专利名称:微囊藻毒素检测芯片、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微囊藻毒素检测芯片，本发明还涉及具有该检测芯片的试剂盒及应用该试剂盒进行微囊藻毒素检测的方法。
背景技术：
蓝藻又名“蓝绿藻”，在一些营养丰富的水体中，某些蓝藻常于夏季大量繁殖形成 “水华”。在引起水质恶化的同时，某些“水华”种类还会产生具有生物毒性的次生代谢产物， 称为“蓝藻毒素”。这些蓝藻毒素的释放直接对鱼类、人畜产生危害。蓝藻毒素依据其最终导致的病症的不同可以分为四大类神经毒素、肝毒素、细胞毒素以及刺激性毒素(irritant toxins) 0在这四类毒素中，肝毒素即微囊藻毒素(microcystin)对公众的健康危害最大， 严重的会引起其死亡。因此，围绕如何检测、控制和消除蓝藻毒素，各国的科学工作者开展了大量的研究工作。
对于微囊藻毒素的检测，早期通过构建相应的生物模型进行生物毒性实验以检测水体中是否有蓝藻毒素存在。然而，较低的灵敏度、较高的实验耗费以及生物毒性实验带来的一系列伦理问题，使得人们不得不选择别的方法来对毒素进行诊断。随着微量样品分析仪器(如，HPLC、MALDI-T0F)的发展，依托这些仪器开发出多种用于检测自然水体中蓝藻毒素的方法。这些方法分析过程简单快捷并且具有很高的灵敏度。然而，由于分析仪器对样品的前处理有着很高的要求，因此在实际运用中，样品的处理变得既费时又费力，并且昂贵的分析仪器和标准品也使得许多实验室无法开展对蓝藻毒素的诊断。同时，依靠免疫学和生物化学的方法开发出的诊断手段也逐渐运用于实验室或自然环境水体中蓝藻毒素的检测。 如，对肝毒素(microcystin和nodularin)进行检测的ELISA方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制剂)和细胞毒性诊断。然而，前述多种诊断方法，均以释放至水体中的微囊藻毒素为检测对象，不能在毒素从藻细胞内释放到水体之前对其进行预判断。无法通过这些方法对潜在的产毒微囊藻进行预检。从而降低了生物监测的时效性，大大影响有害藻华的监测/预警。 类似的公开文献可以参考专利号为ZL200310109105. 2的中国发明专利《水中痕量微囊藻毒素的检测方法》(授权公告号CN100387985C)；申请号为200710070274. 8的中国发明专利申请公开《水体中微囊藻毒素的检测方法》(公开号101169414A)；还可以参考《水生生物学报》2003年04期，第27卷第4期中王晓峰等所著的“用蛋白磷酸酶抑制法比色法检测水中微囊藻毒素类物质”。
近年来，随着生物芯片技术的日趋成熟，高效、快速、准确、灵敏的生物芯片被应用到越来越多的领域如基因序列分析、杂交、基因突变检测及多态性分析、基因分型、疾病检测、食品微生物检测等；该技术可同时将大量不同的探针固定于同一支持物上，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析；运用生物芯片技术可以克服其它常用传统技术存在的问题，满足在实际检测工作中的快速、高通量、自动化检测的要求；鉴于生物芯片的这些优点，国内外已经先后开发了多种生物芯片用于基因突变及多态性分析、基因插入或缺失、临床诊断、微生物鉴别等多个领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种具有特异性探针的微囊藻毒素检测芯片。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种具有特异性探针的微囊藻毒素检测芯片的试剂盒。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种高通量、高灵敏度的微囊藻毒素检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种微囊藻毒素检测芯片，包括基片及结合于基片上的探针，其特征在于所述的探针为六条，分别包括如下基因序列
g、5，_TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC_-3，；[0010]h、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC_-3，；[0011]i、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG_-3，；[0012]j、5，_TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT_-3，；[0013]k、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA_3，；[0014]1、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA_-3，。
一种具有上述的微囊藻毒素检测芯片的试剂盒。该试剂盒还具有核酸提取剂、杂交液。
一种利用上述的试剂盒进行微囊藻毒素检测的方法，其特征在于包括如下步骤
①样品DNA提取将水样离心，弃上清，以核酸提取剂结合吸附柱法提取离心所得水样中宏基因组的DNA;
②杂交将杂交液溶化后和宏基因组DNA混勻，变性后，冰浴，把芯片放入杂交盒， 盖上盖片，通过加样孔注入变性冰浴后的杂交液，盖紧杂交盒盖，于杂交仪中杂交；
③清洗杂交完的芯片通过洗干仪清洗并离心；
④芯片扫描及结果判读清洗后离心的芯片通过微阵列芯片扫描仪，并对结果进行判读，给出检测结果。
与现有技术相比，本发明的优点在于微囊藻毒素检测芯片与微阵列芯片扫描仪和微囊藻毒素检测芯片检测系统配套使用。进行检测时，将富集后的样品宏基因组DNA置于芯片上，当目标DNA与特异性探针结合时，通过检测各检测位点的荧光情况对目标水体中是否存在微囊藻毒素基因进行定性分析。芯片具有多组微囊藻合成基因的特异性探针， 通过多组探针的相互矫正达到对水体中微囊藻毒素进行快速、准确检测的目的；其次，由于一张芯片上可以点4个探针阵列，每个阵列可以检测一个样本，因此可以同时检测4个来自于不同采集地的样本，达到快速检测多个样品的目标，同时，也可以一次性对某个样本进行 4次的重复，对检测结果的准确性进行快速校正；结合生物芯片和分子杂交技术，剔除了繁琐的PCR扩增，缩短了检测时间，可以高通量、高灵敏度的快速进行检测。
图1为实施例中芯片结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
①样品DNA提取将水样离心，弃上清，以核酸提取剂结合吸附柱法提取离心所得水样中宏基因组的DNA
②杂交将杂交液溶化后和宏基因组DNA混勻，变性后，冰浴，把芯片放入杂交盒， 盖上盖片，通过加样孔注入变性冰浴后的杂交液，盖紧杂交盒盖，于杂交仪中杂交；
③清洗杂交完的芯片通过洗干仪清洗并离心；
④芯片扫描及结果判读清洗后离心的芯片通过微阵列芯片扫描仪，并对结果进行判读，给出检测结果。
其中，核酸提取剂恥丨(^61^，仏5]公司生产的!^8丨0嫩spin kit。杂交仪、洗干仪和扫描仪三部分共同构成微囊藻水华检测芯片检测分析系统，杂交仪、洗干仪和扫描仪均为博奥生物有限公司生产，产品型号分别为晶芯 Biamixer Π芯片杂交仪、晶芯 Slide Washer 8芯片洗干仪和晶芯 LuxScan 10K-A微阵列芯片扫描仪。
杂交液是不包含变性产物(宏基因组DNA)的杂交液，由多种试剂配制的混合溶液以用于芯片的杂交过程。具体的组成比例如下(以SyL为例)
权利要求
1.一种微囊藻毒素检测芯片，包括基片及结合于基片上的探针，其特征在于所述的探针为六条，分别包括如下基因序列a、5，-TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC-3，；b、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC-3，； C、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG-3，；d、5，-TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT-3，；e、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA-3，；f、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA-3，。
2.一种具有权利要求
1所述的微囊藻毒素检测芯片的试剂盒。
3.根据权利要求
2所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还具有核酸提取剂、杂交液。
4.一种利用权利要求
2所述的试剂盒进行微囊藻毒素检测的方法，其特征在于包括如下步骤①样品DNA提取将水样离心，弃上清，以核酸提取剂结合吸附柱法提取离心所得水样中宏基因组的DNA ；②杂交将杂交液溶化后和宏基因组DNA混勻，变性后，冰浴，把芯片放入杂交盒，盖上盖片，通过加样孔注入变性冰浴后的杂交液，盖紧杂交盒盖，于杂交仪中杂交；③清洗杂交完的芯片通过洗干仪清洗并离心；④芯片扫描及结果判读清洗后离心的芯片通过微阵列芯片扫描仪，并对结果进行判读，给出检测结果。
专利摘要
一种微囊藻毒素检测芯片，包括基片及结合于基片上的探针，所述的探针为根据微囊藻毒素合成基因簇中六个保守区域序列涉及的六个特异性探针。本发明还公开了具有该检测芯片的试剂盒及利用该试剂盒进行微囊藻毒素检测的方法。与现有技术相比，本发明的优点在于结合生物芯片和分子杂交技术，剔除了繁琐的PCR扩增，缩短了检测时间，可以高通量、高灵敏度的快速进行检测。
文档编号C12Q1/68GKCN102199670SQ201110115612
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月28日
发明者严婷婷, 严小军, 朱鹏, 游玉容, 陈海敏 申请人:宁波大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan