酒酒球菌抗酸相关基因的rapd标记和scar标记及其获得方法
【专利摘要】本发明公开了酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记以及基于RAPD标记的SCAR标记，其中SCAR标记是以酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到的，所用SCAR引物的序列为：SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT；RAPD标记的序列为序列表1。本发明所得到的SCAR标记是酒酒球菌抗酸基因连锁的稳定遗传标记，为选育优良的酒酒球菌菌株提供了稳定可靠的一级信息源。
【专利说明】酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记和SCAR标记及其获得方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酿酒微生物生物技术工程，特别涉及酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记、SCAR标记及其获得方法。
【背景技术】
[0002]苹果酸-乳酸发酵(Malolactic Fermentation,简称MLF)是葡萄酒酿造中非常关键的二次发酵过程，它包括有机酸、糖类代谢、多糖和氨基酸的代谢作用，还涉及到许多酶类，比如糖苷酶、酯酶、蛋白酶等，这些代谢反应产生多样化的挥发性物质，从而改善和修饰葡萄酒的感官特性。MLF过程主要有酒酒球菌主导。酒酒球菌发挥优良特性必须要抵抗葡萄酒中恶劣的生存环境，产生一定的抗胁迫能力，比如抵抗低pH值胁迫、高酒精浓度胁迫、高SO2浓度胁迫和营养物质匮乏胁迫等。酒酒球菌在葡萄酒中的抗胁迫能力的大小也就是存活量的多少，是影响MLF活性的关键，因此对不良环境的抵抗能力成为优良菌株选育的重要参照指标。
[0003]酒酒球菌的抗酸机制可以作为生物化学和分子生物学方法选育优良菌株的理论基础，然而酒酒球菌抵抗胁迫时有相当复杂的反应机制，目前本领域技术人员尚不清楚酒酒球菌在受到酸胁迫时的具体反应机制。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的缺陷，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因片段的稳定遗传标记的方法，以及基于此方法获得的RAPD标记和SCAR标记。本发明所获得的标记序列是与酒酒球菌抗酸基因连锁的稳定遗传标记，为进一步揭示酒酒球菌抗酸基因的调控机制奠定理论基础，并且作为一级信息源可以用于选育优良的酒酒球菌菌株。
[0005]为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的:
[0006]首先，本发明公开了酒酒球菌菌株的RAH)标记，其序列全长为lOOObp，序列的碱基排列见序列表1所示。该序列具有特异性，与酒酒球菌抗酸性状有紧密联系，可以用作酒酒球菌抗酸性研究的标记序列。
[0007]其次，在上述RAPD标记的基础上，本发明还公开了酒酒球菌菌株的SCAR标记，将酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到，其序列如序列表2所示。
[0008]其中所用SCAR 引物的序列为:SAl:TCTGGACGGACAATATAAGTCA ;SA2:TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。
[0009]相对于RAPD标记，SCAR标记稳定性更好、可重复性强。SCAR标记表现为扩增片断的有无，是一种显性标记，能更方便、快捷用于快速检测大量个体。
[0010]其中，上述的RAPD标记到SCAR标记的转化条件为PCR扩增反应，采用Taq酶1.0U、SCAR 引物 0.4 μ mol / L、dNTP160 μ mol / L、Mg2+3.0mmol / L、RAH)标记 DNA 模板 IOng ;反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性lmin, 56°C退火lmin, 72°C延伸1.5min, 30个循环；72°C 延伸 5min。
[0011]相应的，在上述基础上，本发明公开了获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAro标记的方法，包括下述步骤:
[0012]I)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株；
[0013]2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA ；
[0014]3)基于BSA法与RAPD法，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记；
[0015]4)回收抗酸性RAPD特异片段，与pMD119_T载体连接后测序得到RAPD标记。
[0016]其中，步骤I)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同PH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。
[0017]其中，步骤2)的CTAB法是生物领域常用的用来提取DNA的方法，采用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，在高离子强度的溶液中(>0.7mol / L NaCl)与蛋白质和多聚糖形成复合物，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。
[0018]其中，步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。
[0019]上述过程中，通过大量重复实验后，最终可以得到只能在抗酸菌株中稳定扩增出的特异性条带，以及能够用于该特异性条带扩增的引物，该引物最终命名为S200:TCTGGACGGAο
[0020]进一步的，在上述基础上，本发明提供了获得酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记的方法，以SCAR引物将RAPD标记进行PCR扩增。
[0021]其中，PCR扩增反应，采用 Taq 酶 1.0U、SCAR 引物 0.4 μ mol / L、dNTP160 μ mol /L1、Mg2+3.0mmol / L、RAPD标记DNA模板IOng ;反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性lmin, 56°C退火 lmin, 72°C延伸 1.5min, 30 个循环；72°C延伸 5min。
[0022]通过上述方式，本发明得到了酒酒球菌抗酸相关基因的RAH)标记以及基于RAPD标记转化的SCAR标记，上述标记稳定遗传，与抗酸基因连锁。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为抗性菌株和酸敏菌株的筛选结果；
[0024]图2为随机引物的基因池扩增结果；
[0025]图3为随机引物S200在单菌株中的验证；
[0026]图4为RAPD特异片段测序结果；
[0027]图5为引物SAl和SA2的PCR扩增结果。
【具体实施方式】
[0028]在下述实施例和附图中， 申请人:提供了获得本发明RAH)标记以及SCAR标记的具体实验步骤，仅为示意说明，并不限制本发明必须采用下述详细条件。本领域技术人员在了解本发明原理的基础上更改实验条件依旧属于本发明的保护范围。
[0029]本发明的RAPD标记以及SCAR标记获得方法,包括下述步骤:
[0030]一:抗酸菌株和株酸敏菌株的筛选
[0031]以30株酒酒球菌为实验材料(名称如附图1纵坐标所示)，进行抗酸和酸敏菌株的筛选:先配制IL的ATB液体培养基:量取250ml准备好的番爺汁于IL烧杯中，另称取IOg蛋白胨，5g酵母浸出物，IOg葡萄糖,0.2gMgS04 0.05g MnSO4和0.5g盐酸半胱氨酸,加蒸懼水定容到1000mL,用10% NaOH将pH调整至4.8，配好的ATB培养基在沸水中保温30min，12000r / min离心IOmin, 4°C过夜保存,第二天12000r / min再次离心IOmin,然后将培养基的pH调整为4个梯度(用盐酸):3.0、3.2和3.4。所有培养基分装到IOml试管中于高压灭菌锅中灭菌(12rC，20min)。
[0032]所有供试菌株预先在pH4.8的培养基中活化复壮，然后以相同接种量(5X IO7Cfu / ml)接种到不同pH梯度的培养基中，放入培养箱中静置培养，26°C条件下培养4天，测定菌液在600nm下的吸光值，重复3次。通过吸光值的大小差异来筛选抗酸菌株和酸敏菌株，分类标注。经过筛选，共获得7株抗酸菌株，11株酸敏菌株，如表1所示。
[0033]表1抗性菌株和酸敏性菌株
[0034]
【权利要求】
1.酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记，其特征在于所述RAPD标记的序列为序列表1。
2.酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记，其特征在于以权利要求1的酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记采用SCAR引物扩增得到的，SCAR标记的序列为序列表2。
3.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于所用SCAR引物的序列为:SA1:TCTGGACGGACAATATAAGTCA ；SA2: TCTGGACGGAACATTGGGAGAT ?
4.根据权利要求2所述的SCAR标记，其特征在于上述PCR扩增反应的条件为Taq酶1.0U、引物 0.4μπιο1 / L、dNTP160ymol / L、Mg2+3.0mmol / L、RAH)标记 DNA 模板 IOng ;反应程序为94°C预变性5min ;94°C变性lmin, 56°C退火lmin, 72°C延伸1.5min, 30个循环；72°C 延伸 5min。
5.获得酒酒球菌抗酸相关基因的RAPD标记的方法，其特征在于包括下述步骤: 1)以酒酒球菌为实验材料，筛选抗酸和酸敏菌株； 2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因组DNA； 3)基于BSA法与RAPD法，获得与酒酒球菌抗酸相关基因连锁的RAPD标记； 4)回收抗酸性RAPD特异片段，与PMD119-T载体连接后测序得到RAPD标记。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤I)筛选抗酸和酸敏菌株的方法为将菌株活化复壮后以相同接种量接种到不同PH梯度的培养基中静置培养，测定菌液在600nm下的吸光值，通过吸光值的大小差异筛选抗酸菌株和酸敏菌株。
7.根据权利要求5所.述的方法，其特征在于步骤3)首先等量混合抗酸群和酸敏群两个近等位群体的基因组DNA，构建两个近等位基因池；然后采用随机引物对两组基因组DNA进行PCR扩增，筛选出在两个近等位基因池之间能扩增出差异条带的随机引物，在单菌株中验证表现两个基因池差异性的随机引物的特异性；重复上述过程直至筛选出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能稳定扩增的引物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述能稳定扩增的引物序列为S200:TCTGGACGGA。
9.获得酒酒球菌抗酸相关基因的SCAR标记的方法，其特征在于包括下述步骤:&SCAR弓丨物将RAPD标记进行PCR扩增。
【文档编号】C12N15/11GK103468675SQ201310386037
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】刘树文, 李凯, 何玲 申请人:西北农林科技大学