专利名称：哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于口腔预防医学技术领域，更具体涉及一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制备方法，同时还涉及一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在生物防龋中的用途。
背景技术：
龋病是一种与牙菌斑相关的感染性疾病。变形链球菌(Streptococcusmutans)和茸毛链球菌(Streptococcus sobrinus)是主要致龋菌，其葡糖基转移酶能利用饮食中的蔗糖合成非水溶性葡聚糖。这种葡聚糖因非水溶性和粘附力强等特性，不仅在致龋菌粘附中至关重要，同时使菌斑结构更为致密，妨碍菌斑中所产酸的扩散，促进釉质脱矿，是链球菌致龋的重要毒力因素(Tanzer JM.The microbiology of primary dental caries in humans.J Dent Educ.2001；651028)。
牙菌斑的控制是龋病预防的重要措施，常用的方法有机械法和药物法。机械法主要是刷牙，使用牙签、牙线、专业洁治等。药物法则是利用一些化学药物来去除或抑制菌斑的形成。目前临床上主要使用的化学药物为洗必泰，这种药物具有很好的抗菌特性，可不同程度的降低牙菌斑的致病作用，但长期使用洗必泰可出现牙齿着色，破坏口腔正常菌群等副作用(杨是石四箴主编口腔预防医学及儿童口腔医学人民卫生出版社，1995)。
采用酶制剂控制菌斑的原理是将菌斑细菌之间和细菌与牙表面之间的粘附离解，进而达到瓦解菌斑的目的，可望成为一种科学、安全的生物防龋新方法。早期曾使用蛋白酶，但效果较差。鉴于非水溶性葡聚糖在形成菌斑过程中的重要作用，能特异性水解该糖的非水溶性葡聚糖酶被给予更多的关注，关于它能减少或清除牙菌斑的作用在国外已见报道(Kelstrup J，Holm-Pedersen P，Poulsen S.Reduction of the formation of dental plaque and gingivitis in humans by crudemutanase.J Dent Res 1978；8693)。目前已发现某些链霉菌属，黄杆菌属，假单胞杆菌属，分枝孢子菌属，木霉菌属等能产生非水溶性葡聚糖酶，而在中国，关于非水溶性葡聚糖酶的研究十分有限，非水溶性葡聚糖酶的开发应用尚为空白。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制备方法，该制备方法简单，成本低廉。
本发明还涉及哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在抑制口腔链球菌粘附中的应用。
本发明还涉及哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在防止牙菌斑形成中的应用。
为了实现上述任务，本发明采用了以下技术手段非水溶性葡聚糖酶的制备步骤如下A培养茸毛链球菌Streptococcus sobrinus OMZ176(武汉大学口腔医学院实验中心保存)，在脑心液体培养基(Brain heart infusion broth，BHI，Difco，美国主要成分为每1升中含牛脑浸出液200克，牛心浸出液250克，蛋白胨10克，葡萄糖2克，氯化钠5克，磷酸二钠2.5克)中加入蔗糖至终浓度3％(质量体积百分数W/V)，利用茸毛链球菌Streptococcus sobrinus OMZ176产生的葡糖基转移酶催化蔗糖生成非水溶性葡聚糖。
B以非水溶性葡聚糖为培养基中唯一的碳源，诱导木霉菌产生非水溶性葡聚糖酶，培养基成分为磷酸二氢钾0.25％(W/V)、硫酸铵0.16％(W/V)、尿素0.03％(W/V)、硫酸镁0.03％(W/V)、氯化钙0.03％(W/V)、非水溶性葡聚糖0.25％(W/V)。选择产酶能力最强木霉菌哈茨木霉菌Th。本实验所提供的产酶菌为哈茨木霉菌Th(山东农业大学惠赠，紫外光诱导哈茨木霉产生腐霉利抗性菌株的研究，中国生物防治，2002，18(2)75-78)。C在诱导产酶培养基中培养哈茨木霉菌Th70-74小时，离心除去菌丝，上清液中加入硫酸铵至55％-70％饱和度范围，沉淀，获得非水溶性葡聚糖酶粗提物，培养基成分与上述B相同。
D对已制备的哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的性质研究表明，该酶的最适反应pH值范围在pH5.0～6.5，最佳反应温度为38-42℃。
非水溶性葡聚糖酶生物防龋应用研究步骤如下A通过致龋链球菌蔗糖依赖性黏附实验证明哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶能有效抑制链球菌的黏附。
B使用与龈上菌斑相关的五种国际参考标准菌株形成人工菌斑，应用激光共聚焦显微镜观察非水溶性葡聚糖酶对人工菌斑结构的影响，显示哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶可有效降低菌斑高度，抑制菌斑发育成致密结构。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果与应用药物或蛋白酶制剂控制菌斑的方法比较，使用非水溶性葡聚糖酶控制菌斑效果良好，且不会破坏口腔中的正常菌群的生存，不会引起牙齿着色等副作用。
与其他已报道的产非水溶性葡聚糖酶的微生物相比，本发明提供的哈茨木霉菌Th培养方法简单，且能在短的时间内产生较高的酶活性。
硫酸铵是一种中性盐，对蛋白质有相当好的稳定作用，又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，是有效的盐析工具。应用硫酸氨饱和沉淀法来初步提纯非水溶性葡聚糖酶方法成本低廉，简便易行。
图1非水溶性葡聚糖酶的硫酸铵盐析曲线在不同程度的硫酸铵饱和沉淀中，非水溶性葡聚糖酶活性在50％饱和度以前一直较低，从55％-70％之间迅速升高。
图2pH对非水溶性葡聚糖酶活性的影响示意图在不同pH值条件下检测酶活性，确定哈茨木霉菌Th非水溶性葡聚糖酶的最适pH值是5.5。
图3温度对非水溶性葡聚糖酶的影响示意图在不同温度下检测酶活性，确定哈茨木霉菌Th非水溶性葡聚糖酶的最佳反应温度是40℃。
图4激光共聚焦显微镜观察非水溶性葡聚糖酶对照组72小时人工生物膜的三维结构示意5激光共聚焦显微镜观察非水溶性葡聚糖酶的实验组72小时人工生物膜的三维结构示意图具体实施方式
下面根据附图对本发明做进一步详细描述1.非水溶性葡聚糖制备将保存于-70℃的Streptococcus sobrinus OMZ176(武汉大学口腔医学院实验中心保存)活化后接种于脑心液体培养基中，37℃，85％N2，10％H2，5％CO2厌氧培养18小时。取菌液20ml转接于1000ml脑心液体培养基中，37℃培养24小时。12000rpm离心15min，弃沉淀，将上清液倒至已灭菌的烧杯，加入蔗糖至终浓度3％，叠氮钠至终浓度0.05％，37℃静置培养48小时。12000rpm离心30min，弃上清，将沉淀用无菌蒸馏水洗涤5次，所得物质即为非水溶性葡聚糖。
2.产非水溶性葡聚糖酶菌株的筛选将受试菌木霉菌Trichoderma SP.AF93270(武汉大学中国典型培养物保藏中心保存)，绿色木霉菌Trichoderma viride AF93333(武汉大学中国典型培养物保藏中心保存)，绿色木霉菌Trichoderma virideAF93255(武汉大学中国典型培养物保藏中心保存)，木霉菌Trichodermasp.AF93253(武汉大学中国典型培养物保藏中心保存)，康宁木霉菌Trichodermakonigus.AF93251(武汉大学中国典型培养物保藏中心保存)，哈茨木霉菌Trichoderma harzianum Th(山东农业大学惠赠，)接种到诱导产非水溶性葡聚糖酶的培养基中28℃，300rpm培养。培养基成分为磷酸二氢钾KH2PO40.2％(W/V)，硫酸铵(NH4)2SO40.14％(W/V)，尿素Urea 0.03％(W/V)，硫酸镁MgSO4.7H2O 0.03％(W/V)，氯化钙CaCl20.03％(W/V)，非水溶性葡聚糖0.25％(W/V)。使用Nelson-Somogyi法测定还原糖含量，非水溶性葡聚糖酶酶活性单位定义为每分钟催化底物释放相当于1umol葡萄糖的还原糖所需的酶量(Nelson NJ.A photometric adaptation of the Somogyi method for the determinationof glucose.J Biol Chem 1944；53375-380；Somogyi M.Notes on sugar determination.J Biol Chem1952，19519-23)。每24小时测定培养液中的酶活性，结果表明哈茨木霉菌Th在较短的时间内产生最高的酶活性(72小时，0.071U/ml)(附表1)。
附表1六种受试菌在相同条件下产生最大非水溶性葡聚糖酶的情况
3.非水溶性葡聚糖酶的初步制备选定哈茨木霉菌Th为高产酶菌，在确定的酶活性产生最高的时间(第72小时)提取非水溶性葡聚糖酶。向12个三角瓶内的20ml哈茨木霉菌Th培养液上清液中于4℃在磁力搅拌器上缓慢加入硫酸铵，使其饱和度分别达到20％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，80％，90％。在4℃下静置16小时，12000×g离心30分钟(4℃)，弃去上清，将沉淀用蒸馏水溶解后，测定酶活性，做出酶的硫酸铵盐析曲线(图1)。硫酸铵沉淀中的酶活性在50％以前一直较低，从55％-70％的饱和度间迅速升高，其后保持稳定，所以选择55％-70％作为非水溶性葡聚糖酶盐析的饱和度范围。
哈茨木霉菌在诱导产酶培养基中生长72小时后，离心去除菌丝，上清液用55％-70％的硫酸铵沉淀后，所得沉淀物溶于蒸馏水，于4℃透析24小时，将透析液冷冻干燥成粉末，-70℃保存待用。
4.pH对酶活力的影响底物非水溶性葡聚糖用pH3.0～8.0的缓冲液配制(0.10MNa2PO4～0.05M柠檬酸)。反应体系为0.5ml适当稀释的酶溶液，0.4％非水溶性葡聚糖0.5ml。37℃孵育1小时后，通过Somogyi-Nelson方法测定酶活性。结果表明，非水溶性葡聚糖酶在pH5.0～6.5活力较高，其最适pH为5.5(图2)。
5.温度对酶活力的影响底物非水溶性葡聚糖用0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.5)配制。反应体系为0.5ml适当稀释的酶溶液，0.4％非水溶性葡聚糖0.5ml。37℃孵育1小时后，通过Somogyi-Nelson方法测定酶活性。结果表明，非水溶性葡聚糖酶最适反应温度为40℃(图2)。
6.非水溶性葡聚糖酶对链球菌蔗糖依赖性粘附的影响在含1％蔗糖的脑心液体培养基培养基中加入非水溶性葡聚糖酶，至终浓度为0.5U/ml，0.22um滤孔滤膜过滤除菌，分装至试管中，每支3ml。不含酶的为对照组。每组一式三份。
所有试管中加入50ul来源于同一试管培养18小时的变形链球菌Streptococcus sobrinus OMZ176，变形链球菌Streptococcus sobrinus 6715，变形链球菌Streptococcu smutans MT8148菌液，30°角倾斜培养18小时。(此为第一批试管A试管)取出第一批试管(A试管)，轻微翻转试管3次，将菌液倒入第二批洁净试管(B试管)，所含细菌为粘附细菌。B试管中的菌液4000rpm离心25分钟，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗涤菌细胞两次，洗净培养基，再加3ml磷酸盐缓冲液，涡旋震荡，充分混悬细菌。
从第一批试管(A试管)的无粘附试管侧壁加入3ml磷酸盐缓冲液，涡旋震荡5分钟，将含有细菌的液体转移至第三批洁净试管(C试管)。这些细菌为非紧密粘附的细菌。C试管中的菌液4000rpm离心25分钟，弃上清，再加3ml磷酸盐缓冲液，涡旋震荡，充分混悬细菌。
向第一批试管(A试管)中加入3ml磷酸盐缓冲液超声震荡，使试管壁上紧密粘附的细菌全部震荡下。试管4000rpm离心25分钟，弃上清，再加3ml磷酸盐缓冲液，震荡混匀。
在分光光度计下测定所有试管中细菌的光密度值(OD550)，计算细菌的粘附率，紧密粘附细菌的粘附率＝A/(A+B+C)×100％。
通过实验比较0.5U/ml的非水溶性葡聚糖酶对口腔链球菌粘附的影响，结果发现与不加酶的对照组相比，非水溶性葡聚糖酶明显降低了变形链球菌Streptococcus sobrinus OMZ176，变形链球菌Streptococcus sobrinus 6715，变形链球菌Streptococcu smutans MT8148对玻璃的粘附率(P＜0.01)。(附表2)
附表2非水溶性葡聚糖酶对细菌黏附的影响
*与对照组相比有显著性差异，P＜0.017.非水溶性葡聚糖酶对生物膜形成的影响生物膜实验菌株为武汉大学口腔医学院保存的与龈上菌斑相关的五种国际参考标准菌株，即变形链球菌Streptococcus mutans MT8148，茸毛链球菌Streptococcus sobrinus 6715，血链球菌Streptococcus sanguis 903，福氏杆菌Fusobacterium nucleatumsubsp.polymorphum AT10753，放线菌Actinomyces viscosus ATCC 19246。将保存菌种活化后接种于脑心液体培养基中，37℃厌氧培养16小时，分别调光密度值(OD550)至1.0，取等量细菌混匀备用。将洗净灭菌的盖玻片置于无菌的6孔细胞培养板，加入无菌唾液后室温下缓慢震荡4小时以便在玻片上形成唾液获得性膜。吸干唾液，向每孔加入1mlL唾液，1.5ml含1％蔗糖的脑心液体培养基溶液和200ul细菌混合液。实验组含有非水溶性葡聚糖酶(0.4U/ml)，37℃厌氧培养。每24小时更换新鲜培养液，培养72小时后取样本(各3片)，用二乙酸荧光素(FDA，Sigma，美国30ug/ml)，碘化吡啶(PI，Sigma，美国50ug/ml)进行荧光染色后将本置于激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2，德国)下观察。观察条件氩激光(488/514nm)，物镜×40。测量生物膜表面与膜与盖玻片交界面之间的距离，即为生物膜的厚度。将标本逐层扫描并三维立体重建。实验结果显示72小时对照组生物膜高度达到33.12±3.28μm，细胞密集，结构致密。与此相比，加入非水溶性葡聚糖酶的生物膜高度明显降低(24.49±4.56μm)，有许多散在的细胞团块，结构疏松(图3)，显示非水溶性葡聚糖酶能降低菌斑的高度，使菌斑结构疏松，进而达到瓦解菌斑的目的。这预示该非水溶性葡聚糖酶在龋病的预防中应该具有一定的应用前景。
权利要求
1.一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制备方法，它包括下列步骤A、培养茸毛链球菌，在脑心液体培养基中加入蔗糖，利用茸毛链球菌产生的葡糖基转移酶催化蔗糖生成非水溶性葡聚糖；B、以非水溶性葡聚糖为培养基中的碳源，诱导木霉菌产生非水溶性葡聚糖酶，诱导产酶培养基成分包括磷酸二氢钾0.25％、硫酸铵0.16％、尿素0.03％、硫酸镁0.03％、氯化钙0.03％、非水溶性葡聚糖0.25％，选择菌株哈茨木霉菌Th；C、在诱导产酶培养基中培养哈茨木霉菌Th70-74小时，离心除去菌丝，上清液中加入硫酸铵至55％-70％饱和度范围，沉淀，获得非水溶性葡聚糖酶粗提物；D、确定哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶pH值范围在pH5.0～6.5，反应温度为38-42℃。
2.权利要求1所述的一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在抑制口腔链球菌粘附中的应用。
3.权利要求1所述的一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶在防止牙菌斑形成中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶的制备方法及应用，它包括下列步骤首先是培养茸毛链球菌；其次是在诱导产酶培养中培养木霉菌，诱导木霉菌产生非水溶性葡聚糖酶，选择产酶量最高的菌株哈茨木霉菌Th；第三是在诱导产酶培养基中培养哈茨木霉菌，离心除去菌丝，上清液中加入硫酸铵，沉淀，获得非水溶性葡聚糖酶粗提物；第四是确定哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶pH值范围及反应温度。本发明制备方法简单，成本低廉，哈茨木霉菌非水溶性葡聚糖酶控制菌斑效果良好，且不会破坏口腔中的正常菌群的生存，不会引起牙齿着色等副作用。
文档编号C12N9/46GK1757720SQ20051001913
公开日2006年4月12日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者边专, 甘瑜, 樊明文, 孟柳燕, 李成章 申请人:武汉大学