多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物Nato3的制作方法

专利名称:多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物Nato3的制作方法
技术领域：
本发明涉及Nato3基因，该基因是多巴胺能神经元增殖祖细胞 (dopaminergic neuron proliferative progenitor cell)的标记物。更具体地,本发 明涉及检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的手段，检测该细胞的方法和检测 该细胞的试剂盒。
背景技术：
多巴胺系统是很重要的系统，它参与对哺乳动物脑而言至关重要的运 动控制、激素分泌控制、情感控制等。因此，多巴胺能神经传递异常会导 致多种神经系统疾病。例如，帕金森氏病是锥体外系统的神经变性疾病， 它是由中脑黑质中多巴胺能神经元的特异性变性引起的(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE Vol. 2 23rd ed., Isselbacher et al. edited by McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp. 2275-7)。
治疗帕金森氏病的方法，即口服L-DOPA (3,4-二羟基-苯丙氨酸)的方法 主要用于补偿多巴胺产量的降低，但已知其疗效并不持久。
因此，为了补偿多巴胺能神经元的损失，最近人们尝试了一种治疗方 法，即移植6-9周龄流产胎儿的中脑腹侧区域，该区域内含有多巴胺能神经 元祖细胞(美国专利5690927; Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1541-8; Freed et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1549-55; Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63; Kordower et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332:1118-24; Defer et al. (1996) Brain 119:41-50; and Lopez-Lozano et al. (1"7) Transp. Proc. 2屮977』0)。然而，目前除了细胞供应和伦理道德问题外 (Rosenstain (1995) Exp. Neurol.33:106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33:1031-7),多种其它问题也已显现，例如，传染性污染的风险、免疫移植 物排斥(Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29:977-80 and Widner and Brudin(1988) Brain Res. Rev. 13:287-324)、因胎儿组织主要依赖于脂质代谢 而不是糖酵解所造成的低存活率(Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33:106)等。例如，为了解决伦理道德或供应短缺问题，已被建议的方法有使用
得自猪的皮质、紋状体和中脑细胞(例如日本专利特许公开号10-508487、 10-508488和10-509034)等。然而，在此方法中，需要经过复杂的程序来修 饰细胞表面抗原(MHCI类抗原)以抑制排斥。例如，为了解决移植物排斥问
特许公开号11-509170、 11-501818; and Sdawly and Cameron (1993) Cell Transplant2:123-9)。移植细胞可能来自MHC匹配的亲属、他人的骨髓、骨 髓库、脐血库等。然而，如果可使用患者自身的细胞，无需额外的程序和 麻烦即可解决排斥问题。
因此，得自非-神经细胞，如胚胎-干细胞(ES细胞)和骨髓基质细胞的多 巴胺能神经元体外分化系统有望被用作移植材料，以替代得自流产胎儿的 细胞。实际上，有报道表明通过将ES细胞移植到大鼠帕金森氏病模型的 损害条紋中，形成了功能性的多巴胺能神经元(Kim et al. (2002) Nature 418:50-56)。据认为，得自ES细胞或患者自身神经干细胞的再生药物的重 要性将会增加。
另一方面，治疗神经组织损伤时，需要重构脑功能，而为了与周围的 细胞形成适当的联接(网络形成)，需要移植的不是成熟细胞，而是可在体内 分化成神经元的祖细胞。然而，在移植神经元祖细胞时，除了存在上述与 供应有关的问题，还存在一个问题，即祖细胞可分化成不均一的细胞群体。 例如，在治疗帕金森氏病时，需要在含有儿茶酚胺神经元中选择性地移植 多巴胺能神经元。以前，有人建议将下述细胞用作移植细胞以治疗帕金森 氏病紋状体(Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46:615-31 and Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:1556-63),得自人胚胎神经的无限增殖化细胞系 (日本专利特许公开号8-509215, 11-506930和2002-522070), NT2Z细胞有 丝分裂后的人神经元(日本专利特许公开号9-5050554),神经元原基细胞(曰 本专利特许公开号11-509729),被外源基因转染以产生儿茶酚胺，如多巴胺 的细胞，骨髓基质细胞(日本专利特许公开号2002-504503和2002-513545), 基因被修饰的ES细胞(Kimetal. (2002) Nature 418:50-56),等等。然而，这 些细胞无一仅含有多巴胺能神经元或能分化成多巴胺能神经元的细胞。
有人建议了 一种从未分化的细胞群体中选择性浓缩或分离多巴胺能神 经元的方法在细胞群体的每个细胞中导入表达荧光蛋白的报道基因，所述基因处于在多巴胺能神经元中表达的基因，如酪氨酸羟化酶(TH)基因的 启动子/增强子的控制之下，分离发出荧光的细胞，籍此用肉眼观察活的多
巴胺能神经元，以进行浓缩、分离或鉴定(日本专利特许公开号2002-51775)。 然而，该方法需要复杂的导入外源基因的步骤，此外，当用于基因治疗时， 报道基因的存在会导致毒性和免疫原性的问题。
如上所述，目前，移植治疗帕金森氏病的最大问题之一是多巴胺能 神经元祖细胞无论是得自流产胎儿的中脑腹侧区域，还是经诱导后分化的， 皆为多种细胞的混合物。考虑到神经网络形成的安全性，仅分离和使用所 需的细胞种类才是合乎需要的。另外，考虑到存活力或在移植了细胞的脑 中正确形成网络的能力，可以说分离和移植较早的增殖祖细胞会获得合意 的治疗效果。
以前，有人报道过在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的基因 Lrp4(WO 2004/065599)。另外， 一些多巴胺能神经元祖细胞的标记物也已被 报道(WO 2004/038018和WO 2004/052190)。其中，关于Lmxla,已证实它 表达于人和小鼠的多巴胺能神经元增殖祖细胞，有丝分裂后的多巴胺能神 经元前体纟田胞(postmitotic dopaminergic neuron precursor cell)和多巴胺能神 经元(WO 2005/052190)。
另外，Nato3基因是具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的转录因子，据报道 Nato3基因在中脑中表达，在发育过程中起着重要作用(Segev, E., N. Halachmi， A. Salzberg, and N. Ben-Arie. 2001. Mech Dev 106:197-202)。此外， 有人报道Nato3在中脑中表达，特别是在最腹侧部位(底板)中表达，并与神 经细胞的分化有关(Verzi, M. P., J. P. Anderson, E. Dodou， K. K. Kelly, S.B. Greene, B. J. North, R. M. Cripps, and B. L. Black. 2002. Dev Biol 249:174-90)。
然而，无人报道Nato3在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达。
发明简述
最近，本发明人发现Nato3基因(下文中有时也将其简称为"Nato3")在多 巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达。本发明基于此发现。
本发明的目的是提供检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的手段，检测多 巴胺能神经元增殖祖细胞的方法和检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂此外，本发明的目的是提供筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生 成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程。
另外，本发明的目的是提供产生可用于治疗帕金森氏病的多巴胺能神 经元增殖3且细力包的方法。
本发明提供了可用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷
酸探针或多核苷酸引物，它们可与由Nato3基因的核苷酸序列组成的多核苷 酸，或其互补序列杂交(下文有时也称之为"本发明的探针，，或"本发明的引 物")。
本发明提供了可用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的抗 Nato3蛋白的抗体或其部分(下文有时也称之为"本发明的抗体")。
本发明还提供了检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，其包 括检测Nato3基因表达的步骤(下文有时也称之为"本发明的检测方法，，)。
本发明还提供了检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其 至少包含本发明的探针，本发明的引物或本发明的抗体。
本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神 经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法包括检测Nato3基因表达的步骤。
本发明提供了产生可用于治疗帕金森氏病的多巴胺能神经元增殖祖细 月包的方法。
本发明提供了多核苷酸用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的 用途，所述多核苷酸可与由Nato3基因的核苷酸序列组成的多核苷酸，或其 互补序列杂交。
本发明提供了抗Nato3蛋白的抗体或其部分用于检测或选择多巴胺能 神经元增殖祖细胞的用途。
本发明的探针，本发明的引物，和本发明的抗体可用作多巴胺能神经 元增殖祖细胞的选4争标记。因此，本发明对于移植材料的纯度^r测，以及 开发体外诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程的方法等十分有 用，本发明有望促进再生医疗的实际应用。
附图筒述

图1显示了与多巴胺能神经元相关的标记基因的表达时期。
图2显示了 12.5-曰龄小鼠胚胎的中脑。沿着背腹轴将中脑分成四个区域(V:最腹侧区域，VL:腹侧区逸DL:背侧区域，D:最背侧区域)。
图3显示了通过RT-PCR法，分析Nato3， DAT, Lmxla和Lip4在中脑各个区域 中的mRNA表达的结果。
图4显示了通过原位杂交，分析Nato3,Nuni和TH在11.5-日龄小鼠胚胎中 脑中的mRNA表达的结果。点^^示产生多^肯M申^iL的区域，破折号^4示VZ (脑室区)和ML (套层)之间的分界。
图5显示了通过免疫染色法，分析Nato3, Lmxla和Nurrl在11.5-日龄小鼠 胚胎中脑中的蛋白质表ii^^^表超双染色)的结果。点线表示产生了多e^肯a申经 元的区域，破折号l汰示VZ (脑室区)和ML (套层)之间的分界。
图6显示了通过RT-PCR法,分析Nato3和其它多巴胺能神经元标记基因 在由ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元祖细胞中的表达结果。
图7显示了通过细胞分选仪分离Lip4阳性细月M口阴性细胞。
图8显示了通过RT-PCR法,分析Nato3和其它多巴胺能神经元标记基因 在每个多巴胺能神经元增殖祖细胞中的表达结果，所述细胞分离自由12.5-曰龄小鼠胚胎(E12.5)的中脑获得的细胞和SDIA分化诱导细胞。
发明详述
下文将要详细解释本发明。以下描述是解释本发明的例子，本发明并 不局限于所描述的实施方案。本说明书中使用的所有技术术语、科技术语 和术语学与本发明所属技术领域：
的普通技术人员通常所理解的含义相同，
它们仅用于解释具体的实施方案，而不会对其构成限制。只要不背离本发 明的精神，本发明可在不同的实施方案中被实施。本说明书中提及的所有 现有技术文献、公开出版物、专利出版物和其它专利文献皆以参考文献的 形式被引入本说明书中，可用于实施本发明。 [多巴胺能神经元增殖祖细胞]
身为本发明中被检测或选择的目标的"多巴胺能神经元增殖祖细胞"指 的是有丝分裂停滞前的多巴胺能神经元祖细胞。
经过增殖祖细胞和有丝分裂后前体细胞的分化阶段，多巴胺能神经元 由神经上皮细胞分化为成熟的多巴胺能神经元。多巴胺能神经元增殖祖细 胞是多巴胺能神经元中最早的祖细胞，因此，预期可获得高存活力，并在 移植了细胞的脑中获得网络形成的高能力。因此，多巴胺能神经元增殖祖细胞可用于移植疗法，以治疗因多巴胺能神经元变性使多巴胺减少而导致 的疾病，如帕金》兔氏病。
使用本发明的探针、引物或抗体作为指标选择的细胞是有丝分裂停滞 前的多巴胺能神经元增殖祖细胞，因此，从安全性、存活率和网络形成能 力方面考虑，与常规的混合细胞群体或导入外源基因的多巴胺能神经元增 殖祖细胞相比，本发明的多巴胺能神经元增殖祖细胞可优选用于神经变性 疾病，如帕金森氏病的移植治疗。细胞是有丝分裂停滞前的多巴胺能神经 元增殖祖细胞，即为处于增殖过程中的细胞，其具有在脑中的大多数合适 的位置分化为成熟细胞的可能性，另外，多巴胺能神经元祖细胞也具有在 体内增殖的可能性，因此，预期可获得较长期的治疗效果。因此，可以认 为本发明为神经变性疾病，如帕金森氏病的有效移植治疗的实际应用铺平 了道路。
本发明的探针和引物可与Nato3基因特异性杂交。如上所述，Nato3基 因的表达可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞的指标。因此，本发明的探针 或引物可用作;险测多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物。
本发明的探针和引物可用于检测Nato3基因的表达，相当于由多个碱基 或石成基对，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)组成的聚合物。已知双 链cDNA也可用于组织原位杂交，本发明的探针和引物包括该双链cDNA。 用于检测组织中的RNA的特别优选的探针和引物可以是例如RNA探针(核 糖核酸探针)。
本发明的探针和引物包括由含有Nato3基因核苷酸序列的至少10个， 优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个连续核苷酸的序列的 多核普酸，或其互补序列组成的探针和引物。本发明的探针和引物也包括 由含有Nato3基因核苷酸序列的10-50或10-30, 15-50或15-30, 20-50或 20-30,以及25-50或25-30个连续核苷酸的序列的多核苷酸，或其互补序 列组成的探针和引物。
本发明的探针和引物的长度可以至少为10个碱基，优选至少为15个
碱基，更优选至少为20个碱基，更优选至少为25个碱基。本发明的探针
和引物的长度也可以为10-50个碱基或10-30个碱基，15-50个碱基或15-30
个碱基，20-50个碱基或20-30个碱基，以及25-50个碱基或25-30个碱基。本发明探针和引物的优选实施方案提供了长度为15-30个碱基的探针 和引物，用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞，所述探针和引物由
含有Nato3基因核苷酸序列的至少IO个(优选至少15个，更优选至少20个， 更优选至少25个)连续核苷酸的序列的多核苷酸，或其互补序列组成，并能 与Nato3基因杂交。
本发明探针和引物的优选实施方案提供了可与Nato3基因核苷酸序列 的高辨别部分杂交的探针和引物。使用该探针和引物，可以较高的准确度 检测到增殖祖细胞。所述探针和引物包括可与含有选自SEQ ID NO:l的核 苷酸1-365和534-640、 SEQ ID NO:3的核香酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5 的核苷酸1-306和475-501、 SEQIDNO:7的核香酸1-377和546-886、 SEQ ID NO:9的核苷酸1-312和481-507、 SEQ ID NO:ll的核苷酸1-306和 475-501、 SEQ ID NO:13的核苷酸1-306和475-501、 SEQ ID NO:15的核苷 酸1-177和346-372、 SEQ ID NO: 17的核苷酸1-359和528-557、 SEQ ID NO: 19 的核苷酸1-357和523-552的核苷酸序列的部分或全部的核芬酸序列杂交的 探针和引物。
本发明的探针可在^r测感兴趣基因的已知方法，如northern印迹法、 southern印迹法、原位杂交法等中用作根据一般方法的探针。
可根据本说明书中公开的核苷酸序列，化学合成本发明的探针。探针 的制备方法是众所周知的，可根据例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed."(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))进行制备。
本发明的引物也可用作由两种或多种引物组成的引物套。
本发明的引物和引物套可在利用核酸扩增法，如PCR法、RT-PCR法、 实时PCR法、原位PCR法或LAMP法检测感兴趣基因的已知方法中用作 根据一般方法的引物和引物套。
可选择本发明的引物套，以使通过核酸扩增法可扩增出Nato3基因的核 苷酸序列。核酸扩增法是众所周知的，核酸扩增法中引物对的选择也是本 领域技术人员可以理解的。例如，在PCR法中，可选择引物，以使两个引 物(引物对)中的一个与Nato3基因双链DNA的正链配对，另一个引物与双 链DNA的负链配对，由一个引物延伸的链可与另一个引物配对。另外，在 LAMP法(WO 00/28082)中，关于耙基因，从3，末端一侧，限定了三个区域F3c、 F2c和Flc,从5，末端一侧，限定了三个区域B1、 B2和B3，通过使 用这六个区域，可设计四种引物。
可根据本说明书中公开的核苷酸序列，化学合成本发明的引物。引物 的制备方法是众所周知的，可根据例如"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed."(Cold Spring Harbor Press (1989))和"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997))进行制备。
在本发明中，"Nato3基因"是多巴胺能神经元增殖祖细胞存在的指标， 已知其存在于人、小鼠、大鼠、黑猩猩、狗、牛、鸡等中。公开各个序列
的GenBank登录号如下。 Nato3基因
人NM一152898 (SEQIDNO:l (碱基序列)，SEQ IDNO:2 (氨基酸序列)， 下文中以相同的次序表示)，AF517122 (SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4), BC069147(SEQIDNO:5， SEQIDNO:6)， AF369897 (与BC069147相同)
小鼠NM—033522(SEQ ID NO:7 ， SEQ ID NO:8) ， AF517121(与 NM一033522相同)，AF369896(SEQ ID NO:9， SEQIDNO:IO)
大鼠XM—345658(SEQIDNO:11, SEQIDNO:12)
黑猩猩XM_527676(SEQIDNO:13， SEQIDNO:14)
狗XM—539457(SEQIDNO:15， SEQIDNO:16)
牛XM—584097(SEQIDNO:17, SEQIDNO:18)
鸡XM_425989(SEQIDNO:19, SEQIDNO:20)
至于除上述动物外的动物(优选哺乳动物)，本领域技术人员可以基于已 知的全长Nato3基因序列，详细列出其固有的Nato3基因序列。例如，通过 基于人或小鼠Nato3基因的同源性检索，可检索并鉴定出动物的Nato3基因。 在同源性4全索中，可使用下文描述的BLAST等。
Nato3基因包括
编码人Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由选自SEQIDNO:2、 SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一个氨基酸序列组成；
编码小鼠Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO: 10的至少 一个氨基酸序列组成；
编码大鼠Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:12的氨基酸 序列组成；编码黑猩猩Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:14的氨基 酸序列组成；
编码狗Nato3蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQ ID NO:16的氨基酸序 列组成；
编码牛Nato3蛋白的多核苷酸，所述蛋白由SEQIDNO:18的氨基酸序 列组成；和
编码鸡Nato3蛋白的多核香酸，所述蛋白由SEQIDNO:20的氨基酸序 列组成。
此外，Nato3基因包括
含有选自SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的至少一个人
Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的至少一个小鼠Nato3基因
DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:ll的大鼠Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQIDNO:13的黑猩猩Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO: 15的狗Nato3基因DNA序列的多核苷酸；
含有SEQ ID NO: 17的牛Nato3基因DNA序列的多核苷酸；和
含有SEQ ID NO: 19的鸡Nato3基因DNA序列的多核苷酸。
本发明的Nato3基因包括编码与Nato3蛋白功能等同的蛋白质的基因。
通过评价与Nato3基因的表达相关的生物学现象或功能，例如，通过评价基
因是否在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达，即可测定基因是否为 "功能等同的"基因。
此外，当编码氨基酸序列(如SEQIDNO:2的氨基酸序列)的基因具有多
态性时，与Nato3蛋白功能等同的蛋白质包括具有多态性的蛋白质。 编码与Nato3蛋白功能等同的蛋白质的基因包括 编码Nato3蛋白(例如SEQ IDNO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:8的氨
基酸序列)经一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失，或在氨基酸序列
的 一端或两端添加所得的氨基酸序列(经修饰的氨基酸序列)的基因；
在严紧条件下与编码Nato3蛋白氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2的氨基
酸序列和SEQIDNO:8的氨基酸序列)的基因杂交的基因；和
编码与Nato3蛋白氨基酸序歹'](例如SEQ IDNO:2的氨基酸序列和SEQIDN0:8的氨基酸序列)具有至少70°/。或更高同一性的氨基酸序列的基因。
在本说明书中，"经一个或多个氨基酸残基的插入、取代或缺失，或在 氨基酸序列的一端或两端添加"指的是通过众所周知的技术方法，如定点诱 变或通过在自然产生的程度下取代多个氨基酸而进行的修饰。
Nato3蛋白经修饰的氨基酸序列可以是如下所述的氨基酸序列，其中 1-30，优选1-20,更优选1-9,更优选1-5,特别优选1或2个氨基酸被插 入、取代或缺失，或在氨基酸序列的一端或两端被添加。优选经修饰的氨 基酸序列可以是在Nato3蛋白的氨基酸序列中具有一个或多个(优选一个或 几个，或1， 2, 3或4个)保守取代的氨基酸序列。
术语"保守取代"指的是一个或多个氨基酸残基被其它化学类似氨基酸 残基所取代，但实质上不会改变蛋白质的活性。例如，某个疏水残基被另 一个疏水残基取代的情形，某个极性残基被另 一个具有相同电荷的极性残 基取代的情形。对每个氨基酸而言，可按照此方式被取代的功能类似的氨 基酸是本领域已知的。具体例如非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸。极性(中性) 氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸。带正电(碱性)的氨基酸包括精氨酸、祖氨酸和赖氨酸。另外，带负 电(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本说明书中，"杂交"指的是在严紧条件下与靶多核苷酸杂交。具体地 说，例如，当使用缺省参数(最初的设置)，用同源性;f全索软件，如FASTA， BLAST, Smith-Waterman [Meth. Enzym., 164, 765 (1988)]进行计算时，与靶核 苷酸序列具有的同一性为至少70%或更高，优选80%或更高，更优选85% 或更高，更优选90%或更高，更优选95%或更高，特别优选98%或更高， 最优选99%或更高的多核苷酸。另夕卜，"在严紧条件下，，可根据本领域技术人 员通常使用的在杂交緩冲溶液中进行反应的方法来进行，以使温度为 40-70。C,优选为60-65°C，并在盐浓度为15-300 mmol/L,优选为15-60 mmol/L的漂洗溶液中进行洗涤。可根据所用探针的长度适当调整温度和盐 浓度。另外，洗涤杂交核苷酸的条件可以是0.2或2xSSC, 0.1%SDS，温度 为20-68°C。至于控制严紧条件(高严紧度)或温和条件(低严紧度)，洗涤时 的盐浓度或温度即可提供差异。当由盐浓度提供杂交差异时，可使用严紧 的洗涤緩冲液(高严紧度洗涤緩冲液)0.2xSSC和0.1。/c) SDS,以及温和的洗涤緩冲液(低严紧度洗涤缓冲液)2xSSC和0.1% SDS。另外，当由温度提供 杂交差异时，严紧条件下的温度为68。C,中度严紧条件下的温度为42°C, 温和条件下的温度为室温(20-25。C)，每种情形都可在0.2xSSC和0.1°/。 SDS 中进行。
一般说来，在与杂交相同的条件下进行预杂交。然而，不局限于在相 同条件下进行杂交和初步洗涤。
可根据已知方法进行杂交。另外，在使用商购的文库时，可根据所附 使用说明中描述的方法进行杂交。
在本说明书中，与氨基酸序列有关的术语"同 一性"(有时也称之为同源 性)指的是在被比较的序列之间，各个序列的氨基酸残基的同一性水平。此 时，要考虑缺口的存在和氨基酸的特性(Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730(1993))。为了计算同源性，可使用BLAST(Altschul: J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))、 FASTA (Peasron: Methods in Enzymiology 183:63-69 (1990))等。
与Nato3蛋白氨基酸序列的同一性至少为70%或更高的氨基酸序列可 以是同一性优选为80%或更高，更优选为85%或更高，更优选为90%或更 高，更优选为95%或更高，特别优选为98%或更高，最优选为99%或更高 的氨基酸序列。
"同一性，，可以是使用本领域技术人员已知的同源性检索程序计算出的 凄M直，通过例如4吏用NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 同源't"生算法BLAST(Basic local alignment search tool) http:www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/中的缺省参数(最初的设置)即可计算同一性。
本发明的抗体可特异性识别Nato3蛋白。如上所述，Nato3基因的表达 可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞的指标。因此，本发明的抗体可用作检 测多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记物。
用于获得本发明抗体的Nato3蛋白可具有Nato3的抗原性，其包括在 Nato3蛋白氨基酸序列中进行一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、取代或 添加所得的蛋白质。已知在这种蛋白质中，会维持与原始蛋白质相同的生 物活性(Mark et al. (1984) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500; Wang et al. (1984) Science224:1431-3; and Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13)。缺失、插入、取代或添加一个或多个氨基酸残基，而能在蛋 白质中维持原始蛋白质的抗原性的方法是已知的。例如，编码突变蛋白质
的多核苷酸可通过定点诱变的方法来制备，并能被适当表达(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); Sections 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152:271-5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154:350-67; and Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6)。
本发明的抗体包括特异于Nato3蛋白的一部分的抗体。具体地说，用于 获得本发明抗体的Nato3蛋白包括具有Nato3蛋白的至少6个或更多个氨基 酸残基(例如6， 8， 10， 12或15个或更多个氨基酸残基)的多肽片段，以及具 有全长氨基酸序列的多肽。本说明书中Nato3蛋白的多肽片段包括每一个片 段，只要该片段具有Nato3蛋白的抗原性即可。
优选的片段包括多肽片段，例如Nato3蛋白的氨基末端或羧基末端。通 过分析蛋白质氨基酸序列的疏水性/亲水性的方法(Kyte-Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-22),或分析二级结构的方法(Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:251-76)估计多肽的抗原决定簇位点，再通过计算机程序 (Anal. Biochem. 151:540-6 (1985))或合成短肽并证实抗原性的技术，如 PEPSCAN法(日本专利特许公开号60-500684)进一步证实该位点。
抗Nato3蛋白的抗体包括
抗具有选自SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的至少一个氨 基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；
抗具有选自SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的至少一个氨基酸序列的蛋
白质或其部分的抗体；
抗具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有SEQ IDNO:14的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体； 抗具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体；和 抗具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的蛋白质或其部分的抗体。 本发明抗体的优选实施方案提供了可识别Nato3蛋白的高辨别多肽部分的抗体。使用该抗体，可以较高的准确度检测到增殖祖细胞。所述抗体
包括抗Nato3蛋白的高辨别多肽部分的抗体，所述多肽部分例如可为选自 SEQ ID NO:2的氨基酸1-102和159-166， SEQ ID NO:4的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:6的氨基酸1-102和159-166， SEQ ID NO:8的氨基酸 1-104和161-168, SEQ IDNO:IO的氨基酸1-104和161-168， SEQIDNO:12 的氨基酸1-102和159-166, SEQIDNO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO: 16的氨基酸1-59和116-123， SEQ ID NO: 18的氨基酸1-101和 158-164, SEQ ID NO:20的氨基酸1-119和176-183中的至少6个氨基酸残 基或全部氨基酸序列。
通过使用本领域技术人员众所周知的方法，例如"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987) and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane， Cold Spring Harbor Laboratory (1988)，也 可获得本发明的抗体。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体 (scFv)、人源化抗体、多特异性抗体和抗体片段，如Fab,Fab，，F(ab，)2,Fc和 Fv。
对于多克隆抗体而言，抽取经过抗原致敏的哺乳动物的血液，通过已 知方法从血液中分离出血清，用作含有多克隆抗体的血清。
根据需要，也可以进一步分离含有多克隆抗体的级分。
对单克隆抗体而言，提取从经过上述抗原致敏的哺乳动物的脾脏或淋 巴结中获得的能产生抗体的细胞，并将所述细胞与骨髓瘤细胞融合。对所 得杂交瘤进行克隆，从培养物中收集抗体以用作单克隆抗体。
可将Nato3蛋白的片段用作免疫抗原。或者，可使用基于上述氨基酸序 列合成的抗原。抗原可以以与载体蛋白形成复合物的形式来使用。为了制 备抗原与载体蛋白的复合物，可使用多种凝聚剂(condensation),如戊二醛、 碳二亚胺、马来酰亚胺-活化的酯等。载体蛋白可以是常用的那些，如牛血 清白蛋白、曱状腺球蛋白、血蓝蛋白等， 一般以1-5倍量进行连接。
被免疫的动物包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。注射方法包括皮下、 肌肉或腹膜内给药。给药时，抗原可与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混 合。 一般每2-5周给药一次。
将得自经免疫动物的脾脏或淋巴结的能产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，并分离杂交瘤。可使用得自小鼠、大鼠或人的骨髓瘤细胞， 优选其与产生抗体的细胞源自相同物种，但源自不同物种的细胞有时也是 可以的。
可根据先前已知的方法，例如Nature, 256, 495， 1975中公开的方法进行 细月包融合。
融合促进剂包括聚乙二醇或仙台病毒，通常，在20-40。C，优选30-37。C， 使用浓度约为20-50%的聚乙二醇(平均分子量为1000-4000),反应约1-10 分钟，使抗体生成细胞的数目与骨髓瘤细胞的数目之比大致约为1:1-10:1， 以进行细胞融合。
为了筛选产生抗体的杂交瘤，可使用多种免疫化学方法。例如，使用 包被Nato3蛋白的微滴板进行ELISA,使用包被抗-免疫球蛋白抗体的微滴 板进行EIA,以及将含Nato3蛋白的样品电泳之后使用硝酸纤维素转移膜进 4亍免疫印迹。
通过例如有限稀释法从所述孔中进行进一步克隆，籍此获得克隆。一 般在添加了 HAT(次黄。票呤、氨基蝶呤和胸苷)的含有10-20%牛胚胎血清的 动物细胞培养基(例如RPMI1640)中进行杂交瘤的选择和培养。将按上述方 法获得的克隆移植到预先施用过pristine的SCID小鼠的腹腔中，10-14天后， 收集含有高浓度单克隆抗体的腹水液以用作纯化抗体的材料。另外，培养 克隆，培养物也可以是纯化抗体的材料。
为了纯化单克隆抗体，可使用先前已知的纯化免疫球蛋白的方法，所 述纯化可通过例如石克酸铵分级分离法、PEG分级分离法、乙醇分级分离法、 使用阴离子交换剂、使用Nato3蛋白进行的亲和层析等容易地进行。
可按类似方法，从血清中纯化多克隆抗体。
Nato3基因的表达可用作多巴胺能神经元增殖祖细胞存在的指标。因 此，根据本发明，通过检测Nato3基因的表达，即可检测或选择多巴胺能神 经元增殖祖细胞。
对本文所用的"检测Nato3基因表达，，的方法没有特别的限制，只要它能 检测待测试细胞样品中的Nato3基因表达即可，例如，所述方法包括杂交法、 核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本文所用的"待测试细胞样品，，可以是据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞样品，可以使用中脑腹侧区域的细胞。通过已知方法可获得
中脑腹侧区域的细胞(Studer, L" et al. Nature Ne腦sci (1998) 1:2卯-295)。优 选将胎儿(优选人流产胎儿)或患者本人中脑腹侧区域的细胞用作待测试细 胞样品。另外，可将培养物细胞用作待测试细胞样品，所述培养物细胞中 含有在体外能被诱导分化的多巴胺能神经元增殖祖细胞。通过将已知的ES
细胞(Kawasaki et al. Ne腸n (2000) 28(1):31-40 and Lee， SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)、骨髓基质细胞、得自神经的无限增殖化细胞系 (曰本专利特许公开号8-509215, 11-506930和2002-522070)、神经元原基细 胞(日本专利特许公开号11-509729)等用作起始材料，用已知方法进行分化 处理即可体外诱导其向多巴胺能神经元增殖祖细胞分化，所述方法如SDIA 法(Kawasaki et al. Neuron (2000) 28(1):31陽40)或5-阶4爻法(Lee, SH., et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。优选将用SDIA法进行分化处理的ES细 胞用作待检测细胞样品。
通过在无血清培养基中共培养ES细胞和基质细胞系PA6来进行本文所 用的"SDIA法，，(Kawasakietal. Neuron (2000) 28(1):31-40)。另外，可按下述 进行"5-阶段法"。在存在血清时，在非-贴壁的培养板上培养ES纟田月包，籍此 形成胚状体(embryoid body, EB),随后，将EB粘附在贴壁培养板上，籍此 选^^神经元祖细胞。最后，在其中加入生长因子，如Shh、 FGF2或FGF8， 从而诱导多巴胺能神经元祖细胞(Lee, SH.， et al. Nature Biotech (2000) 18:675-579)。
根据本发明检测方法的第 一 个实施方案，本发明的探针与核酸样品 (mRNA或其转录物)杂交，检测杂交复合物，即核苷酸双链。因此，可检测 细胞样品中的Nato3基因表达。
关于杂交方法的详细程序，可参考"Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.，，(Cold Spring Harbor Press (1989)，特别是第9.47-9.58节， "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997)),特 另ll是第6.3和6.4节,"DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995),特别是与条件有关的第2,10节)。
可通过例如下述步骤，利用杂交法检测Nato3基因的表达
(a)使得自待测试细胞样品的多核苷酸与本发明的多核苷酸探针接触；
和(b) 检测杂交复合物。
在步骤(a)中，可将由据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试 细胞样品制备的mRNA，或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)用作得自 待测试细胞样品的多核香酸，进而与探针接触。
在使用探针的检测方法中，可标记探针。标记物包括利用放射性(如"P， "C和35S)、荧光(如FITC、铕)、酶(如过氧化物酶或^ 成性磷酸酶)反应，如 化学显色等的标记物。
使用众所周知的方法，如northern杂交、southern杂交或集落杂交即可 进行杂交产物的检测。
检测到其中的杂交复合物的细胞是表达Nato3基因的细胞，因此，可被 测定为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
根据本发明检测方法的第二个实施方案，通过使用本发明的引物或引 物对的核酸扩增法扩增核酸样品(mRNA或其转录物)，并检测扩增产物，即 可检测到细胞样品中的Nato3基因表达。
通过例如下述步骤，可利用核酸扩增法^^测Nato3基因的表达
(c) 使用得自待测试细胞样品的多核苷酸作为模板，并使用本发明的多 核苷酸引物或多核苷酸引物对进行核酸扩增法；和
(d) 检测所形成的扩增产物。
在步骤(c)中，可将由据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试 细胞样品制备的mRNA,或由该mRNA转录的互补DNA(cDNA)用作模板。
使用核酸扩增法，如PCR法、RT-PCR法、实时PCR法或LAMP法可 进行扩增产物的检测。
检测到其中的扩增产物的细胞也表达Nato3基因，因此，可被测定为多 巴胺能神经元增殖祖细胞。
根据本发明检测方法的第三个实施方案，使本发明的抗体与细胞样品 接触，检测抗原-抗体反应。因此，可检测到细胞样品中的Nato3基因表达。
通过例如下述步骤，可利用抗原-抗体反应4企测Nato3基因的表达
(e) ^^得自待测试细胞样品的蛋白质与本发明的抗体接触；和
(f) 测定抗原-抗体复合物。
检测抗原-抗体反应的方法是本领域技术人员众所周知的，例如，可通 过免疫学方法，在据认为含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的待测试细胞样品中检测Nato3蛋白。关于免疫学方法，可对根据需要经适当处理，如细胞 的分离或提取操作的细胞样品使用先前已知的方法，如免疫组织染色法、 酶联免疫吸附测定法、western印迹法、凝集法、竟争法或夹心法。可通过 例如使用经标记抗体的直接法，或使用经标记的抗抗体之抗体的间接法来 进行免疫组织染色法。关于标记试剂，可使用已知的标记物质，如荧光物 质、放射性物质、酶、金属或色素。
检测到其中的抗原-抗体复合物的细胞是表达Nato3基因的细胞，因此， 可被测定为多巴胺能神经元增殖祖细胞。
为了用于治疗帕金森氏病，多巴胺能神经元增殖祖细胞的纯度较高才 是合乎需要的。
通过将上述检测步骤中的每一步重复多次，而不是一次，即可增强检 测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，通过将上述步骤进行两次或多次，即 可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另夕卜，通过同时使用其它标记基因，优选除Nato3基因以外的多巴胺能 神经元增殖祖细胞标记基因，也可增强检测或选择多巴胺能神经元增殖祖 细胞的准确度。
因此，根据本发明的检测方法，通过同时使用除Nato3基因以外的多巴 胺能神经元增殖祖细胞标记基因以及有丝分裂后多巴胺能神经元前体细胞 标记基因等，并同时检测Nato3基因的表达以及上述其它标记基因的表达， 也可以较高的准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
图1显示了在各个分化阶段选择性表达的与多巴胺能神经元相关的标 记基因。
在特征在于检测Nato3基因表达的检测方法中，通过同时使用除Nato3 基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，同时检测Nato3基因以及 除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因，即可以高准确度 检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。
具体地说，在步骤(a)、步骤(c)或步骤(e)中，通过将其中的除Nato3基 因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的表达需被检测的细胞用作 待测试细胞样品，即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。 此时，在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中被检测扩增产物的细胞，在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞各自表达Nato3基因和 除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因。因此，可以高准 确度将细胞测定为被检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另外，关于在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中被检测 扩增产物的细胞，以及在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞，分别进 行检测除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的步 骤(g-l),即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。此时， 在步骤(g-l)中，其中的除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记 基因的表达需被检测的细胞是表达Nato3基因，以及除Nato3基因以外的多 巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的细胞。因此，可以高准确度将细胞测 定为被检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
在特征在于检测Nato3基因表达的检测方法中，通过同时使用有丝分裂 后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因，可以证实表达了 Nato3基因，但未 检测到有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因的表达。因此，可 以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖前体细胞。
具体地说，在步骤(a)、步骤(c)或步骤(e)中，通过使用未检测到其有丝 分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因表达的细胞，即可以高准确度 检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。此时，在步骤(b)中被检测杂交复 合物的细胞，在步骤(d)中被检测扩增产物的细胞，在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞各自表达Nato3基因，但不表达有丝分裂后的多巴胺能神 经元前体细胞标记基因。因此，可以高准确度将细胞测定为被检测或选择 的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
另外，关于在步骤(b)中被检测杂交复合物的细胞，在步骤(d)中被检测 扩增产物的细胞，以及在步骤(f)中被检测抗原-抗体复合物的细胞，分别进 行检测有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因表达的步骤(g-2), 即可以高准确度检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。此时，在步骤(g-2) 中，其中的有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因的表达未被检 测到的细胞是表达Nato3基因，但不表达有丝分裂后的多巴胺能神经元前体 细胞标记基因的细胞。因此，可以高准确度将细胞测定为被检测或选择的 多巴胺能神经元增殖祖细胞。
"除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因"包括，在中脑最腹侧脑室区域(VZ区)表达的、除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增 殖祖细胞标记基因，其包括Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
Lrp4基因描述于WO 2004/065599。 Mashl基因描述于Kele J, Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F， Arenas E, Ang SL. Neurogenin 2 is required for the development of ventral midbrain dopaminergic neurons , 以及 Development. 2006 Feb; 133(3):495-505。本发明人已证实Msxl基因和Msx2 基因在多巴胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达(数据未显示)。
对除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的检测没 有限制，只要使用可检测已知基因表达的方法即可，例如，所述方法包括 上述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
"有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因"包括，在中脑最腹侧 套层(ML区)表达的基因，其包括Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3 基因和TH基因。另外，标记基因包括在中脑最腹侧脑室区(VZ区)表达的 基因，其包括65B13基因。
Nurrl基因描述于Science. 1997 11; 276(5310):248-50。 Enl基因描述于 J. Ne薦ci. 2001 21(9): 3126-34。 En2基因描述于J. Ne画ci. 2001 21(9) 3126-34。 Ptx3基因描述于Proc. Natl. Acad. Sci. 1997 94:13305-10。 TH基因 描述于Science 1997 11; 276(5310):248-50。 65B13基因描述于WO 2004/ 038018。
对有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞标记基因的检测没有特别的 限制，只要使用可检测已知基因表达的方法即可，例如，所述方法包括上 述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本发明的检测方法可用于筛选物质，所述物质能有效诱导生成多巴胺 能神经元增殖祖细胞的分化过程。具体地说，通过使用Nato3基因的表达为 指标，测定待测试的物质的添加是否能诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细 胞的分化过程，即可筛选出能有效诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细胞的 分化过程的物质。
因此，本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴 胺能神经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法包括下述步骤
(i) 使能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞与待测试的物质接 触j 和
(ii) 检测与待测试物质接触的细胞中的Nato3基因表达。 步骤(i)中可分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞优选收集自胚胎
中脑腹侧区域，或收集自含有由ES细胞诱导分化的神经元祖细胞的培养物 细胞。
通过例如在含有能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞的培养物 细胞中加入待测试物质，即可进行步骤(i)中的"与待测试物质接触"。
"待测试物质"包括合成的低分子量化合物、蛋白质、合成的肽、纯化或 部分纯化的多肽、抗体、细菌-释放物质(含有细菌代谢产物)和核酸(如反义 核酸、核酶和RNAi)，优选为合成的低分子量化合物，但并不局限于此。"待 测试物质"可以是新物质或已知物质。
在步骤(ii)中，根据本发明的检测方法，可检测到Nato3基因的表达。
具体地说，进行步骤(a)和(b)以利用杂交法进行检测。进行步骤(c)和(d) 以利用核酸扩增法进行检测。进行步骤(e)和(f)以利用抗原-抗体反应进行检 测。因此，可检测到Nato3基因的表达。
在步骤(ii)中，当通过与待测试物质接触检测到细胞样品中的Nato3基 因表达时，可将该物质测定为能有效诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程的物质。
通过本发明的筛选方法篩选出的物质可用作能有效诱导生成多巴胺能 神经元增殖祖细胞的分化过程的物质。
本发明提供了筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神
经元增殖祖细胞的分化过程，所述方法还包括下述步骤
(iii) 检测除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的 表达。
当在步骤(ii)中检测到Nato3基因的表达，在步骤(iii)中检测到除Nato3 基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的表达时，可以高准确度 将物质测定为能有效诱导生成多巴胺能神经元增殖祖细胞的分化过程的物质。
步骤(iii)可在步骤(i)之后进行，可在步骤(ii)之前或之后进行。 "除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因"包括，在中 脑最腹侧脑室区域(VZ区)表达的、除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增 殖祖细胞标记基因，其包括例如Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
对除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因的检测没 有特别的限制，只要使用可检测已知基因表达的方法即可，例如，所述方 法包括上述的杂交法、核酸扩增法和抗原-抗体反应法。
本发明的检测方法可检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞。多巴胺 能神经元增殖祖细胞可用于治疗帕金森氏病。因此，可使用Nato3基因的表 达为指标，由被检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞制备可用于治疗 帕金森氏病的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
本发明提供了制备多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，所述方法包括 下述步骤
(iv) 获得含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞；
(v) 使用本发明的检测方法检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞；和
(vi) 培养步骤(v)中检测或选择的细胞。
本发明提供了治疗帕金森氏病的方法，所述方法包括将通过本发明的 检测方法检测或选择的多巴胺能神经元增殖祖细胞，或通过本发明的制备方法产生的多巴胺能神经元增殖祖细胞移植到包括人的哺乳动物体内的步骤。
根据本发明的治疗方法，移植的多巴胺能神经元增殖祖细胞能产生多 巴胺，因此，可预防和/或治疗帕金森氏病。
当进行本发明的治疗方法时，可能含有多巴胺能神经元增殖祖细胞的 细胞可收集自哺乳动物，包括人，优选收集自接受移植的个体或流产胎儿。
多巴胺能神经元增殖祖细胞可被移植到脑，优选移植到中脑。
在本说明书中，"检测"包括"区分"。
实施例
下文将通过实施例具体解释本发明，但下文的实施例不会限制本发明 的范围。
Nato3蛋白的表达分析
接着，通过使用抗-Nato3抗体研究Nato3蛋白的表达。另外，通过使用 抗-Lmxla抗体和抗-Nurrl抗体进行双染色。
首先，在大肠杆菌JM109细胞系(TAKARA)中将Nato3蛋白的l刁2氨 基酸区域表达成与GST蛋白的融合蛋白，并收集所述融合蛋白。用收集到 的融合蛋白免疫大鼠，然后取出淋巴细胞，与骨髓瘤P3U1进行细胞融合， 从而获得能产生抗-Nato3抗体的杂交瘤(杂交瘤源自Kojin-Bio Co., Ltd.)。同 样地，将Lmxla蛋白的271-307氨基酸区域表达成与GST蛋白的融合蛋白， 并收集该融合蛋白。用收集的融合蛋白免疫仓鼠(得自SLC),然后取出淋巴 细胞，与骨髓瘤细胞(ATCC)进行细胞融合，从而获得能产生抗-Lmxla抗体 的杂交瘤。
取出11.5-日龄的小鼠胚胎，于4。C使用4Q/oPFA(WAKO)/PBS(-)固定2 小时，然后，于4。C,替换成20。/。蔗糖(WAKO)/PBS (-)溶液放置过夜，用 OCT(SakuraSeikiCo.，Ltd.)包埋胚胎。制备12fam厚的切片，固定在载玻片 上，室温干燥30分钟，然后再用PBS(-)润湿。接着，于室温封闭(Blockase (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.))30分钟，然后，室温与第一抗体(得 自上述杂交瘤培养物上清液的抗-Nato3和抗-Lmxla抗体，得自Santa Cruz 的抗-Nurrl抗体)反应1小时，随后，于4。C反应过夜。室温使用0.1%吐温 -20/PBS (-)洗涤15分钟，共3次。接着，室温使经荧光-标记的第二抗体 (Jackson)反应1小时，按相同的方式进行洗涤，然后于室温用PBS(-)洗涤IO分钟，并密封。
结果表明Nato3在11.5-日龄小鼠胚胎的中脑中被表达成蛋白质以及 mRNA(图5)。抗-Lmxla抗体和抗-Nurrl抗体的双染色结果表明Nato3蛋 白与Lmxla蛋白共表达，因此揭示出Nato3蛋白在多巴胺能神经元增殖祖 细胞中选4奪性表达(图5)。另外，还证实了 Nato3蛋白在不表达Nurrl蛋白 的VZ区选择性表达，因此表明Nato3蛋白在多巴胺能神经元增殖祖细胞中 选择性表达(图5)。
Nato3基因在由ES细胞诱导分化的多巴胺能神经元中的表
逸
本实施例研究了当ES细胞被诱导分化成多巴胺能神经元时，Nato3基 因是否表达。
首先，根据SDIA法(Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)， ES细胞 (小鼠CCE品系，由Riken CDB的Mr. Nishikawa提供，Kawasaki et al. Neuron. 2000 28(1):31-40.)被诱导分化成多巴胺能神经元。诱导4, 6， 8, 10, 12天后收 集细胞。使用Rneasy微型试剂盒(Qiagen)制备总RNA,进行RT-PCR。首先， 对于1吗总RNA,使用RNA PCR试剂盒(TAKARA)进行cDNA合成。使 用相当于10ng， 1 ng和O.l ng的cDNA为模板，在下述反应体系中进行PCR。 10xExTaq 2 ]ul
2.5mMdNTP 1,6 pi
ExTaq 0.1 |al
lOOiaM引物 各为0.2iil cDNA 1 pi
蒸馏水 14.9 pi
94°C保温2分钟，然后于94°C反应30秒，65°C反应30秒，72。C反 应2分钟，共35个循环，最后，于72。C保温2分钟。 PCR中使用了下列引物。
TH:
gttcccaaggaaagtgtcagagttgg (SEQ ID NO:37) gaagctggaaagcctccaggtgttcc (SEQ ID NO:38) DAT: ctccgagcagacaccatgaccttagc (SEQ ID NO:39) aggagtagggcttgtctcccaacctg (SEQ ID NO:40) Nurrl: cactcctgtgtctagctgccagatgc (SEQ ID NO:41)agtgcgaacaccgtagtgctgacagg (SEQ ID NO:42)
Ptx3: tgagccgcaggtctgtggatccatcc (SEQ ID NO:43)
tccctgttcctggccttagtcctagg (SEQ ID NO:44)
Enl: atcctccgagtggacattcacatagg (SEQ ID NO:45)
atgtccagcaaatagagatcgctacac (SEQ ID NO:46) 另外，对于Nato3和Lmxla而言，使用的是实施例1中的引物。此外， 已知Ptx3和Enl是有丝分裂后的多巴胺能神经元前体细胞的标记物。
结果，在ES细胞(CCE)和基质细胞(PA6)中未检测到Nato3 mRNA的表 达，但该结果表明作为诱导分化的结果，从第4天开始，按照与Lmxla 相同的方式诱导表达，所述Lmxla是多巴胺能神经元增殖祖细胞的标记基 因(图6)。
Nato3基因在通过Lrp4分选的多巴胺能神经元增殖祖细胞中 的表达
为了证实Nato3基因在多巴胺能神经元增殖祖细胞中表达，使用在多巴 胺能神经元增殖祖细胞中选择性表达的Lrp4基因作为标记物，分别从得自 12.5-日龄小鼠胚胎中脑的细胞和经SDIA分化诱导的细胞中分离多巴胺能 神经元增殖祖细胞，并研究这些细胞中的Nato3 mRNA表达。
首先，将编码Lrp4基因胞外区域(161-502氨基酸)的基因序列转染至 293E细胞(ATCC)，表达并收集Lrp4蛋白的胞外区域。用收集的蛋白质免 疫仓鼠(得自SLC),然后，提取淋巴细胞，与骨髓瘤细胞(ATCC)融合，以获 得能产生抗-Lrp4抗体的杂交瘤。
使用细胞分散缓沖液(Invitrogen)分散细胞群，该细胞群含有得自12.5-曰龄小鼠胚胎中脑，或在体外由ES细胞诱导分化成的多巴胺能神经元祖细 胞，然后，无需经固定和透化处理，于4。C用抗-Lrp4单克隆抗体(稀释至 1/2的培养物上清液，P/。胎牛血清(JRH), lmM EDTA/SDIA分化培养基 (Kawasaki et al. Neuron (2000)28(1):31-40))将细胞染色20分钟。然后，于4。C 用1%胎牛血清和lmM EDTA/SDIA分化培养基洗涤3分钟，共3次，于4。C 使用经生物素标记的抗-仓鼠IgG抗体(Jackson, 10 ng/ml， 1%胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培养基)将细胞染色20分钟，然后，按相同的方式进行洗 涤。于4。C使用经PE标记的链霉亲和素(Pharmingen, 20 [ig/ml， 1%胎牛血 清，lmMEDTA/SDIA分化培养基)将细胞染色20分钟，然后，按相同的方式进行洗涤。染色后，通过细胞分选仪(FACS vantage SE, Becton Dickinson) 分离Lrp4阳性细胞和阴性细胞(图7)。分离后，立即使用Rneasy微型试剂 盒(Qiagen)从细胞中制备总RNA，使用cDNA合成试剂盒(TAKARA)合成双 链cDNA。用限制性酶RsaI(TAKARA)消化之后，在其中加入ad2,将ad2S 用作引物，通过15个PCR循环扩增cDNA,并用作RT-PCR的模板。在下 述条件下进行扩增72。C保温5分钟，然后于94。C反应30秒，65。C反应 30秒，72。C反应2分钟，共15个循环，最后，于72。C保温2分钟。
接着，使用相当于4ng、 0.4ng和0.04ng扩增cDNA的cDNA为模板， 在下述反应体系中进行PCR。
10xExTaq 1 (il
2.5 mM dNTP 0.8 pl
ExTaq 0.05 pl
100pM引物 各为0.1 pl
cDNA 1 jil
蒸馏水 6.95 pl
使用了具有上述序列的引物。
94。C保温2分钟之后，94。C30秒，65。C30秒，72。C2分钟以进行扩 增反应，最后，于72。C保温2分钟。对Lmxla和Nurrl进行24个PCR扩 增循环，对其它的进行26个PCR扩增循环。
结果，在得自12.5-日龄小鼠胚胎中脑的细胞中，Nato3 mRNA在Lrp4-阳性细胞群体(即多巴胺能神经元增殖祖细胞)中强表达(图8)。另外，在SDIA 分化诱导细胞中，Nato3 mRNA在Lrp4-阳性细胞群体中强表达(图8)。因此 揭示出Nato3 mRNA在多巴胺能神经元增殖祖细胞、SDIA分化诱导细胞以 及得自小鼠胚胎中脑的细胞中表达。
因此，本发明揭示出Nato3基因是有用的标记物，它不仅可区分得自胚 胎中脑的多巴胺能神经元增殖祖细胞，还能区分在体外由ES细胞诱导分化 成的多巴胺能神经元增殖祖细胞。
权利要求
1.用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷酸探针或多核苷酸引物，所述探针或引物能与由Nato3基因的核苷酸序列或其互补序列组成的多核苷酸杂交。
2. 根据权利要求
1的多核苷酸探针或多核苷酸引物，所述探针或引物 由含有Nato3基因的核苷酸序列或其互补序列中至少10个连续核苷酸的多 核苷酸组成。
3. 根据权利要求
1或2的多核苷酸探针或多核苷酸引物，其中Nato3 基因的核香酸序列含有部分或完整的选自由以下核苦酸序列组成的组的核 苷酸序列SEQ ID NO:l的核苷酸1-365和534-640、 SEQ ID NO:3的核苷 酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5的核香酸1-306和475-501 、 SEQ ID NO:7 的核苷酸1-377和546-886、 SEQIDNO:9的核普酸1-312和481-507、 SEQ ID NO: 11的核香酸1-306和475-501、 SEQ ID NO: 13的核苷酸1-306和 475-501、 SEQ ID NO:15的核苷酸1-177和346-372、 SEQ ID NO:17的核香 酸1-359和528-557、以及SEQIDNO:19的核苷酸1-357和523-552。
4. 根据权利要求
1至3中任一项的多核苷酸探针或多核普酸引物，其 长度至少为15个;成基。
5. 多核苷酸引物套，含有两种或多种根据权利要求
1至4中任一项的 多核苷酸引物。
6. 抗Nato3蛋白或其部分的抗体,是用于检测或选择多巴胺能神经元增 殖祖细胞的抗体。
7. 根据权利要求
6的抗体，其中Nato3蛋白或其部分含有选自下组的氨 基酸序列中的至少6个氨基酸残基或其整个序列SEQ ID NO:2的氨基酸 1-102和159-166, SEQ ID NO:4的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:6 的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:8的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:10的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:12的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:16的氨基 酸1-59和116-123， SEQIDNO:18的氨基酸1-101和158-164,以及SEQID NO:20的氨基酸1-119和176-183。
8. 检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，其包括检测Nato3基因表达的步骤。
9. 根据权利要求
8的方法，其中检测Nato3基因表达的步骤包括下述步骤(a) 使得自待测试细胞样品的多核苷酸与根据权利要求
1至4中任一项 的多核苷酸探针接触；和(b) 检测杂交复合物。
10. 根据权利要求
9的方法，其中在步骤(a)中，将制备自待测试细胞 样品的mRNA或由该mRNA转录出的互补DNA(cDNA)与所述多核香酸4笨 针接触。
11. 根据权利要求
8的方法，其中检测Nato3基因表达的步骤包括下 述步骤(c) 使用得自待测试细胞样品的多核苷酸作为模板，并使用根据权利要 求1至4中任一项的多核苷酸引物或根据权利要求
5的多核苷酸引物对， 进行核酸扩增；和(d) 检测所形成的扩增产物。
12. 根据权利要求
11的方法，其中在步骤(c)中，将制备自待测试细 胞样品的mRNA或由该mRNA转录出的互补DNA(cDNA)用作模板。
13. 根据权利要求
8的方法，其中检测Nato3基因表达的步骤包括下 述步骤(e) 使得自待测试细胞样品的蛋白质与根据权利要求
6或7的抗体接 角虫^ 和(f) 测定抗原-抗体复合物。
14. 根据权利要求
9至13中任一项的方法，其中待测试细胞样品是 经诱导而向多巴胺能神经元增殖祖细胞分化的ES细胞。
15. 根据权利要求
14的方法，其中通过SDLA法进行分化诱导。
16. 根据权利要求
9至13中任一项的方法，其中待测试细胞样品是 得自胚胎中脑腹侧区域的细胞。
17. 根据权利要求
9至16中任一项的方法，其中在步骤(a)、步骤(c) 或步骤(e)中，将检测到除Nato3基因以外的多巴胺能神经元增殖祖细胞标 记基因的表达的细胞用作待测试细胞样品。
18. 根据权利要求
9至16中任一项的方法，其中在步骤(b)、步骤(d)或步骤(f)之后，还包括步骤(g),其检测除Nato3基因以外的多巴胺能神经 元增殖祖细胞标记基因的表达。
19. 根据权利要求
17或18的方法，其中除Nato3基因以外的多巴胺 能神经元增殖祖细胞标记基因是选自Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因和 Mashl基因中的至少 一个基因。
20. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
1至4中任一项的多核苷酸探针。
21. 根据权利要求
20的试剂盒，其还包括能检测除Nato3基因以外的 多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、引物套或抗体。
22. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
1至4中任一项的多核苷酸引物或根据权利要求
5的多核 苦酸引物套。
23. 根据权利要求
22的试剂盒，其还包括能检测除Nato3基因以外的 多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、引物套或抗体。
24. 用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的试剂盒，其至少含 有根据权利要求
6或7的抗体。
25. 根据权利要求
24的试剂盒，其还包括能检测除Nato3基因以外的 多巴胺能神经元增殖祖细胞标记基因表达的探针、引物、引物套或抗体。
26. 筛选物质的方法，所述物质能有效诱导生成多巴胺能神经元增殖 祖细胞的分化过程，所述方法包括下述步骤(i) 使能分化成多巴胺能神经元增殖祖细胞的细胞与待测试的物质接 触；和(ii) 检测与待测试物质接触后的细胞中的Nato3基因表达。
27. 根据权利要求
26的方法，其还包括下述步骤(iii) 在与待测试物质接触后的细胞中检测除Nato3基因以外的多巴胺 能神经元增殖祖细胞标记基因的表达。
28. 根据权利要求
27的方法，其中除Nato3基因以外的多巴胺能神经 元增殖祖细胞标记基因是选自L卬4基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl 基因中的至少一个基因。
29. 制备多巴胺能神经元增殖祖细胞的方法，包括下述步骤(iv) 获得多个细胞，其中含有多巴胺能神经元增殖祖细胞；(v) 使用根据权利要求
8至19中任一项的方法检测或选择多巴胺能神 经元增殖^L细月包；和(vi) 培养步骤(v)中检测到或选出的细胞。
30. 多核苷酸用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的用途，所 述多核苷酸能与由Nato3基因的核苦酸序列组成的多核苦酸或其互补序列 杂交多巴胺能神经元。
31. 根据权利要求
30的用途，其中能杂交的多核苷酸由Nato3基因核 苷酸序列或其互补序列中至少IO个连续核苷酸的序列组成。
32. 根据权利要求
30或31的用途，其中Nato3基因的核香酸序列含 有部分或完整的选自由以下核苷酸序列组成的组的核苷酸序列SEQ ID NO:l的核香酸1-365和534-640、 SEQIDNO:3的核苷酸1-376和545-662、 SEQ ID NO:5的核苷酸1-306和475-501、 SEQ ID NO:7的核苷酸1-377和 546-886、 SEQ IDNO:9的核苷酸1-312和481-507、 SEQIDNO:ll的核苦酸 1-306和475-501、 SEQ ID NO:13的核苷酸1-306和475-501 、 SEQIDNO:15 的核香酸1-177和346-372、 SEQ ID NO: 17的核苷酸1-359和528-557、以 及SEQ ID NO: 19的核苷酸1-357和523-552。
33. 根据权利要求
30至32中任一项的用途，其中能杂交的多核苷酸 的长度至少为15个碱基。
34. 抗Nato3蛋白或其部分的抗体用于检测或选择多巴胺能神经元增 殖祖细胞的用途。
35. 根据权利要求
34的用途，其中Nato3蛋白或其部分含有选自下组 的氨基酸序列中的至少6个氨基酸残基或其整个序列SEQ ID NO:2的氨基 酸1-102和159-166, SEQIDNO:4的氨基酸1-102和159-166, SEQIDNO:6 的氨基酸1-102和159-166， SEQIDNO:8的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:10的氨基酸1-104和161-168, SEQ ID NO:12的氨基酸1-102和 159-166, SEQ ID NO:14的氨基酸1-102和159-166, SEQ ID NO:16的氨基 酸1-59和116-123, SEQ ID NO:18的氨基酸1-101和158-164，以及SEQID NO:20的氨基酸1-119和176-183。
专利摘要
本发明提供了用于检测多巴胺能神经元增殖祖细胞的探针、引物和抗体。本发明还提供了用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的多核苷酸探针和多核苷酸引物，所述探针和引物能与由Nato3基因的核苷酸序列或其互补序列杂交，本发明还提供了用于检测或选择多巴胺能神经元增殖祖细胞的抗Nato3蛋白的抗体。
文档编号C12Q1/68GKCN101292031SQ200680038868
公开日2008年10月22日 申请日期2006年8月18日
发明者中川康子, 中谷智哉, 坂本佳正, 尾野雄一 申请人:卫材R&D管理有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan