳图谱；其中M为Marker ;1、16为MsMs对照；2_15为洋葱细胞核型为msms的单株，17-30为洋葱细胞核基因型为Msms的单株。
图5 :对来源于不同遗传背景的已知基因型(MsMs)材料进行OSG-SCAR标记验证的部分电泳图谱；其中M为Marker ;I为msms对照，2-5为PR146单株，6-9为PR149单株，10-13 为 PR153 单株，14-17 为 PR156 单株。
图6 :对来源于不同遗传背景的洋葱雄性不育系S(Hisms)和保持系N(Hisms)材料进行OSG-SCAR标记验证的部分电泳图谱。1、18为MsMs对照，2_17为不同的不育系材料。19-30为不同的保持系材料。
图7 :对部分不同来源的洋葱杂交种材料进行OSG-SCAR标记验证的部分电泳图谱。其中，M为Marker ；1号和13号是父本12-12 (MsMs)单株，2号和14号是分类群体内可育单株(Msms),3号和15号是分类群体内不育单株(msms) ;4_6，7-9,10-12,分别是日本沈井种苗株式会社的洋葱杂交种夕一 *'，才、才7 — ^ , 7卜16-18,19-21, 22-24,分别是日本七宝种苗株式会社的洋葱杂交种I； 3号，夕一吁>，7 F > ^。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例ISCAR标记的筛选与应用
(一 )材料与方法
I.基因组总DNA的提取与检测
洋葱四个回交一代群体的07-11812、07-11012和08-11812、08_11012的基因组DNA采用基因组快速提取试剂盒(北京，TIANGEN)的方法提取，利用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的质量。
2.基因池的建立
应用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法,将回交群体07-11812的10个不育单株和10个可育单株的DNA样品分别等量混合，组成洋葱的不育基因池和可育基因池。[0039]3. AFLP接头和弓丨物的合成
基因组DNA的酶切采用NEB公司的限制性内切酶EcoR I和Mse I，其相应的接头和引物由北京博尚生物技术有限公司合成，PAGE纯化。
4. AFLP 分析
AFLP分析程序参照Vos et al. (1995)的方法，有所改进。采用16EcoR I和16MseI选择性扩增引物，共构成256对引物组合。
(I)基因组DNA的酶切0. 5mL的离心管中加入2. 5 μ LlO X 4Buffer，
O.25 4 1^100父85六，模板0嫩(200-3001^)，0.5 4 1^。01I 和 O. 5 μ LMse I (IOU/μ L)，ddH20补足总体积至25 μ L。充分混匀，短暂离心，37°C水浴6小时，65°C 15min，灭活酶。
(2)酶切产物与人工接头的连接在上述酶切混合物中，加入5 μ MEcoRI接头和50 μ MMse I 接头各 O. 5 μ L，T4DNA 连接酶(5U/ μ L) I μ L, IOX T4DNALigase Buffer3. O μ L。充分混匀，短暂离心，16°C连接过夜，70°C 15min，灭活酶。用TE缓冲液将连接产物稀释10倍后作为预扩增反应的模板。
(3)预扩增25μ L的反应体系中加入IOXPCRBuffer (with Mg2+) 2. 5 μ L，稀释的连接产物 IpL, EcoR I 和 Mse I 的预扩增引物各 I μ L (30ng/ μ L), Taq DNA polymerase
0.2 μ L (5U/ μ L)，dNTPs (each 2. 5mM) 2. 0 μ L, ddH2017. 3 μ L。PCR 扩增反应程序为 94。。预变性 5min, [94°C变性 30sec, 56°C退火 30sec, 72°C延伸 60sec]，30 个循环，72°C延伸 5min,4°C保存。将预扩增产物稀释50倍后作为选择性扩增的模板。
(4)选择性扩增20μ L 反应体系，其中 IOXPCR Buffer (with Mg2+) 2. O μ L,dNTPs (each2. 5mM) I. 6 μ L, Taq DNA polymerase (5U/ μ L) 0. 2 μ L, EcoR I 和 Mse I 的选择性扩增引物各I μ L(30ng/y L)，模板I μ L, ddH20补足总体积至20 μ L,反应程序为94°C预变性5min，[94°C变性30sec，65°C退火30sec，72°C延伸60sec (每次循环退火温度降低O. 7°C ),13 个循环]，94°C 变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C 延伸 60sec，23 个循环，72°C 延伸5min，4°C保存。
5.聚丙烯酰胺凝胶电泳
(I)聚丙烯酰胺凝胶电泳在选择性扩增样品中加入等体积的上样缓冲液(98%甲酰胺，IOmM EDTA,0. 25%溴酚蓝，O. 25%二甲苯青)，95°C变性5min后立即置于冰上冷却。每份样品取5yL电泳，50W恒功率至二甲苯青指示剂为胶2/3处终止电泳。
(2)银染显色
①固定电泳结束后将有胶的短板放入固定液(900mLddH20中加入IOOmL冰醋酸)中轻摇IOmin终止反应，然后用ddH20冲洗lmin。
②用I. 5%的浓硝酸洗3min后用ddH20冲洗lmin。
③染色用O. 2%的硝酸银染色液染色20min。
④显色将硝酸银染色后的短板用ddH20冲洗30s后迅速置于预冷的显色液(30gNa2C03 溶于 ILddH2O 中，并加入 540 μ L37 % 的甲醛和 200 μ L 10mg/mL 的 Na2S2O3)中4-7min，然后用 ddH20 冲洗 lmin。
⑤固定在5%的冰乙酸溶液中轻摇5min以终止反应,再用ddH20冲洗lmin。
⑥干胶室温下自然晾干。
6.聚丙烯酰胺凝胶上多态性DNA片段的回收、纯化、克隆及测序[0057](I)多态性DNA片段的回收及纯化
用灭菌后的手术刀割取聚丙烯酰胺凝胶上的差异条带，溶解于20 μ LddH2O中，95°C水浴IOmin后短暂离心，用作差异片段PCR反应的模板。差异片段扩增的PCR反应体系及反应程序与选择性扩增的反应条件相同。差异条带PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后按照Biospin Gel Extraction Kit使用说明回收纯化特异条带。
(2)多态性DNA片段的克隆、测序
将回收纯化的多态性DNA片段根据分子克隆II的方法进行分子克隆，酶切和菌液PCR检测后挑取阳性克隆委托北京博尚生物技术有限公司进行DNA序列的测定，测序结果如 SEQID NO. 4 所示。7.标记的SCAR转化
根据测序结果，利用PrimerPremier 5. O软件设计引物,通过Tail-PCR染色体步移获得已知DNA序列侧翼的未知序列，再利用Primer Premier 5. O软件设计SCAR引物。
8.连锁分析
利用SCAR 标记，对 07-11812、07-11012 和 08_11812、08_11012 回交一代群体的基因组DNA进行PCR扩增来分析是否存在具有交换值的个体，检测OSG-SCAR标记的稳定性及与雄性不育基因ms的遗传距离。
9. OSG-SCAR标记在来源于不同遗传背景的已知基因型材料中的验证
利用不同的不育系、保持系、自交系及已知基因型的杂交种材料日本泷井种苗株式会社品种(夕一*'、才、才7 — 7、7卜 > )，七宝种苗株式会社(I； 3号、七宝甘70、夕一廿 >、7 卜'' K > 7 )，及育性恢复材料(PR146、PR149、PR153、PR156)验证 0SG-SCAR 标记的广谱性和分子标记辅助选择的可行性。来源于日本不同洋葱品种(杂交种)，核基因型为MsMs,通过测交、回交方法选育而成,选育方法参见[Pike,L. Μ. 1986. Onion breeding.In Basset,M. J. (ed. )Breeding Vegetable Crops.AVI Publishing Co. , Connecticut,pp,357-394]。
( 二 )结果与分析
I.利用四组 07-11812、07-11012 和 08-11812、08-11012 回交一代群体的基因组DNA的检测分析
采用基因组快速提取试剂盒(北京，TIANGEN)的方法提取洋葱叶片基因组总DNA，经过分光光度计和0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明(见图I)，提取的DNA0D26(i/0D28(i比值在I. 8-2. O之间，电泳检测结果显示多糖和蛋白质含量低，无RNA，结构完整，带型整齐一致，无降解现象，可以用于进一步的AFLP分析和PCR扩增。
2. AFLP结果分析
选用16条EcoRI选择性扩增引物和16条Mse I选择性扩增引物组成256对引物组合对回交I代群体的不育池和可育池进行AFLP分析，结果发现大多数引物组合均能扩增出稳定而且清晰的条带，每对引物组合平均扩增60-70条清晰的条带。经过两次独立的重复试验和在不育池和可育池中进行单株验证(结果如图2所示)，确定了一个稳定的AFLP多态性片段，由引物组合E-AGG/M-CGT扩增产生，命名为AGG/CGT。
3. AFLP 标记的 SCAR 转化
将多态性DNA片段进行回收、纯化、克隆及测序后，根据AGG/CGT片段的序列，利用Primer Premier 5. O软件设计了 Tail-PCR所需引物，通过Tail-PCR染色体步移获得洋葱AGG/CGT片段的侧翼未知序列，再利用Primer Premier 5. O软件设计SCAR引物，引物序列为正向引物5 ' -TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3 '和反向引物5' -GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3'(如 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 所示)，利用该 SCAR引物对父本自交系12-12 (MsMs)和分离群体不育单株(msms)材料的基因组DNA进行PCR扩增，所有细胞核基因型为msms的DNA均扩增出大小357bp的片段(如SEQ ID NO. I所示)，而所有细胞核基因型为MsMs的DNA没有扩增产物(见图3)。
4.连锁性分析结果
对回交一代分离群体07-11812，07-11012和 08-11812，08-11012 共 472 个单株的基因组DNA进行PCR扩增，所有个体的DNA均扩增出大小357bp的片段(如SEQ ID NO. I所示)，(图4)。没有发现具有交换值个体，说明OSG-SCAR标记与洋葱雄性不育基因ms是紧密连锁共分离的，其遗传距离为零。
5. OSG-SCAR标记在已知基因型自交系(品种、杂交种)中的验证结果对多组不育系S (msms)及保持系N (msms),杂交种S (Msms)日本沈井种苗株式会社品种(夕一 *'、木才π、了卜 > )，七宝种苗株式会社(I； 3号、夕一廿>、7卜''八> 7 )的DNA进行了检测，结果均扩增出OSG-SCAR标记片段(表2、图6、7)。对四组已知基因型自交系(PR146、PR149、PR153、PR156)S/N(MsMs)的DNA进行了检测，均未扩增出357bp的片段(见表2、图5)。该结果说明OSG-SCAR标记在不同遗传背景材料中也同样与雄性不育基因ms紧密连锁共分离。
表I不同组合BCl代育性分离比例结果
权利要求
1.一种与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记，其特征在于所述SCAR标记的特异片段长度为357bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求
I所述的与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记，其特征在于所述SCAR标记的引物是 正向引物 FNl : 5' -TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3'； 反向引物 RNl : 5' -GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3'。
3.权利要求
I或2所述的与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记在辅助选育洋 葱雄性不育系和配套保持系中的应用。
4.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于具体应用方式为，利用SCAR标记的引物对待测个体的基因组DNA进行PCR扩增，检测是否扩增出大小357bp的片段，若没有扩增产物，则该待测个体的细胞核基因型为MsMs，若有该扩增产物，则该待测个体基因型中含有ms,其基因型为Msms或msms。
专利摘要
本发明公开了一种与洋葱雄性不育基因ms紧密连锁的SCAR标记，其特异片段长度为357bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述SCAR标记引物是正向引物5′-TCAGTATCAATAGAAGGAATCAC-3′；反向引物5′-GTATACCATTGGTACTTGATGCA-3′。利用本发明的标记可以对洋葱雄性不育基因的有无进行快速准确的判断，这对于加快洋葱的育种进程，建立洋葱分子标记辅助育种技术体系具有重要意义。本发明的应用可大大缩短育种年限，避免了常规育种方法中的盲目性，极大地提高了选择效率。
文档编号C12N15/11GKCN102952797SQ201110247512
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月24日
发明者吴雄, 杨妍妍, 霍雨猛, 刘冰江, 缪军, 张一卉 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所