用于培养和运送细胞的装置的制作方法

专利名称:用于培养和运送细胞的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，更确切地涉及细胞培养领域。本发明涉及用于培 养和运送细胞的一次性装置。本发明提供一种新的一次性装置，其可以用于
支承膜、薄膜或海绵以分离、扩增、运送和/或移植(isolation, expansion, transportation and/or transplantation )细胞。
背景技术：
细胞培养是在实验室条件下使细胞生长并维持细胞存活的过程。此过程 包括从动物或植物中分离细胞，随后在使用用于维持所述细胞基本生物学功 能的人工培养基的实验室装置中使所述细胞生长并且维持所述细胞存活。细 胞培养物源于原代组织外植体或者源于细胞悬浮液。基于分离的细胞的特 性，细胞可以为粘着型或悬浮型。当前己有大规模和小规模培养细胞生长的 多种方法。
己经设计或制造了多种适应维持并运送细胞培养物苛刻需求的装置。
商业可用的细胞培养装置为多种形状和设计，传统形式为培养瓶和培养 皿。培养瓶设置有帽，培养皿可为单个或多孔培养皿，培养皿设置有盖件。
通常可用的单个培养皿包括容纳培养物的底座以及覆盖培养皿的盖件。 培养皿的主要目的在于维持细胞生长。在细胞生长的应用中，从组织分离的 细胞连同用于滋养细胞的营养液一同接种在培养装置中，随后在控制的环境 中培育所述细胞。例如聚苯乙烯的透明材料用于制造细胞培养皿以使得培养 的细胞在显微镜下可见。
对于成功的细胞和组织培养技术来说，污染是主要挑战之一；细胞培养 皿需要设置保护以防止微生物污染。对于培养皿，通常使用已杀菌的皿而使 污染最小化。盖件用于阻挡微生物并且防止培养基的蒸发。在液体培养基中 保持细胞以维持细胞的活性。由于在培养皿中缺少密封会导致污染风险高并 且培养基的溢出会导致细胞死亡，商购培养皿中的活细胞的运送是不可行的。在无菌条件下将特定细胞培养至所需的生长状态以特别用于医疗、科研 或工业的需求。但是，在生长后，必须将这些细胞从它们的生长环境移出， 冷冻保存并且在液氮中运送至所需的中心。在中心处，必须复活并再培养细 胞。此外，在再培养细胞中必需的时间和资源导致明显的延误。不利的运送 条件导致细胞存活性大大降低以及运送的高额费用。
对于用于如皮肤、角膜、软骨等的细胞治疗，需要将细胞运送至移植点。
在移植前使细胞生长为适当薄膜上的单层(如公开号为5,693,332的美国专 利所述)和/或使细胞分化为多层(如公开号为2003/0208266A1的美国专利 所述)，或者将细胞培养在泡沫或海绵上，然后进行移植。基于薄膜的细胞 输送系统的重要因素包括细胞粘着(cell attachment)、细胞活性、细胞密 度和分化控制。在运送期间，由于运动中的剪切、撕拉和/或其他机械力使单 个细胞或单个细胞彼此间的接触造成损伤从而干扰细胞层与薄膜之间的精 密关系，因此破坏了移植物(graft)并使得细胞无法使用。尽管可以在培养 皿中的薄膜上培养细胞，但由于培养皿的结构使得在相同培养皿中进行细胞 的运送是不可行的。
为了克服培养皿的污染，发明了培养瓶。这些培养瓶通常具有培养室、 位于培养瓶一端的小的管状开口以及相对应的封闭端。专利号为4 334 028、 4 851 351以及5 398 837的美国专利描述了多种培养瓶结构的主要宗旨。由 于这些培养瓶需要较大量昂贵的培养基以完全填充，因而培养瓶并不经济有 效。因为膜/薄膜不能放入培养瓶中以生长用于移植的细胞，这些培养瓶也不 适用于在膜/薄膜上培养细胞。
除了上述培养皿和培养瓶，还发明了滚瓶(roller bottle)技术。滚瓶提 供较大的表面积以便细胞粘附和生长。但是，由于与这些滚瓶相关的高剪切 力的存在，此技术仅适用于那些能保持附着在滚瓶壁上的细胞。由于恒定的 高剪切力环境和可能的污染，细胞培养物在滚瓶中的长期维持面临挑战。专 利号为3 450 598的美国专利包括在塑料或玻璃滚管和滚瓶的内表面上附着 并生长细胞。涉及滚瓶的专利包括专利号为5 527 705和4 962 033的美国专 利。专利号为5 010 013的美国专利描述了细胞粘着表面增大的滚瓶的改良 技术，其中滚瓶内表面上添加有波纹状通道。然而，滚瓶技术无法对细胞提 供足够的通气，因此限制了细胞的存活。最近，公开了中空纤维或毛细管作为细胞繁殖的支持基质的用途。专利
号为3 821 087， 3 883 393， 3 997 396， 4 184 822， 4 200 689， 4 206 015， 4 220 725， 4 391 912的美国专利描述了此技术的宗旨，其中公开了用于在半透管 状薄膜或毛细管上进行细胞的体外生长的多种装置和方法。可以首先将细胞 布置在营养培养基中的毛细管壁上。营养素通过毛细管壁从灌注的培养基扩 散出并被细胞利用。细胞产物通过毛细管壁从细胞扩散出进入灌注液中，细 胞产物可以自所述灌注液回收。但是发现，流过中空毛细管的营养培养基抑 制细胞完全穿透毛细管束，并且形成的不合需要的培养基流的梯度导致用于 细胞附着的可用毛细管表面的不完全使用，细胞沿表面分布不均匀。此外， 这些装置需要很高的培养基循环速率以供给细胞足够的氧。这些装置还具有 的缺点是机械装配的复杂性，难以装配并且尺寸过大。
参照现有技术所公开的内容，对于用于培养、扩增并更易于运送细胞培 养物的有效并经济的装置存在持续的需求。
因此，期望的是，提供一种适合于培养并运送附着在薄膜、海绵/泡沬上 的细胞的方法和 一 次性装置。
本发明解决上述缺陷并首次提供一种特殊设计的装置，其为尺寸紧凑、 轻便、商业可行并且易于使用的装置，其具有装载所选薄膜进入装置的结构 (provision)，从而培养细胞并将其运送至受体处以移植用于再生受损组织

发明内容
本发明的目的在于，设计一种用于细胞培养的装置，其对于培养和运送
粘附细胞来说是一次性的、无菌并且安全的。
本发明的目的在于，以防止薄膜起摺的方式设计一种装置。 本发明的装置的环设计成在培养期间保持薄膜的紧张度。 由于例如皿和瓶的现有技术装置不适用于在无菌环境下运送，本发明的
主要目的在于设计一种装置，其在没有微生物污染的情况下便于处理和确保
细胞的运送。
本发明的装置目的在于使用少量培养基。由此本发明的装置为一种经济 有效的装置并且有利于在没有任何溢出的情况下运送细胞。本发明的装置具有垫片以在细胞运送的过程中防止泄漏从而保持细胞 的活性。因此，本发明的装置用作培养细胞和运送细胞的双重目的。
本发明的装置由安全、无毒、生物相容的材料制造，所述材料选自聚乙 烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯。这些医疗等级材料是透明 的，因此允许在显微镜下观察细胞。
本发明的装置设计成能满足最小的空间需求从而使得运送方便并且便且。
本发明的另一个目的在于提供一种装置，其适用于在细胞治疗中用于细 胞的运送。
本发明的装置对于运送细胞来说为商业上有用的装置，其能保持细胞的
活性，在运送后仍可用作移植物(transplant)、植入物(implant)、移植物(graft)。 本发明提供一种一次性装置，其用于培养和/或运送单层或多层细胞。本
发明的一个实施例举例说明了一种方形的培养装置。 所述装置具有两个组件
1) 基板和
2) 顶盖。
基板设置有外壁，所述外壁向下延伸；以及平坦的顶部，所述顶部支 承圆形壳部件，并也向下延伸。与延伸的凹槽相邻的基板中的壳部件具有底 壁、凸缘和从基板的平坦部向下延伸的侧壁。壳部件的深度为与基板的外壁 的深度在同一平面中。在基板的中部的每个壁的底座设置有凹口以固定咬合 件。
所需的薄膜/海绵设置在壳部件的内部并且通过环保持在合适的位置。用 于硅垫片的凹槽恰好在底座组件中壳部件的外部延伸。 本发明的装置的环用于以下多个功能
由例如羊膜或聚合物的生物材料制成的薄膜易于起摺，导致在薄膜上细 胞的不均匀分布。设置的环会确保在接种细胞过程中保持薄膜张紧(即使培 养是装置基本目的的一部分)。
例如壳聚糖/PLA的一些薄膜具有在培养皿中漂浮的趋向，导致细胞直接
接触到壳部件的盖件。设置的环确保薄膜固定至壳部件的底部。
在移植前，通常用缓冲溶液清洗薄膜/海绵以除掉痕量的运送培养基。环的存在确保薄膜不起摺和不损伤细胞。
在医疗设置中通常有利的是，保持这些薄膜张紧从而维持光滑表面，使 得细胞可以均匀地附着并生长以防止由于会导致细胞附着在缝隙中而导致 细胞附着不均匀的薄膜起摺。
描述的方形盖件设置有外壁，所述外壁从顶部向下延伸。盖件的平坦部 设置有孔，所述孔向下延伸。孔的圆形底座与凹槽相邻。设置在盖件中的孔 和凹槽完全匹配在设置在基板构件中的壳部件中并且用作壳部件的盖件。咬 合件设置在盖件的每个壁的中部并装配在基板中的凹口内。盖件的内侧设置 有围绕孔延伸的凸起，所述凸起在闭合装置期间与位于平坦的基板上的圆形 凹槽对准。


图1示出了本发明用于培养/运送在薄膜上的细胞的的组件图；
图2为底座的俯视图；
图3为基板的侧视图；
图4为环的视图；
图5为盖件的侧视图；
图6为盖件的底视图；
图7为凹口的视图；以及
图8为装置完全装配好的视图。
具体实施方式
以下定义在本发明中使用的几个术语。
、用在此处的术语"装置"描述用于细胞培养生长和运送的任何容器、仪 器或器皿。
在本申请的整个说明书中，使用了多种术语，例如"顶"、"底"、"上"、 "下"、倾斜等。这些术语为用于区别不同元件的方便用词。虽然这些术语 是用来说明相对于通常使用的细胞培养装置所在的位置的细胞培养装置，这 些术语不用于限定对于不同元件可以如何使用。对于说明书和权利要求
书来说，用作此处的术语"细胞"表示一个或多 个活细胞、含细胞的聚集体或者有机结构或形成组织的细胞网络，这对于本 领域技术人员是显而易见的。
对于说明书和权利要求
书来说，用作此处的术语"培养基(medium或 media)"表示一种液体溶液，所述液体溶液用于提供足够的营养物(例如 维生素、氨基酸、必需营养物、盐等)和特性(例如渗透压、缓冲性)以保 持细胞存活(或组织中的细胞存活)并维持细胞的生长。
对于说明书和权利要求
书来说，用作此处的术语"薄膜"表示薄片、膜、 泡沫、海绵等。用在本发明中的薄膜可以是生物材料、半合成材料或合成材 料。这些薄膜能易于从装置分离或移除。
用作此处的术语"生物材料"包括但不限于人羊膜、脱细胞真皮 (acellularised dermis)、 小肠黏膜下层(small intestinal submucosal/SIS)薄 膜和/或它们的组合。术语"半合成材料"包括但不限于聚乳酸(Poly Lactic Acid/PLA)、聚羟基乙酸(Poly Glycolic Acid/PGA)、透明质酸(Hyaluronic Acid)和/或它们的组合。
本发明公开内容涉及用于培养可用于移植的细胞的细胞培养装置。
本发明描述的实施例不受限于方形，其还可以是圆形、六边形或三角形。 所述装置包括可模压部件，所述部件由多种医疗级别材料制成，所述材料选 自聚乙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯和聚碳酸酯等。所选材料为透明 的，使得薄膜上培养的细胞可见，并且允许在使用高端显微镜的实验中对细 胞进行检测和摄影。
图1示出了用于在薄膜或海绵/凝胶上培养和/或运送细胞的本发明装置。 装置组件包括以下部件，基板构件(1)，环(2)，硅环(3)和盖件(4)。 具有细胞的薄膜(5)不是装置的一部分。(我认为base和base plate是一回 事，请考虑有没有必要一定区分，最主要是如何选出可区分的合理中文用语。 确定该中文用语后(觉得"底盘"这个词怎么样？)，可作全文替换。另， 如认为其它词有不妥之处，望修改时进行全文搜索并替换。)
图2示出了该装置的基板构件的俯视图，所述基板构件包括壳部件 (housing device) (6)。提供图中可见与壳部件相邻的类似水泡的区域(bleb like region) (7)用于方便更换培养基，其中在不干扰细胞的情况下使用移液管排出培养基或将培养基加至壳部件。水泡部分(bleb portion)也可以用 于在移植前从最终薄膜或海绵中冲洗运送的培养基。类似水泡的区域(bleb like area) (7)确保被隔离(trap)在环以上的区域的空气移入凹槽，由此 确保在装置的壳体部分没有气泡产生。围绕壳部件延伸的凹槽(8)用于固 定硅垫片(silicon gasket)，以确保在运送细胞的过程中保持气密以及防泄 漏的条件。凸缘(9)围绕基板的外壁(10)并且在开启和关闭该装置期间 用作支撑件。图中可见位于每个壁中部的凹口 (11)用于将咬合件(15)固 定至基板。
图3示出了基板的侧视图，其中一起示出了基板的外壁(10)以及凸缘 (9)。壳部件(6)的底座(12)与装置底部的壁(13)的基部在同一平面 中，但是高于凸缘(9)。凹口 (11)设置在底座构件的每个壁的中部，以 闭锁设置在盖件中相应的咬合件(15)。
图4示出了环的视图。环的高度使得环可放置在壳部件内部且可围绕盖 件，位于盖件上的孔(well)的底部与环齐平地布置。环的主要目的在于在 培养和/或运送细胞期间保持薄膜张紧。环的宽度被最小化以保证细胞覆盖更 大的薄膜/海绵面积。
图5示出了顶盖的侧视图。顶盖的设计与基板构件近似，使得在盖件中 的孔(14)与位于壳部件的内部的环齐平。在盖件的每个壁的中部是咬合件 (15)。此咬合件设计成与设置在基板内的凹口 (11)紧密地闭锁。
在图6中可见咬合件的转角(16)用于使咬合件的闭锁和解锁方便。咬 合件(15)的高度从盖件的顶部朝向基板的底座延伸。每个装置设置的咬合 件(15)的数目随板的几何设计而变化，例如三角形装置具有三个咬合件。
在本发明的一个实施例中，底座和盖件包括定位件(orientation feature)， 所述定位件用于将盖件定位在底座上以确保盖件匹配在底座上。在盖件中的 孔与延伸件(extension)邻近，所述延伸件装配在位于底座内的类似水泡的 区域(7)中。在闭合过程中，通过将在盖件中的孔上的延伸部与在壳部件 中的类似水泡的区域(7)对准的方式定位盖件。
图7示出了顶盖的内部视图。图中可见的在盖件中围绕孔(14)的凸起 (17)匹配在硅环上，所述硅环固定在基板的凹槽(8)中。处于该硅环上 的凸起(17)所产生的压力确保将盖件气密以及密封地密闭至该底座。图8示出了装置完全装配好的视图。毛面区域(frosted area) (18)设 置在盖件的外表面上以供用户做标记。
底座、盖件和环可以使用当前技术通常己知的标准模制技术(例如注塑 成型)模制。可以通过标准Y射线或者通过高压灭菌(autoclaving)实现装置的 灭菌。在一些情况下，如在实验室研究的情况下，在完成清洗和灭菌之后可 以再使用装置。
细胞培养装置的使用
为了使用此装置培养细胞，将目的细胞的悬浮液加入到由在壳部件内部 的环支承的薄膜/海绵中。可选地，在凝胶溶液中的细胞的悬浮液可以加入培 养装置。在装置内的凝胶凝结(setting of the gd)之后，能以下述方式培养 细胞。
加入到装置中的培养基的量使得培养基填充设置在环内部的空间。盖件 宽松地设置在基板上，并且在根据环境控制的条件下温育(incubate)装置。 为了更换培养基，提升盖件，逐渐地倾斜基板并且通过移液管的尖端导入到 设置在壳部件内的类似水泡的区域中而排出培养基。可以如上述类似地将新 鲜的培养基加入壳部件。
为了使用本装置运送细胞，可以在将适当的运送培养基加入细胞后运送 在该装置中直接培养的细胞或在另一装置中培养的细胞。硅垫片设置在凹槽 内部并且盖件紧密地夹合至底座以确保气泡不会被圈住(entrap)。本发明 的装置是防泄漏且气密的。带有细胞的此装置可以在适当的运送条件下运送 至受体(recipient)。
在收到细胞时，医师去除咬合件并将运送培养基排出(如以上所述的更 换培养基)。用缓冲溶液冲洗薄膜/海绵，提升环并且将在下方的薄膜/海绵 直接移送到患者。
本发明的装置具有下述特征
其用于提供一种用于细胞培养和运送的一次性并且即用型单个装置。 其可以通过传统高压灭菌或Y射线技术灭菌。
与传统细胞培养瓶或培养皿所需的25ml的量相比，此装置所需的培养 基少于10ml。因此，此装置是经济有效的。
本发明的盖件防止微生物污染并提供用于细胞最优生长的通气。此装置设置的硅垫片可确保气密密封，由此防止在细胞运送期间的泄 漏，从而保持细胞的活性。
为了培养在培养皿中的细胞，没有硅垫片的培养皿可以在普通的二氧化
碳培养箱中温育。这可用作进行气体交换(gas exchange)。此外，此装置的 组成物质为透明材料，所述透明材料使得在试验过程中可以在显微镜下检测 细胞。
由于此装置在清洗细胞后即可提供有用于移植的即用型细胞，因此在移
植过程中不存在延迟。
此装置的设计简单并且占用空间较少，因此减少了货运费。 以上描述了本发明的几个实施例，本领域技术人员可以由此推出多种变
型，变化和改进。这些变型，变化和改进仍在本发明的精神与保护范围内。
权利要求
1、一种用于培养和运送用于治疗目的的细胞的装置，包括i)具有外壁的底座，包括a)细胞壳部件，其具有侧壁和底部，b)用于培养基交换的区域，所述区域与所述壳部件相邻，c)用于硅垫片的凹槽，所述凹槽在所述壳部件外部延伸，d)在底座的每个壁中的至少一个凹口，ii)用于使薄膜保持张紧的环，iii)盖件，其外部尺寸与该底座的尺寸相同，并且该盖件设置的咬合件与在所述底座中的凹口数目相对应。
2、 如权利要求
1所述的装置，其为例如圆形、六边形、方形、三角形或 其他形状的任意形状。
3、 如权利要求
l所述的装置，其包括由注塑成型技术制造的可模制部件，所述可模制部件包括由聚乙烯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、 聚丙烯和/或它们的组合组成的组中所选的透明、无毒、惰性且生物相容的材 料。
4、 如权利要求
l所述的装置，其中所述装置由Y射线和/或高压灭菌进行灭菌。
5、 如权利要求
1所述的装置，其中所述装置为安装附件少、尺寸紧凑、轻便、商业可行并且易于使用的装置。
6、 如权利要求
1所述的装置，其中所述细胞的培养包括a) 提升所述装置的咬合件以分离所述盖件，b) 将细胞装载至由所述壳部件的环支承的所述装置上，c) 培养基充分地填充至设置在所述环内部的空间，以及d) 所述盖件宽松地放置，e) 所述装置在控制的条件下温育以培养细胞。
7、 如权利要求
7所述的用于培育细胞的装置，其中所述细胞可以作为凝 胶溶液中的悬浮液装载至壳部件并且允许凝胶凝结。
8、 如权利要求
7所述的用于培育细胞的装置，其中所述细胞可以作为悬浮液装载在薄膜或海绵上，所述薄膜或海绵随后固定至由所述环支承的所述 壳部件。
9、 如权利要求
1所述的装置，其中所述细胞的运送包括a) 提升所述装置的咬合件以分离所述盖件，b) 将细胞装载至由所述壳部件的环支承的所述装置上， C)填充足够的运送培养基以防止在培养皿内形成气泡，d) 将硅垫片设置在所述凹槽中以确保所述盖件的密封，e) 紧密地固定所述盖件，f) 将所述装置运送至受体。
10、 如权利要求
9所述的用于运送细胞的装置，其中所述具有细胞的薄膜设置在由所述环和硅垫片牢固地固定的所述壳部件中，并且此盖件紧密地咬合至底座；由此将细胞在运送期间受到的损伤减为最小。
11、 如权利要求
l所述的装置，包括确保所述薄膜固定地张紧的可拆卸的 环。
12、 如权利要求
l所述的装置，其中所述装置具有能够装载所选薄膜的结 构，所述薄膜用于培养细胞并将其运送至受体处以移植用于再生受损组织的 细胞。
13、 如权利要求
l所述的装置，其中所述细胞选自一个或多个活细胞、含 细胞的细胞聚集体或有机结构或形成组织的细胞网络。
14、 如权利要求
l所述的装置，其中所述薄膜选自如下组成的组薄片、 膜、泡沫、海绵或它们的组合。
15、 如权利要求
14所述的装置，其中所述薄膜选自如下组成的组生物材料、半合成材料或合成材料。
16、 如权利要求
15所述的装置，其中所述生物薄膜选自如下组成的组人羊膜、脱细胞真皮、小肠黏膜下层薄膜和/或它们的组合。
17、 如权利要求
15所述的装置，其中所述半合成材料选自如下组成的组聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、透明质酸和/或它们的组合。
18、 如权利要求
15所述的装置，其中所述合成材料选自如下组成的组聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯和/ 或它们的组合。
19、 如权利要求
15所述的装置，其中所述薄膜可以是透明的、半透明的 或不透明的，并且任选被涂覆。
20、 如权利要求
l所述的装置，其中所述环的厚度为大约l-4mm。
21、 如权利要求
l所述的装置，其中所述硅垫片的厚度为大约l-2mm。
22、 如权利要求
l所述的装置，其用于维持和运送所选用于医疗目的的薄 膜上的细胞，其基本上如本文所述并参照附图中图1至图8所示。
专利摘要
一种一次性装置用于培养和/或包装并运送在薄膜、凝胶或微型多孔基片上培养的即用型活细胞。所述装置包括限定了用于培养细胞的内部空间的壳体底座(1)。用于培养细胞的待用的薄膜设置在所述壳体底座内部并由环(2)固定。底座由盖件(4)闭合，所述盖件(4)在运送期间保护在下面的细胞并将在培养以及运送期间将使用的培养基的量减为最小。通过设置在装置中的硅垫片(3)以及咬合件防止培养基泄漏。
文档编号C12M1/22GKCN101421388SQ200680053879
公开日2009年4月29日 申请日期2006年11月13日
发明者素提尔·谢诺伊, 迪帕·高希 申请人:利莱恩斯生命科学有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan