专利名称:一种哈茨木霉菌株的制作方法
一种哈茨木霉菌株技术领域：
[0001]本发明涉及一种菌株，尤其涉及一种具有对多种土传病害有高拮抗的哈茨木霉菌株。
背景技术：
[0002]在当代瓜果蔬菜等植物大规模生产的模式下，由真菌引致的病害已经成了影响植物质量，产量以及保存的主要问题。这些该病原菌是寄主广泛的兼性寄生真菌，他们侵染原十分广泛，它可寄生多种水果、蔬菜与花卉，不仅在植物生长过程中不仅可侵染果梗、新梢与幼嫩叶片，危害花序、幼果和将要成熟的果实，而且还常常因该病菌的潜伏存在，成为储藏、运输、销售期间引起果实腐烂的主要病害。如灰霉病，其是由半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、葡萄孢属Botrytis cinerea pers. ex Fr.侵染引起的,可严重危害植物的生长,保存， 尤其是对于葡萄培养。还如枯萎病(blight亦称疫病)，其由真菌或细菌引致的植物病害， 发病突然，症状包括严重的点斑、凋萎或叶、花、果、茎或整株植物的死亡。生长迅速的幼嫩组织常被侵袭。大多数重要经济作物均受一种或多种疫病感染。疫病可影响花、叶、芽包、 幼苗、小枝、茎(藤)及顶梢。[0003]目前，主要通过定期向农作物喷洒农药的从而抑制植物病害。如安万特作物科学公司生产的普力克杀菌剂，岂可有效通过抑制病菌细胞膜成分的磷脂和脂肪酸的生物合成，抑制菌丝生长、孢子囊的形成和萌发。从而达到防治植物病害的目的。又如公告号 CN13000082C的中国专利提供了一种间苯三酚乙酰基衍生物从而有效防治棉花立枯病、小麦纹枯病、黄萎病等植物病害，还如公开号为CN101305729A的中国专利申请文件提供了一种由代森联和戊唑醇组成的一种防止苹果斑点落叶病、轮纹病复配杀菌组合物；又如公开号为CN101731245A的中国专利申请文件公开了一种以嘧菌环胺与代森联按特定比例的配置的组合物以抑制葡萄灰霉病、苹果斑点落叶病、素材灰霉病等。[0004]然而在使用中，由于农药一般采用较大的毒性以杀灭真菌的方式预防葡萄灰霉病，其制备工艺较为复杂，危险性强。而且对于农产品有一定的危害性，同时也会对于环境造成严重污染。[0005]因而人们常识对于微生物菌种利用，直接抑制引起植物病害的真菌，如公开号为 CN101870959A的中国专利申请文件公开了一种枯草芽孢杆菌，其对于梨轮纹病、葡萄灰霉病、西瓜枯萎病等有显著的防治效果。[0006]还如在研究中发现，木霉菌也具有拮抗微生物病菌的功效，其对于土传植物病原真菌具有强大的抑制效果，但在时间培养中，发现木霉菌产孢量小、其稳定性较差，对于外部环境的适应性较差，因而难以工业化大批量生产。
发明内容
[0007]本发明提供一 种哈茨木霉菌株的筛选方法、以及所述方法筛选得到的哈茨木霉菌株，本发明哈茨木霉菌株的产孢量大，以易于培愈，具有高效防治由真菌引发的植物病害作用。[0008]本发明第一个目的是提供一种哈茨木霉菌株的筛选方法，具体方法如下称取含哈茨木霉菌的土壤样品于水中，在涡旋仪上混匀后进行梯度稀释至10_5，加入到木霉菌选择性培养基表面，均匀涂布，该培养基在25°c静置培养，根据平皿上筛选到的真菌菌落的形态、颜色、大小挑选出木霉菌菌落并转移至PDA培养基，进行纯化、培养。[0009]所述木霉菌选择性培养基配方包括翁304*7!120、腿2 04、1((1、順4勵3、葡萄糖、氯霉素、甲基磺、五氯硝基苯、玫瑰红、琼脂。[0010]最为优选地，本发明木霉菌选择性培养基配方包括=MgSO4 · 7H20 O. 2g/L、KH2PO4O.9g/L、KCl O. 15g/L、NH4N031. Og/L、葡萄糖 3g/L、氯霉素 0. 25g/L、甲基磺 0. 3g/L、五氯硝基苯0. 2g/L、玫瑰红0. 15g/L、20g琼脂。[0011]本发明上述方法筛选的第一种哈茨木霉菌株{Trichodema harizianuni)子中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5202。[0012]上述的哈茨木霉菌株的防治由真菌引起的植物病害中的应用。[0013]上述的哈茨木霉菌株的应用，其中，所述由真菌或细菌引起的植物病害为枯萎病。[0014]采用本发明一种哈茨木霉菌株的优点在于本发明一种哈茨木霉菌株可通过自身产生的真菌细胞壁降解酶如几丁质酶、葡聚糖酶等溶解病原菌细胞壁并渗透进入其细胞中，使病原真菌生长受抑制而死亡而实现病害的防治作用，高效防治由真菌引发的植物病害；而且本发明哈茨木霉菌株易于培育，产孢量大适合工业大批量生产，使用范围广，实用性强。
[0015]图1为本发明哈茨木·霉菌株在PDA培养基上25°C黑暗7d的菌落形态；图2为本发明哈茨木霉菌株的分生孢子梗，瓶梗形态；图3为本发明哈茨木霉菌株的分生孢子形态。
具体实施方式
[0016]本发明哈茨木霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC NO. 5202。其分生孢子阶段为半知菌门，丝孢纲；有性态是属于子囊菌门子囊菌纲。[0017]本发明哈慈木霉菌株筛选方法称取Ig 土样于IOml水中，在涡旋仪上混匀后进行梯度稀释至10_5，取Iml加入到木霉菌选择性培养基TSM表面，均匀涂布，该培养基在25°C静置培养5 7天，根据平皿上筛选到的真菌菌落的形态、颜色、大小挑选出木霉菌菌落并转移至PDA培养基，进行纯化、培养及进一步鉴定。[0018]TSM 培养基配方MgS04 · 7H20 O. 2g/L、KH2PO4 O. 9g/L、KCl 0. 15g/L、NH4NO31. Og/ L、葡萄糖3g/L、氯霉素0. 25g/L、甲基磺0. 3g/L、五氯硝基苯0. 2g/L、玫瑰红0. 15g/L、20g琼脂。[0019]本发明的哈茨木霉菌株的显微形态特性如图1和2所示，本发明哈茨木霉菌株在PDA培养基25°C，黑暗7天条件下培养时，很明显地可以观察到其分生孢子梗复杂分枝，初级分枝几乎呈直角，常2 3个旋涡状排列，向基部逐渐变长整个结构类似金字塔形状。本发明哈茨木霉菌株的瓶梗为安瓿形至亚球星或坛形，经测试，其长度达3. 5^7. 5 X 2. 5^3. 8 μ m,而顶生瓶梗可长达10 μ m,且其基部明显缢缩，中部显著膨大.如图3所示，本发明哈茨木霉菌株的分生孢子亚球形至卵圆形或短的椭球形，多数为长度达1. 7^3. 2X1. 3 2. 5 μ m，而且经观察，其壁光滑很少粗糙半透明至浅绿色。[0020]本发明的哈茨木霉菌株的系统发育学鉴定通过引物ITS4和ITS5扩增ITS1-5. 8S-1TS2区序列，得到1186bp的序列段，通过NCBI GenBank进行比对，与哈茨木霉达到100%的相似度。[0021 ] 1186bp 的 ITS 序列如下TTGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAG GGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCC GGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTT TTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCT TGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCC GGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTGCCTTGGCGGTGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCT CTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATG TTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGG提供采用引物Ef728和Tefl a R扩增Tefl a序列，到1090bp的序列段，通过NCBI GenBank进行比对，与哈茨木霉达到100%的相似度。[0022]1164bp 的 Tefl a 序列如下CATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAACCTTCAACTGATTTTCGCCTCG ATTCTTCCTCTCTTCACATTCAATTGTGCCCGACAATTCTGCAGAGAATTTTCGTGTCGACAATTTTTCATCACCCC GCTTTCCATTACCCCTCCTTTCCAGCGACGCAAATTTTTTTTTCTGTCGTTTGGTTTTTAGTGGGGTTCTCTGTGCA ACCCCACTAGCTCCCTGCTTTTTCCTGCTTCACTCTCACTTCCTCGTCATCATTCAACGTGCTCTGCGTCTTTGGTC ATTCAGCGACGCTAACCACTTTTCCATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTACGCTTGGGT TCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATTGACATTGCTCTGTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGT ACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTCTTCACTAAGTTCATGCTGCAATTGCGGACCAGTGCTAACAGGCAATTCACAG ACGCTCCCGGCCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCCAGGCCGATTGCGCTATCCTCATCATT GCCGCCGGTACTGGTG AGTTCGAGGCTGGTATCTC CCAAGGATGGC培育方法本发明的哈茨木霉菌株的培养条件为在PDA培养基上，于25°C下菌丝生长最快(形态如图1所示)。在PDB培养基内，于30°C下分生孢子的产量最大。在30°C下，由于分生孢子丰富，产孢簇表面常呈颗粒状或粉状；平展产孢区常呈黄绿色，反面无色至暗黄色。[0023]本发明的哈茨木霉菌株，其液体培养法为，每250mL三角瓶中加IOOmL的PDB培养液，每瓶接种孢子悬浮液lmL，在30°C，150r/min下振荡培养，第5天便可收获大量的孢子。 添加体积比为1:1的硅藻土，抽滤干燥备用。[0024]本发明哈茨木霉菌株的产孢量大，而且培育过程中，条件易控制，便于培育。[0025]注PDA培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar (Medium);配方其包括葡萄糖20g,琼脂18g,水(马铃薯煮的汁,过滤)1000ml。[0026]在PDB是液体培养基，在PDA的基础上不加琼脂即可，配方如PDA培养基。[0027]防治植物病害作用效果本发明哈茨木霉菌株通过重寄生性，即通过自身产生的真菌细胞壁降解酶如几丁质酶、葡聚糖酶等溶解病原菌细胞壁并渗透进入其细胞中，使病原真菌生长受抑制、死亡而实现的。因此几丁质酶活是衡量菌株的拮抗能力的重要指标。该菌株的几丁质酶活OD值为O.138。因而本发明哈茨木霉菌株对于真菌细胞具有良好的拮抗能力。[0028]下面我们通过具体实验说明本发明哈茨木霉菌株对于防治植物病害的作用 实施例1 :对辣椒枯萎病的大田防治用哈茨木霉CGMCC No. 5202制剂对辣椒枯萎病进行防治试验方法实验期间共施药3次，第一次定植(2010年04月25日)；第二次开花期(2010年05 月11日);第三次初果期(2010年05月27日)。2010年04月25日定植，当天进行灌根处理，每个灌根500mL的哈茨木霉制剂。[0029]实验条件描述在田间规格、品种及肥水管理等条件一致。且每次施药后当天均无降雨发生，试验期间未进行任何施肥、灌溉和其他病虫害的防治。[0030]数据测试方法病害严重度分级调查。每小区采用随机取样，每点调查20 40株。每小区随机调查五个点，每点查5株，记录病株数、死株数或明显枯萎的植株数。分级方法(按症状类型分级)0级健康无症；1级地上部仅叶、果有病斑；3级地上茎、枝有褐腐斑；5级有褐腐斑 ；7级地上茎、枝与茎基部均有褐腐斑，并且部分枝条枯死；9级全株枯死。调查时间和次数，施药前调查病情基数。采用随机调查法，计算病情指数和防效，用邓肯氏新复极差法测定差异显著性。调查发病病级在最后一次施药后第3天，调查产量，进行对比。[0031]其中，实施例采用本发明哈茨木霉菌株；对比例1:普力克杀菌剂；对比例2 :代森锰锌药剂；对比例3，空白对照不采用任何防治措施。[0032]具体结果对比见表I。[0033]数据分析由表I可以看出，空白对照处理与全部药物处理之间存在显著性差异；这说明所有的药物处理相对空白对照对辣椒枯萎病的防治都有一定防治效果。而且哈茨木霉菌株制剂相对其他对比组，其具有明显的优异效果。[0034]表1，各处理方法对辣椒枯萎病防治效果对比
权利要求
1.一种如权利要求
1所述方法筛选的哈茨木霉菌株Aarizia/w ),其特征在于，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO. 5202。
2.一种如权利要求
1所述的哈茨木霉菌株的在防治由真菌或细菌引起的植物病害中的应用。
3.根据权利要求
2所述的应用，其特征在于，所述由真菌或细菌引起的植物病害为枯萎病。
专利摘要
本发明一种哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)，其中，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5202。本发明一种哈茨木霉菌株可通过自身产生的真菌细胞壁降解酶溶解病原菌细胞壁并渗透进入其细胞中，使病原真菌生长受抑制而死亡而实现病害的防治作用，高效防治由真菌引发的植物病害；而且本发明哈茨木霉菌株产孢量大，易于培育，适合工业大批量生产，使用范围广，实用性强。
文档编号C12R1/885GKCN103045482SQ201110305997
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月11日
发明者旷文丰, 王承芳, 张钰, 王军, 胡曲瑞, 毛伟力 申请人:上海万力华生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan