与番茄雄性不育基因ms-7紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用

与番茄雄性不育基因ms-7紧密连锁的indel分子标记及其引物和应用
技术领域
1.本发明属于植物生物技术领域，具体涉及与番茄雄性不育基因ms-7紧密连锁的indel分子标记及其引物和应用。


背景技术：

2.番茄(solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量有所大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。杂种优势是生物界的普遍现象，是改良作物、大幅度提高产量的重要途径。从20世纪初开始，在各种作物中已先后发现了雄性不育现象，并且在生产上利用雄性不育生产杂交种。在一些作物中，如玉米、高粱、水稻等作物上已经取得了较大成就。番茄是自花授粉作物，杂种优势十分明显，杂交种比普通品种增产20％-30％以上，而且整齐度高，抗逆性强。随着番茄高产、优质、抗逆等多目标育种难度的增加，利用杂种互补效应实现番茄产量、品质、抗性等性状的同步突破，已成为番茄育种研究的一个重要发展方向。由于目前番茄雄性不育系利用上尚存在一定困难，生产上大面积推广的杂交种，仍然以人工去雄为主，制种成本过高已成为番茄杂种优势利用的主要限制因素之一。因此，杂种番茄的大规模推广利用仍有待于高效率、低投入的制种方法突破。雄性不育系在蔬菜杂交制种上的应用为番茄杂交种子生产提供了新思路，由于目前番茄雄性不育系在利用上尚存在一定困难，在利用雄性不育系进行育种时，其后代可育株与不育株发生分离。利用分子标记，在幼苗时期鉴别不育株和可育株，解决了原来两用系只有在开花时，才能鉴别不育株和可育株的问题。而一般的不育系其商品性状较差，所以在实际应用中需将雄性不育基因进行转育。但是普通的不育系转育周期很长，要通过杂交、自交各重复多代才可能转育成一个优良的雄性不育系。如何在早期有效地鉴定可育株与不育株，将直接影响其应用价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种与番茄雄性不育基因ms-7紧密连锁的indel分子标记及其引物和应用，旨在应用于番茄雄性不育鉴定及相关的辅助育种中，能够快速有效地进行雄性不育基因型鉴定、转育育种和生产制种，以克服现有技术转育及制种过程中耗时耗力及种子不纯的缺陷。
4.本发明的目的通过下述技术方案实现：通过序列比对，在番茄参考基因组(https://solgenomics.net/organism/solanum_lycopersicum/genome)11号染色体8638522bp的位置获得一个插入/缺失(aggaattataaactctaattcctag)的多态性位点，如seq id no.5所述。
5.根据多态性位点的两侧序列信息，设计了一对适于所述indel分子标记的引物，其上游引物序列如seq id no.3和下游引物序列如seq id no.4所示。
6.所述indel分子标记及其引物可用于番茄雄性不育性状的鉴定及转育育种。
7.利用上述方法进行番茄雄性不育性状的鉴定，其步骤如下：(1)利用高效植物基因组dna提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号：dp305)，提取番茄幼苗叶片的基因组dna；(2)利用所述的上下游引物，以(1)步骤所提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增；(3)将步骤(2)中的扩增产物进行电泳、染色和显影，最终通过所显示片段的大小和位置，判断所属的基因型。
8.进一步地，在上述步骤(3)中判断所属的基因型时，如果扩增出295bp(seq no.1)的一条片段，则该样品的两个等位基因均为ms-7，表型为雄性不育；如果扩增出320bp(seq no.2)的一条片段，则该样品的两个等位基因均为ms-7，表型为雄性可育；如果扩增出295bp和320bp的两条片段，则该样品的一个等位基因为ms-7，表型为雄性不育；另一个等位基因为ms-7，表型为雄性可育。
9.本发明的有益效果是：(一)本发明通过序列比对获得了一个与番茄雄性不育基因ms-7紧密连锁的indel分子标记，此位点位于番茄参考基因组(https://solgenomics.net/organism/solanum_lycopersicum/genome)11号染色体8638522bp处的一个插入/缺失变异，序列的具体变异信息如seq no.1和seq no.2所示；(二)本发明并根据变异位点两端的序列信息，设计了一对特异的indel分子标记引物，其引物序列的具体信息如seq no.3和seq no.4所示；该引物检测简单方便、易于操作、重复性和稳定性俱佳、准确率高，在f2分离群体中其检测准确率高达100％；(三)本发明利用简便的方法和操作步骤，即可在番茄幼苗期快速判断番茄种质材料是否为雄性不育系，为番茄雄性不育的转育育种及生产制种提供了高效的技术支撑，大大缩减了转育周期和制种程序；并为进一步研究雄性不育基因ms-7的生物功能奠定了前期基础。
附图说明
10.图1为番茄雄性不育突变体ms-7与雄性可育野生型ms-7的花器官表型图，其中左边为突变体ms-7的花器官表型，右边为雄性可育野生型ms-7的花器官表型；图2为番茄雄性不育基因ms-7的bsa-seq定位图；图3为番茄雄性不育突变体ms-7，野生型ms-7和部分f2的indel分子标记tmms7检测，其中m为marker，1泳道为ms-7，2泳道为ms-7，3～39泳道为部分f2。
具体实施方式
11.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
12.实施例一：番茄雄性不育基因ms-7的indel分子标记开发，以ms-7的突变体2-089(从番茄遗传中心引进，这是个开放的机构，一般普通研究人员均可申请引进材料)为母本，以其野生型ms-7的品系san marzano(也是从番茄遗传中心引进)为父本，进行杂交，获得f1代，f1代均为雄性可育，f1代自交，获得f2分离群体，其中雄性可育760株，雄性不育256株，分离比例为2.97:1，经卡平方检验符合3:1的孟德尔遗传规律，可知该不育基因为单隐性基因。
13.在f2分离群体中，随机选择30株雄性不育单株，30株雄性可育单株，构建30
×
30的
不育dna池和可育dna池；利用二代测序进行重测序，检测不育亲本、可育亲本、不育池和可育池基因组上的多态性位点；通过关联分析，最终将ms-7基因定位在番茄第11号染色体5.92mb～9.45mb之间的候选区，如图2所示。
14.通过比对亲本基因组序列在候选区的差异，获得一个在8638522bp位置的插入/缺失(aggaattataaactctaattcctag)差异，再根据这个差异的两端序列信息，设计特异性扩增引物(引物序列信息如seq no.3和seq no.4所示)，最终获得indel分子标记tmms7。
15.实施例二：indel分子标记tmms7在番茄幼苗期鉴定其雄性育性的应用提取两个亲本及f2单株的基因组dna，以基因组dna为模板进行pcr反应，pcr反应体系：dna模板1μl，pfu pcr mastermix(2
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)12.5μl，正向引物1μl，反向引物1μl，ddh2o 9.5μl；pcr反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。pcr产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，结果如图3所示。
16.电泳带型统计及判断：若待测单株中只扩增出295bp的一条带，则该单株基因型为aa，可判断为雄性不育；若待测单株中只扩增出320bp的一条带，则该单株基因型为aa，可判断为雄性可育；若待测单株中扩增出295bp和320bp的两条带，则该单株基因型为aa，可判断为雄性可育。统计结果如表1所示，幼苗期分子标记检测结果与田间花期表型鉴定结果完全一致。表1两个亲本和f2单株基因型与雄性不育表型鉴定表
17.indel分子标记tmms7鉴定为aa纯合基因型的9株雄性不育株，花期表型也均为雄性不育；鉴定为aa纯合基因型的11株雄性可育株，花期表型也均为雄性可育株；鉴定为aa杂合基因型的19株雄性可育株，花期表型也均为雄性可育株(表1)。可以看出，本发明indel分子标记tmms7鉴定基因型和表型的准确率为100％。因此，本发明indel分子标记tmms7可用于番茄雄性不育性状的鉴定、辅助育种及制种。