使用抗衰老化合物生产蛋白质的方法

专利名称:使用抗衰老化合物生产蛋白质的方法
使用抗衰老化合物生产蛋白质的方法[0001]相关申请的交互参考[0002]本申请与于2005年10月24日提交的美国临时专利申请号60/729，573共同待决、与其共有至少一个共同发明人、并且要求其优先权，其中所述的美国临时专利申请号 60/729，573以其全部内容引入本文作为参考。[0003]发明背景[0004]本公开总体上涉及在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白质。本公开尤其涉及在存在抗衰老化合物例如肌肽下培养哺乳动物细胞、从而高质量地维持生存力并增加产量。培养细胞已经生产了许多蛋白质产物。这些产物例如杂交瘤生产的单克隆抗体可以用于治疗、 研究或其它用途。动物细胞、尤其是哺乳动物细胞通常用来生产蛋白质。遗憾的是，使用动物细胞使得生产过程既耗时又昂贵。[0005]向细胞培养基中添加化学试剂可通过诱导细胞产生产物来增加细胞产量，从而增加总收率。使用的最适试剂依赖于许多因素而不同，其中包括期望的蛋白质产物和细胞类型。类似因素也影响所选试剂的添加量、以及向细胞培养基中加入试剂的时间。试剂的实例为链烷酸或盐、尿素衍生物或二甲基亚砜(DMSO)。化学试剂例如丁酸钠对蛋白质生产具有不同的影响。虽然添加试剂可增加细胞的比产量，但也具有细胞毒作用、并且会抑制细胞的生长和生存力。[0006]因为细胞产生蛋白质，所以一般而言，蛋白分泌入细胞培养基。然而，特定蛋白质并非培养基中唯一的物质；培养基中经常存在高分子量聚集体、酸性物质(acidic species)和其它物质，这使得纯化过程更加费力和昂贵。存在改善产物质量、使得蛋白质纯化更加有效的技术和方法，其中所述技术和方法包括改变生物反应器条件或使用不同细胞系的技术和方法。然而，在本领域中仍然存在对改善纯化过程的蛋白质生产技术和方法的需求。[0007]因此，需要的是，加入细胞培养基中可在维持高细胞生存力的同时增强目的蛋白质表达的化学试剂。进一步需要的是通过降低细胞培养中高分子量聚集体和酸性物质的量来增加蛋白质产物质量的试剂。[0008]发明概述[0009]在某些实施方案中，本公开涉及提高蛋白质产物生产的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供在包含抗衰老化合物的培养基中培养表达目的蛋白质的宿主细胞、从而总体的目的蛋白质生产提高的方法。在某些实施方案中，该抗衰老化合物包含肌肽。[0010]在某些实施方案中，本发明提供增强目的蛋白质生产的组合物。例如，在某些实施方案中，本发明提供包含增强在宿主细胞中表达的目的蛋白质生产的抗衰老化合物的细胞培养基。在某些实施方案中，该抗衰老化合物包含肌肽。在某些实施方案中，联合经遗传操作的宿主细胞和种子培养基(inoculum medium)来形成细胞培养基,其中所述细胞培养基在生物反应器中生长。在预期蛋 白质产物的生产进程中，可以改变生物反应器的条件和/ 或添加补充物来增加产量和/或维持生存力。补充物可以包括补料培养基(feed medium) 和/或一种或多种添加物例如本公开中的肌肽和/或其它抗衰老化合物。[0011]在生物反应器中，哺乳动物宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在临近生产进程结束时会遭受生存力的降低。已经发现，向细胞培养基中加入抗衰老剂例如肌肽及其类似物有助于维持更高的活细胞数目和细胞生存力直到收获蛋白质。[0012]此外，可以根据本发明使用增加产量的方法，例如在生产进程的生长期后和/或在生产期改变温度。仅举一例，在蛋白质产物尤其是生长分化因子-8(GDF-8)的抗体的生产期间，将温度下调来帮助起始并增加产量。在某些实施方案中，加入抗衰老化合物例如肌肽有助于增加细胞培养物的产量。在某些实施方案中，可以在此种温度变动之前、期间和/ 或之后加入抗衰老化合物。[0013]也已发现，向细胞培养基中添加抗衰老化合物例如肌肽提高了蛋白质产物的整体质量。在蛋白质生产期间，高分子量的聚集体以及其它不需要的物质都存在于细胞培养基中。加入肌肽降低高分子量聚集体的量、并提高产物质量。在某些实施方案中，加入除肌肽之外的抗衰老化合物降低此类高分子量聚集体的积聚、并改善产物质量。在某些实施方案中，肌肽与一种或多种额外的抗衰老化合物联合加入。[0014]向细胞培养基中添加的抗衰老化合物(例如肌肽)的浓度根据方法的许多因素而不同，其中所述因素包括例如细胞类型、期望的产物、以及生物反应器的条件等等。此外，肌肽也可用其类似物乙酰肌肽、高肌肽(homo-carnosine)、鹅肌肽和β -丙氨酸替换。在某`些实施方案中，肌肽与一种或多种其它抗衰老化合物联合提供。在某些实施方案中，细胞培养基中抗衰老剂的浓度(例如肌肽)为大约5mM到大约lOOmM。在某些实施方案中，浓度为大约IOmM到大约40mM。在某些实施方案中，浓度为大约20mM。[0015]任何适当的培养方法和种子培养基都可以在蛋白质生产的方法中使用。血清和无血清培养基均可使用。此外，可使用适合特定细胞类型和蛋白质产物的培养方法来培养细胞。此类方法为细胞培养领域的普通技术人员所熟知和理解。[0016]本公开的其它特征和优点在下列描述和权利要求
中显而易见。[0017]附图简述[0018]
图1a肌肽对MY0-29酸性峰(acidic peak)的影响。[0019]图1b肌肽对高分子量聚集体的影响。[0020]图1c在不同天添加肌肽对酸性峰的影响。[0021]图1d在不同天添加肌肽对高分子量聚集体的影响。[0022]图2a肌肽对日活细胞密度的影响。[0023]图2b肌肽对日细胞生存力的影响。[0024]图2c肌肽对日滴度的影响。[0025]图2d肌肽对累积的比细胞产量的影响。[0026]图2e肌肽对于高分子量聚集体的影响。[0027]图3a不同浓度肌肽对活细胞密度的影响。[0028]图3b不同浓度肌肽对日细胞生存力的影响[0029]图3c不同浓度肌肽对日滴度的影响。[0030]图3d不同浓度肌肽对累积的比细胞产量的影响。[0031]图3e不同浓度肌肽对高分子量聚集体的影响。[0032]定义[0033]遵循长期约定，当在本申请、包括权利要求
中使用术语“一”和“一个”时，其表示 “一个或多个”。即使本发明已描述为具有某定程度的特异性，也明确的是，根据本发明的许多备选、修改和变更对本领域技术人员是显而易见的。因此，可以预期，所有符合本发明主旨和范围的此类备选、修改和变更都包含在定义的权利要求
书内。[0034]本文所用术语“抗衰老化合物”指的是任何加入细胞培养物中时促进其中生长的细胞的生存力、生长、和/或寿命的试剂或化合物。在某些实施方案中，在细胞培养中使用此类抗衰老化合物与其它培养条件相同但缺乏抗衰老化合物的培养条件相比，导致滴度增力口、细胞比产量(cell specificproductivity)增加、细胞生存力增加、综合的活细胞密度增加、高分子量聚集体积聚减少和/或酸性物质积聚减少。根据本发明的方法和组合物可以使用的抗衰老化合物的非限制性实例包括肌肽、乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽和β -丙氨酸。在某些实施方案中，根据本发明的方法和组合物可以使用两种或多种抗衰老化合物。[0035]短语“宿主细胞”指的是能够遗传操作和/或能在细胞培养基中生长和存活的细胞。一般地，细胞能表达大量内源或异源的目的蛋白质、并且能保留蛋白质或将其分泌到细胞培养基中。[0036]宿主细胞一般为“哺乳动物细胞”，其包含非限制性实例的脊椎动物细胞，其中包括幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人肾脏细胞(293)、正常胎猕猴二倍体 (normal fetal rhesus diploid) (FRhL-2)和鼠骨髓瘤(例如 SP2/0 和 NSO)细胞。本领域普通技术人员知道可以根据本发明方法和组合物使用的其它宿主细胞。[0037]术语“细胞培养基”指的是含有支持细胞在可生长、并生产预期蛋白质的条件下存活的养分的溶液。短语“接种培养基”或“种子培养基”指的是含有起始细胞培养的养分的溶液或物质。在某些实施方案中，虽然“补料培养基”含有与接种培养基相似的养分，但其为起始培养后补料给细胞的溶液或物质。在某些实施方案中，补料培养基含有一种或多种接种培养基中不存在的组分。在某些实施方案中，补料培养基缺少一种或多种接种培养基中存在的组分。细胞培养领域的普通技术人员无需过多实验便知道何种组分组成接种培养基和补料培养基。一般地，这些溶液提供细胞生长和存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂类和微量元素。在某些实施方案中，接种培养基、补料培养基或两者都包含抗衰老化合物。[0038]本文所用术语“细胞培养特征”指的是细胞培养 物可观察的和/或可测定的特征。 本发明的方法和组合物有利地用来提高一种或多种细胞培养特征。在某些实施方案中，提高细胞培养特征包含增加细胞培养特征的量度。在某些实施方案中，提高细胞培养特征包含降低细胞培养特征的量度。作为非限制性实例，细胞培养特征可以是滴度、细胞比产量、 细胞生存力、综合的活细胞密度、高分子量聚集体的积聚和/或酸性物质的积聚。本领域的普通技术人员知道其它使用本发明的方法和组合物可提高的细胞培养特征。[0039]本文所用术语“定义的培养基”指的是培养基中的组分已知并且可控的培养基。定义的培养基不含有复杂添加物，例如含有未知和/或不可控组分的血清或水解产物。[0040]本文所用术语“复杂培养基”指的是含有至少一种身份或量未知或不可控的组分的培养基。[0041]短语“细胞系”通常指的是表达目的蛋白质的原代宿主细胞。在一些实施方案中， 细胞中已转染了编码目的蛋白质和/或含有激活连接序列表达的控制序列的外源DNA，其为内源或异源的。在某些实施方案中，将由此类经遗传修饰的细胞获得的细胞形成细胞系、 并置于细胞培养基中生长和生产蛋白质产物。在某些实施方案中，细胞系包含未转染外源 DNA和表达内源目的蛋白质的原代宿主细胞。[0042]细胞培养基的“生长期”指的是细胞进行快速分裂和指数或接近指数生长的阶段。 一般地，细胞在优化的细胞生长条件下培养通常1-4天。生长期条件可包括大约35°C -42°C 的温度、通常为37°C。虽然生长期的长度和生长期的培养条件可以改变，但其一般为细胞培养领域的普通技术人员已知。在某些实施方案中，向处于生长期的细胞培养基中添加补料培养基。[0043]“转换期(transition phase) ”出现在细胞培养物从与生长期一致的条件转变为与生产期一致的条件的时期。在转换期期间，通常改变因素，例如温度等。在某些实施方案中，向处于转换期的细胞培养基中添加补料培养基。[0044]“生产期”出现在生长期和转换期两者之后。细胞的指数生长已经结束，并且蛋白质生产为主要目的。补充细胞培养基来起始生产。在某些实施方案中，向处于生产期的细胞培养基中添加补料培养基。此外，生产期的细胞培养基的温度通常可以低于生长期，这一般促进生产。生产期一直持续到完成预期的终点。[0045]短语“活细胞密度”指的是在特定体积、通常为每毫升细胞培养基中存活的细胞总数。短语“细胞生存力”指的是以百分数表示的与总细胞数相比的活细胞数，其中所述总细胞数包括死细胞和活细胞。[0046]“综合的活细胞密度(Integrated Viable Cell Density) ”、“IVCD” 本文所用术语“综合的活细胞密度”或“IVCD”指的是用培养过程中的平均活细胞密度乘以培养进行的时间。当生产的蛋白质的量与培养过程中存在的活细胞数成比例时，综合的活细胞密度是估计培养过程中产生的蛋白质的量的有用工具。[0047]术语“高分子量聚集体”通常指的是错误折叠的蛋白质或至少两个多肽的非恰当联合。该联合可以通过任意方法产生，其中包括但不限于共价、非共价、二硫化或不可还原的交联。在某些实施方案中，本发明的方法和组合物有利地用来减少高分子量聚集体的积聚。[0048]短语“抗氧化剂”指的是通过封闭自由基防止对脂类、蛋白质、DNA和其它必需大分子氧化损伤的化合物。[0049]本文所用术语“抗体”包括包含至少一个、并且一般两个VH结构域或其部分和/或至少一个、并且一般两个VL结构域或其部分的蛋白质。在某些实施方案中，抗体为两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链通过例如二硫键互连。如本文详述地，抗体或其部分可以从任何来源获得，其中包括但不限于啮齿类、灵长类(例如人和非人灵长类)、camelid、以及重组生产的例如嵌合的、人源化的、和/或体外产生的。[0050]包括在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗 体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)由VH结构域组成的dAb片段；(vi) camelid 或camelized可变结构域；(vii)单链Fv(scFv) ； (viii)双特异性抗体；和(ix) —个或多个与Fe区域融合的免疫球蛋白分子片段。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH通过分离的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成的接头来连接，从而使它们成为单条蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv);见,例如Bird等人 (1988) Science242 :423-26 ;Huston 等人(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-83)。 此类单链抗体也预期为包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。这些片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且将用与完整抗体相同的方式来评估片段的功能。[0051]“抗原结合片段”可任选地进一步包括增强例如稳定性、效应细胞功能或补体固定中一项或多项的部分。例如，抗原结合片段可进一步包括聚乙二醇化的部分、清蛋白、或重链和/或轻链恒定区。[0052]除了“双特异性”或“双功能性”抗体，抗体应理解为其每一结合位点是相同的。“双特异性”或“双功能性”抗体是人工杂种抗体，其具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点。“双特异性”抗体可以通过多种方法生产，其中包括杂交瘤融合或Fab'片段连接。见，例如 Songsivilai&Lachmann,Clin. Exp.1mmunol. 79 :315-321 (1990) ;Kostelny 等人，J.1mmunol. 148，1547-1553 (1992)。[0053]本领域技术人员熟知的多种方法可以用来获得抗体或其抗原结合片段。例如，可以根据已知方法通过产生杂交瘤来生产单克隆抗体。通过这种方式形成的杂交瘤一般用标准方法筛选来鉴定一种或多种生产特异结合特定抗原的抗体的杂交瘤，其中所述标准方法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子共振(Biacore )分析。任何形式的特定抗原都可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任意变体或片段以及其抗原肽。[0054]一种制备抗体的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示在例如Ladner等人，美国专利号5，223，409 ；Smith (1985) Science 228 1315-1317 ；W0 92/18619 ；W0 91/17271 ；W0 92/20791 ；W0 92/15679 ；W0 93/01288 ；W0 92/01047 ；W0 92/09690 和 WO 90/02809 中进行了描述。[0055]除了使用展示文库外，可以用特定抗原来免疫非人动物，例如啮齿类，例如小鼠、 仓鼠或大鼠。在某些实施方案中，非人动物包括至少部分人免疫球蛋白基因。例如，可能用人Ig基因座的大片段设计在小鼠抗体生产中有缺陷的小鼠株系。使用杂交瘤技术，可以生产和选择衍生自具预期特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。见，例如XEN0M0USE 、 Green 等人(1994)Nature Genetics 7 :13-21, US 2003-0070185、1996 年 10 月 31 日公开的 TO 96/34096、1996 年 4 月 29 日提交的 PCT 申请号 PCT/US96/5928。[0056]在某些实施方案中，单克隆抗体从非人动物获得，然后进行修饰，例如人源化、脱免疫化、嵌合的，这些单克隆抗体可以使用本领域已知的重组DNA技术来生产。已经描述了多种制备嵌合抗体的方法。见，例如Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 81 :6851, 1985 ;T akeda 等人，Nature 314 :452，1985 ;Cabilly 等人，美国专利号 4，816，567 ；Boss 等人，美国专利号4，816，397 ；Tanaguchi等人，欧洲专利公开号EP171496 ;欧洲专利公开 0173494，英国专利GB 2177096B。例如，也可使用表达人重链和轻链基因、但不能表达小鼠内源免疫球蛋白重链和轻链基因的转基因小鼠来生产人源化的抗体。Winter描述了示例性的CDR移植方法，其可用来制备本文所述的人源化抗体(美国专利号5，225，539)。所有特定人抗体的⑶R都可以用至少部分非人⑶R替换，或只将一些⑶R用非人⑶R替换。仅需要将人源化抗体结合所需的CDR数替换为预定抗原。[0057]人源化抗体或其片段可以通过将不直接参与抗原结合的Fv可变结构域序列替换为人Fv可变结构域的等价序列来产生。Morrison (1985) Science 229 :1202_1207、Oi等人(1986)BioTechniques 4 :214、美国 5，585，089、美国 5，693，761、美国 5，693，762、美国 5，859，205和美国6，407，213中提供了产生人源化抗体或其片段的示例性方法。此类方法包括从至少一条重链或轻链中分离、操作和表达编码全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。此类核酸可以从上文所述的生产抗预定目标的抗体的杂交瘤以及从其它来源获得。然后可将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入适当表达载体。[0058]在某些实施方案中，人源化抗体通过引入保守替换、共有序列替换、胚系替换和/ 或回复突变来最优化。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的一些方法中的任一方法来制备，(例如 Teng 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. ,80 :7308-7312,1983 ； Kozbor 等人，Immunology Today, 4 :7279,1983 ；01sson 等人，Meth. Enzymol. ,92 :3-16, 1982)，并且可以根据PCT公开W092/06193或EP 0239400的教导来制备。[0059]抗体或其片段也可以通过WO 98/52976和WO 00/34317中公开的方法特异性缺失人T细胞表位或“脱免疫化”来进行修饰。简而言之，分析抗体重链和轻链可变结构域结合 MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T-细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。对于检测潜在的T-细胞表位,可以应用称为“肽穿线法(peptide threading) ”的计算机模建方法，并且此外，在人MHC II类结合肽数据库中搜索VH和VL序列中存在的基序，如 WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序结合至18种主要MHC II类DR同种异型中的任意一种，并因此构成潜在的T细胞表位。检测到的潜在T-细胞表位可以通过替换可变结构域中的少量氨基酸残基或者优选地通过单个氨基酸替换来除去。一般地，进行保守性替换。通常但非唯一地，可以使用与在人胚系抗体序列中位置相同的氨基酸。人胚系序列在例如 Tomlinson 等人，(1992) J. Mo1. Biol. 227 :776-798 ；Cook, G. P.等人，(1995) Immunol. Today Vol. 16(5) :237-242 ；Chothia, D.等人(1992)J. Mo1. Biol. 227 :799-817 ；以及 Tomlinson等人(1995)EMB0J. 14 :4628-4638中公开。V BASE名录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合性名录(由 Tomlinson,1. A.等人,MRC Centre for ProteinEngineering, Cambridge,UK编译)。这些序列可作为人序列例如构架区和⑶R的来源。也可以使用共有的人构架区，例如美国6，300, 064中所述。[0060]在某些实施方案中，抗体可以含有改变的免疫球蛋白恒定区或Fe区。例如，根据本文教导生产的抗体可以更强或更特异地结合效应分子(例如补体和/或Fe受体)，这可以控制抗体的一些免疫功能，例如效应细胞活性、溶胞作用、补体介导的活性、抗体清除以及抗体半寿期。一般地，结合抗体(例如IgG抗体)Fe区的Fe受体包括但不限于Fe Y R1、 Fe Y RH、以及Fe Y RIII和FcRn亚 类的受体，其中包括这些受体的等位变体和选择性剪接形式。Fe 受体在 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Tmmunol 9 :457-92,1991 ；Capel 等人， IniMincmietliods 4 :25-34,1994 ；以及 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med. 126 :330-41,1995 中进行了综述。[0061]短语“生物反应器”指的是其中可以含有细胞培养基、并且在培养期间可以控制其内部条件例如PH和温度的容器。[0062]“补料分批培养(fed batch culture) ”指的是细胞培养方法，其中先在生物反应器中用种子培养基接种细胞。然后在生产进程的一个或多个点向细胞培养基中补充含有营养组分和/或其它补充物的补料培养基。[0063]“分批培养(batch culture)”指的是细胞培养方法，其中细胞接种在含有整个生长进程必需的所有养分和补充物的生物反应器中。在生产期间无须再向细胞培养基中添加任何养分。[0064]“灌流培养”指的是不同于分批培养法或补料分批培养法的细胞培养方法，其中在分离和/或纯化表达的目的蛋白质之前不终止或不需要终止培养，并且周期性地或连续地向培养物中加入新的养分和其它组分，在此期间周期性地或连续地收获表达的蛋白质。在细胞培养过程中，添加的养分组合物可以根据细胞需要、优化蛋白质生产的需求、和/或本领域普通技术人员已知的任意多种其它因素而改变。[0065]短语“表达”指的是在宿主细胞中发生的转录和翻译。通常，表达水平涉及通过宿主细胞生产的蛋白质的量。[0066]短语“蛋白质”或“蛋白质产物”指的是一条或多条氨基酸链。本文所用术语“蛋白质”与“多肽”同义，并且通常在本领域理解为至少一条通过连续肽键连接的氨基酸链。在某些实施方案中，“目的蛋白质”为通过转化进入宿主细胞的外源核酸分子编码的蛋白质。 在某些实施方案中，“目的蛋白质”为宿主细胞内源核酸分子编码的蛋白质。在某些实施方案中，该内源目的蛋白质的表达通过向宿主细胞转染外源核酸分子来改变，其中所述的外源核酸分子例如含有一个或多个调节序列和/或编码增强目的蛋白质表达的蛋白质。本发明的方法和组合物可用于生产任何目的蛋白质，其中包括但不仅限于具有治疗、药学、诊断、农业和/或任何多种其它对商业、实验和/或其它应用有用特性的蛋白质。在某些实施方案中，用本发明方法和/或组合物生产的蛋白质可以进行加工和/或修饰。例如，可将根据本发明产生的蛋白质糖基化。[0067]“细胞比产量”等指的是在 每个细胞中特定的产物表达速率。细胞比产量通常测定为每天每IO6个细胞生产的蛋白质微克数或每天每IO6个细胞生产的蛋白质皮克数。[0068]本文所用术语“滴度”指的是由给定培养基体积数的细胞培养物生产的重组表达蛋白质的总量。滴度一般表示为每毫升培养基中的蛋白质毫克数或微克数。[0069]本领域技术人员清楚，本文公开的方法可以用来培养许多本领域常规使用和培养的熟知的哺乳动物细胞，即本文公开的方法并不仅限于在本公开内容中的用途。[0070]本发明一些实施方案的详述[0071]已经发现，使用抗衰老化合物例如肌肽可以改变细胞培养物的生存力和产量。例如，添加肌肽可以维持细胞生存力，提高细胞产量，以及提高预期蛋白质产物的产物质量。 肌肽是抗氧剂和抗衰老化合物，其也是天然存在的二肽，以高水平(高达20mM)存在于动物肌肉和神经组织中。作为抗氧化剂，肌肽也是游离的自由基清除剂和糖化抑制剂。通常，肌肽将活性物质转变为非活性物质从而保护蛋白质、DNA和其它必需大分子。作为抗衰老化合物，肌肽可以在细胞培养基中以20mM的浓度延长人二倍体成纤维细胞和人胎肺细胞(原代细胞系)。本发明包含下列令人惊讶的发现，即可以有利地在细胞培养中使用抗衰老化合物(包括但不限于肌肽)来生产目的蛋白质。在某些实施方案中，在细胞培养中使用该抗衰老化合物来生产目的蛋白质导致一项或多项细胞培养物特性改善，这些细胞特性包括但不限于滴度增加、细胞比产量提高、细胞生存力提高、综合的活细胞密度增加、高分子量聚集体的积聚下降和/或酸性物质的积聚下降。[0072]已经证实，肌肽在具较低的葡萄糖水平的基本必需培养基(MEM，Sigma)中对转化的人或啮齿类和赘生性细胞是细胞毒性的，但在含有ImM丙酮酸的Dulbecco改良的Eagle 培养基(DMEM, Sigma)中不是细胞毒性的(Holliday 等人，Biochemistry (Moscow), 65 843-848,846)。此外，经透析去除低分子量化合物的胎牛血清增加肌肽的细胞毒作用。同前。也已测定，ImM草酰乙酸和ImMa-酮戊二酸具有与丙酮酸盐相似的影响，它们都不是与肌肽实例使用的种子培养基或补料培养基的组分。同前。然而，丙酮酸钠是种子培养基中的O. 5mM最初组分，其不是肌肽添加物，而是为了更好地在生物反应器系统中模拟体内条件、并作为潜在的备选能源。种子培养基也是无血清的，这暗示着肌肽具有细胞毒作用。根据参考文献，向细胞培养基中添加肌肽会具有和在Holliday的MEM培养基中所见的相似细胞毒作用。通过使用本发明的方法和组合物，将降低或消除该细胞毒性、并改善细胞生存力和蛋白质生产。[0073]在某些实施方案中，肌肽以在细胞培养基中大约5mM至大约IOOmM之间的浓度提供。在某些实施方案中，肌肽以在细胞培养基中大约IOmM至大约40mM的浓度提供，例如大约20mM的浓度。在某些实施方案中，肌肽以在细胞培养基中大约5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、4·1、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOmM 或更高的浓度提供。在某些实施方案中，在细胞培养物中此类肌肽的浓度通过在细胞培养过程中多次添加肌肽来实现，例如在一次或多次补料培养基中。所用肌肽的浓度取决于使用的细胞培养基和细胞系、以及其它因素，其中包括预期对细胞系或产物的效应。也可以向细胞培养基提供肌肽类似物例如乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽和β_丙氨酸来获得类似效应。可以向细胞培养基提供一种或多种这些类似物。在某些实施方案中，向缺乏肌肽的细胞培养基提供此类类似物。在某些实施方案中，此类类似物与肌肽组合提供给细胞培养基。在某些实施方案中，此类类似物以大约 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOmM 或更高的浓度提供。[0074]在某些实施方案中，为了生产目的蛋白质，首先向宿主细胞中转染或转化入编码蛋白质的外源DNA来提供组成型地生产预期蛋白质产物的转化细胞。在某些实施方案中， 引入细胞中的核酸分子编码本发明预期表达的蛋白质。在某些实施方案中，核酸分子含有调节序列或者编码通过细胞诱导或增强预期蛋白质的表达的基因产物。作为非限制性实例，该基因产物可以是增强目的蛋白质表达的转录因子。[0075]在某些实施方案中，将指导蛋白质表达的核酸稳定性地弓I入宿主细胞中。在某些实施方案中，将指导蛋白质表达的核酸瞬时性地引入宿主细胞中。本领域的普通技术人员能够基于实验、商业或其它需要来选择稳定或瞬时地将核酸引入细胞。[0076]编码目的蛋白质的基因可以任选地与一个或多个调节性遗传控制元件连接。在某些实施方案中，遗传控制元件指导蛋白质的组成型表达。在某些实施方案中，可以使用提供诱导型表达编码目的蛋白质的基因的遗传控制元件。使用诱导型遗传控制元件(例如诱导型启动子)允许调节细胞中的蛋白质生产。可用于真核细胞的、潜在有用的诱导型遗传控制元件的非限制性实例包括激素调节元件(见，例如Mader, S.和White, J. H. , Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 90 :5603_5607，1993)、合成性配体调节的元件(见，例如 Spencer,D. M.等人，Science 262 :1019-1024,1993)和电离福射调节兀件(见，例如Manome，Y.等人，Biochemistry 32 :10607-10613,1993 ；Datta, R.等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 89 10149-10153，1992)。可根据本文所述方法和组合物使用本领域已知的其它细胞特异性或其它调节系统。[0077]可以根据本发明使用任何易于进行细胞培养和蛋白质表达的宿主细胞。宿主细胞通常为哺乳动物细胞，尤其是动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的其它非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/I，ECACC No :85110503)、人成视网膜细胞(PER. C6 (CmCelI, Leiden, The Netherlands))、通过 SV40 转化的猴肾CVl细胞系、人胚肾细胞系(293细胞或用于在悬浮培养基中生长的经亚克隆的 293 细胞，Graham 等人，J. Gen Virol.，36:59 (1977))、婴儿仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CH0，Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 77 :4216(1980))、小鼠 Sertoli 细胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. ,23 :243-251 (1980))、猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VER0-76，ATCC CRL-1 587)、人宫颈癌细胞 (HeLa, ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34)、buffalo 大鼠肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI 细胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sc1.，383 :44-68 (1982))、 MRC 5细胞、FS4细胞和人肝癌细胞(Hep G2)。任何在宿主细胞中能表达的蛋白质都可以根据本发明的方法和组合物生产。蛋白质可以从宿主细胞的内源基因或引入宿主细胞的异源基因表达。蛋白质可以是天然存在的或者备选地具有人工改造或选择的序列。待生产的蛋白质可以从天然独立存在的蛋白质片段组装。额外地或备选地，工程化蛋白质可以包括一个或多个非天然存在的片段。[0079]在某些实施方案中，使用本发明的方法和组合物来表达药学或商业相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。在本实例中，经遗传操作的细胞生产抗生长分化因子-8(⑶F-8)的抗体。将非限制性的示例性实施方案称为Myo29、Myo28和Myo22。这些示例性实施方案以人IgG同种型的形式提供。公开的非限制性实例为MY029的用途，其受标题为“抗⑶F-8的中和抗体及其用途”的专利号WO 2004/037861保护，并且所述专利在此处引入作为参考。本领域的普通技术人员知道根据本发明的方法和组合物表达的其它有用和/或预期的蛋白质。[0080]可以使用多种技术培养细胞系来生产预期的蛋白质产物。细胞培养可以根据细胞培养基的目的和产物的用途大规模或小规模地进行。例如，细胞可以在生物反应器中生长。 在某些实施方案中，生物反应器的容积至少为I升，并且可以为10、100、250、500、1，000、 2，500、5，000、8，000、10，000、12，000升或更多，或者之间的任何容积。此外，可用的生物反应器包括但不限于搅拌釜生物反应器、流化床反应器、中空纤维生物反应器或滚瓶。系统也可以以分批、补料分批或连续/灌流的模式运行。细胞培养领域的普通技术人员知道在生物反应器和模式中控制和监控细胞培养基。在本实例中，采用的系统为搅拌釜生物反应器，并且以补料分批模式运行。[0081]通常向生物反应器中接种种子培养基和选定的细胞系，例如MY0-29细胞系，所述细胞系可被转染来稳定表达和生产期望蛋白质产物。商品化培养基例如基本必需培养基 (MEM, Sigma)、Ham' s FlO (Sigma)、或 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基(DMEM, Sigma)都可用作基础培养基。然后，向这些基础培养基中补充氨基酸、维生素、微量元素和/或其它组分来产生生产进程中使用的种子培养基或补料培养基。在某些实施方案中，改变基础培养基来允许细胞快速生长、细胞生存力增加、细胞产量增加、综合的活细胞密度增加和/或在存在肌肽下生产的蛋白质质量提高。例如，可向基础培养基中补充丙酮酸盐、草酰乙酸盐和 /或α-酮戊二酸盐。本领域普通技术人员可以使用本发明的方法和组合物而无需过多实验便能改变基础培养基。[0082]在某些实施方案中，细胞在多种含有抗衰老化合物的化学定义的任意培养基中培养，其中培养基的组分不但已知而且可控。例如，定义的培养基一般不含有复杂添加物例如血清或水解产物。在某些实施方案中，细胞在多种含有抗衰老化合物的任意复杂培养基中培养，其中并非所有培养基组分都已知和/或可控的。在某些实施方案中，该抗衰老化合物包含肌肽。[0083]通常控制生物反应器的条件，用酸通常为CO2或碱例如碳酸氢钠将pH设置在大约 6. 5至大约7. 5之间。在生长期，将溶解氧控制在大约5-90%空气饱和之间，并将温度控制在30°C _42°C之间。细胞培养领域的普通技术人员可以根据细胞系和采用的方法改变生物反应器的条件来达到期望结果，而无需过多实验。[0084]本发明的组合物和方法可以与任何适合蛋白质表达的细胞培养方法或系统一起使用。例如，表达目的蛋白质的细胞可在分批或补料分批的培养中生长，其中在蛋白质充分表达之后终止培养，然后收获并任选地纯化表达的蛋白质。备选地，表达目的蛋白质的细胞可在灌流培养基中生长，其中不终止培养、并且新的养分和其它组分周期性或持续地加入到培养基中，在此期间周期性或持续性地收获表达的蛋白质。[0085]在细胞接种后，其将经历生长期，在此期间细胞数目通常呈指数增长。在生长期， 细胞培养温度或温度范围主要基于下列因素进行选择，即在该温度或温度范围时，细胞培养物保持生存力、产生高水平蛋白质、产生或积累的代谢废物最少和/或这些或其它从业者认为重要的因素的任一组合。作为一个非限制性实例，CHO细胞在大约37°C时生长良好、 并且生产高水平的蛋白质。通常，虽然大多数哺乳动物细胞在大约25°C_42°C的范围内生长良好、并且/或者生产高水平的蛋白质，但本公开所教导的方法并不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在大约35°C _40°C的范围内生长良好、并且/或者生产高水平的蛋白质。在某些实施方案中，在生长期的一个或多个时刻，细胞培养物在20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45°C 的温度生长。本领域的普通技术人员能够根据细胞需要和从业者的生产需求选择适合细胞生长的温度或温度范围。`[0086]生长期之后为转换期，在此期间细胞将适应环境中发生的任何变化，例如温度的改变。发生的变化通常为生产期的参数。在本实例中，温度在第四天从大约37°C下降到大约31°C。然而，温度变动可以不止一次地发生、并且不需要一定向下的方向。而且，转换期和温度变动可在生产进程中的任一天发生。尽管大多数生产方法包括多时期过程，但肌肽也可以用于单时期过程。[0087]当改变培养温度时，温度变化可以是相对缓慢的。例如，耗费数小时或数天来完成温度的改变。备选地，温度变化可以是相对快速的。温度可在培养过程中稳定增加或降低。备选地，温度可以在培养过程的多个时刻不连续量地增加或降低。后来的温度或温度范围可以低于或高于初始或先前的温度或温度范围。本领域普通技术人员理解，这些实施方案包含多个不连续的温度变化。例如，温度可以变化一次(向更高或更低的温度或温度范围)，细胞维持在这个温度或温度范围一段时间，然后再次变化温度到新的温度或温度范围，变化后的温度或温度范围可以高于或低于先前的温度或温度范围。每次不连续变化后的培养温度可以是恒定的或者维持在一个温度范围内。[0088]最后，生产期中存在细胞数基本不再增加、但细胞生产预期蛋白质产物。然而,本领域的普通技术人员理解，在某些实施方案中，细胞在生产期可持续生长并且细胞数量增加。在这个时期，将生物反应器的环境控制为更有利于细胞生产的条件。例如，通常将温度维持在不同于生长期、但有助于蛋白质产物的生产的温度，例如31°C。在整个生产过程中，都可以向细胞添加包含细胞所需养分的补料培养基和补充物。例如，在某些情况中，在随后的生产期期间向细胞培养物中补充细胞已耗竭或代谢的养分或其它培养基组分是有益或必要的。作为非限制性实例，向细胞培养物中补充激素和/或其它生长因子、尤其是离子(如钠、氯化物、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂类、或葡萄糖或其它能源将是有益或必要的。 这些补充性组分可以一次性全部加入到细胞培养物中，或者一系列加入地向细胞培养物提供。在某些实施方案中，在生产期期间一次或多次提供在补料培养基中的抗衰老化合物。[0089]根据某些实施方案，无论是提供在接种培养基中还是在补料培养基中，抗衰老化合物例如肌肽在生长期期间在细胞培养基中的使用都增加了细胞生存力和/或特定的蛋白质生产，从而提高所生产蛋白质的总产率。[0090]蛋白质生产过程的方面通过细胞培养领域的普通技术人员测定。参数例如接种密度、生产培养持续时间、收获时的操作条件等随细胞系和细胞培养物而不同，其中所述参数包括上文提到的参数。因此，参数可以由细胞培养领域的普通技术人员测定，而无需过多实验。[0091]与生长期的温度或温度范围一样，生产期细胞培养的温度或温度范围主要基于下列因素进行选择，即在此温度或温度范围时细胞培养物保持生存力、生产高水平蛋白质、 生产或积累的代谢废物最少和/或从业人员认为重要的这些或其它因素的组合。一般而言，虽然绝大多数哺乳动物细胞在大约25V -42°C的范围内保持生存力、并且生产高水平的蛋白质，但本公开教导的方法不限于这些温度。在某些实施方案中，哺乳动物细胞在大约 250C _35°C的范围内保持生存力、并且生产高水平的蛋白质。在某些实施方案中，细胞在生产期的一个或多个时刻在 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44或45°C的温度生长。本领域的普通技术人员能够根据细胞的特定需要和从业人员特定的生产需求选择适合生产期细胞生长的温度或温度范围。细胞可生长任何时间，这取决于从业人员的需要和细胞本身的需要。[0092]在某些实施方案中，一旦培养物达到一项或多项相关培养条件，就终止分批培养或补料分批培养，这根据从业人员的需要决定。在某些 实施方案中，一旦表达的蛋白质达到足够高的滴度、一旦细胞密度达到足够高的水平、一旦表达的蛋白质达到足够高的细胞密度，就终止分批培养或补料分批培养，并且/或者阻止不期望的代谢废物(例如乳酸和/或铵)的产生或积累。本领域普通技术人员知道其它根据实验、商业和/或其它考虑用来决定何时终止分批培养或补料分批培养的相关培养条件。[0093]在某些实施方案中，在生产运行之后，从细胞培养基中回收、并使用传统分离技术进一步分离蛋白质产物。例如，蛋白质最初可以通过离心、保留含有蛋白质的上清来分离。 额外地或备选地，蛋白质产物可以结合在宿主细胞表面。在此类实施方案中，作为纯化过程的第一步，移去培养基、并裂解表达蛋白质的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞的裂解可以通过本领域普通技术人员已知的任意一种方法完成，其中包括通过玻璃珠的物理破裂以及暴露在高pH条件下。[0094]蛋白质可以通过常规的蛋白质纯化方法额外地分离。分离和纯化期望蛋白质产物的方法为细胞培养领域已知。特定方法取决于所使用的细胞系和预期产物。[0095]抗衰老化合物例如肌肽可以在特定细胞培养过程的最佳时间加入到培养基中。对本实例而言，肌肽的加入发生在生长期基本完成之后、并在转换期中发生。在添加时，细胞培养物适应温度变化产生的新温度。转换期通常为加入帮助起始生产期的试剂的时期。然而，肌肽可以在生产进程的任意点加入以便产生最佳结果，其中所述任意点包括生长期和生产期。肌肽也可以与其它组分例如补料培养基一起加入。在某些实施方案中，抗衰老化合物在接种培养基中提供、并且在整个细胞培养过程都存在于细胞培养物中。在某些实施方案中，在细胞培养物中提供两种或多种抗衰老化合物。在某些实施方案中，在接种培养基中提供两种或多种抗衰老化合物、并且所述抗衰老化合物在整个细胞培养过程都存在于细胞培养物中。在某些实施方案中，提供两种或多种抗衰老化合物，其中一种抗衰老化合物在接种培养基中、并且在整个细胞培养过程中都存在于细胞培养物中，而另一种抗衰老化合物在细胞培养开始后提供。[0096]在某些实施方案中，对不同的细胞类型和产物，细胞培养物中存在的抗衰老化合物浓度也不同。在某些实施方案中，对不同的细胞类型和产物，存在的肌肽浓度不同。通常， 浓度为足以增加产量和质量、但无毒性作用。对于本实例，范围包括但不限于5mM-100mM。 应当理解，所用肌肽浓度会根据细胞培养基而改变。对于特定细胞系，肌肽的适当浓度需要用常规小量实验确定，其中所述小量实验例如使用常规的方法测定2升的生物反应器。本领域普通技术人员使用本领域已知的细胞培养技术和诊断方法能够测定肌肽或其它抗衰老化合物的有利或最佳浓度，而无需过多实验。添加肌肽或其它抗衰老化合物而不是化学试剂的一个优点是对生存力的影响。一般地，当添加例如丁酸钠的化学试剂时细胞生长会停止、并且活细胞数减少(Kim 等人，Biotechnol Bioeng, 71 :184-193,184)。然而，下文的实例证明，与在不存在抗衰老化合物例如肌肽的细胞培养基中观察到情况相比，向细胞培养基中添加肌肽导致在收获时具有更高生存力。此外，此类含有肌肽的细胞培养物表现出增加的比产量 (specificproductivity)。由于对细胞生存力和比产量的积极影响,所以总产率更高。[0098]另一优点是抗衰老化合物例如肌肽降低了高分子量聚集体的量和/或酸性物质数目。高分子量聚集体的量和/或酸性物质的量的下降简化了蛋白质产物的纯化。使蛋白质分离更加有效，这降低了生产蛋白质产物的成本。在某些实施方案中，使用非肌肽的抗衰老化合物来降低高分子量聚集体的量和/或酸性物质的量。在某些实施方案中，使用两种或多种抗衰老化合物来降低高分子量聚集体的量和/或酸性物质的量。[0099]在某些实施方案中，细胞根据于2005年8月25日提交的美国专利申请系列号 11/213，308、11/213，317和11/213，633中所述的任一细胞培养方法生长，并且其中所述的每个专利都在此处以其整体引用作为参考。例如，在某些实施方案中，细胞可以在累积氨基酸浓度高于大约70mM的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞可以在摩尔累积谷氨酰胺与累积天冬酰胺比例小于大约2的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞可以在摩尔累积谷氨酰胺与累积总氨基酸的比率小于大约O. 2的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞可以在摩尔累积无机离子与累积总氨基酸的比例在大约O. 4-1之间的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞可以在累积谷氨酰胺和累积天冬酰胺联合浓度在大约16-36mM之间的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞可以在含有两种、三种、四种或全部五种前述培养基条件的培养基中生长。使用此类培养基使得高水平地产生蛋白质、并减少一些非期望因子例如铵和/或乳酸的积累。[0100]在某些实施方案中，细胞在一种或多种于2006年7月13日提交的美国临时专利申请号60/830，658中所述的条件下生长，并且其中所述专利在此处以其整体引入作为参考。例如，在某些实施方案中，细胞在含有浓度为大约10-600nM之间的锰的培养基中生长。 在某些实施方案中，细胞在含有浓度为大约20-100nM之间的锰的培养基中生长。在某些实施方案中，细胞在含有浓度为大约40nM的锰的培养基中生长。此类培养基在生长糖基化蛋白质中的使用导致产生具改良糖基化模式的糖蛋白(例如在一个或多个寡糖链中具有更大量的共价连接的糖残基)。[0101 ] 在本发明的某些实施方案中，根据本发明的一种或多种方法生产的蛋白质具有药学活性、并在制备药物中有用。根据本发明的一种或多种方法生产的蛋白质可以通过任意可用途径施用至受试者或者可以先制剂来递送，其中所述的施用途径包括但不限于肠胃外的(例如静脉内的)、皮内的、皮下的、经口的、鼻的、支气管的、眼的、经皮的(局部的)、经粘膜的、直肠的、以及阴道的途径。发明的药物组合物一般包括从哺乳动物细胞系表达的纯化蛋白质、递送剂(即如上文所述的阳离子聚合物、肽分子运载体、表面活性剂等)与可药用载体的组合。本文所用的语言“可药用载体”包括与药物施用相适应的溶剂、分散剂、包被剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物。[0102]将药物组合物制剂成与其预期的施用途径相适应。此类制剂为本领域技术人员已知。在某些实施方案中，将根据本发明生产的蛋白质制剂为口服和/或肠胃外形式。在某些实施方案中，为了施用上的便利和剂量一致，将此类口服和/或肠胃外形式制剂为单位剂型，其中每单位含有经计算能与所需药物载体组合产生预期治疗效果的预定量的活性蛋白质。本领域的普通技术人员知道适合本发明生产的蛋白质的单位剂量制剂。[0103]上文详细讨论了某些实施方案和方面。本公开将进一步通过下列非限制性实施例进行描述。然而，本领域的普通技术人员应当理解，对这些实施方案的多种改变在所附权利要求
书的范围之内。应当注意，添加肌肽和/或其它抗衰老化合物同样可应用于其它哺乳动物细胞培养物和蛋白质产物。权利要求
书和其等效物定义了本发明的范围，其不是并且不应当限于某些实施方案的描述或被某些实施方案的描述所限制。[0104]实施例[0105]实施例1[0106]皿规模(Dish S cale)的肌肽实验[0107]将MY0-29细胞系在具I升工作容积的生物反应器中在无血清生产培养基中培养， 并在第四天将温度从37°C调为31°C。将生物反应器的pH保持为7. 00、并且溶解氧为30% 空气饱和。然后在第4、7、10天从生物反应器中移出细胞培养物，并放入具8毫升工作容积的培养皿中，并放入31°C的培养箱，在其中培养皿培养物直到第12天。在第5和7天向细胞补充补料培养基。在第5天，向细胞培养物中加入10% (v/v)的补料培养基，并在第7天向细胞培养物加入5% (v/v)的补料培养基。分别在第4、7、10天向皿中加入IOmM肌肽，并在第12天收获细胞培养物。[0108]图1a显示在第7天添加肌肽对培养物中酸性峰量的影响。图1b显示在培养第7 天肌肽对高分子量聚集体的影响。图1c阐明在第4天添加肌肽与第7天、第10天相比对酸性峰的影响。图1d显示相同实验的、但为对高分子量聚集体的结果。总之，肌肽通过降低培养皿中的酸性峰和高分子量聚集体而具有积极影响。[0109]实施例2[0110]向细胞培养基中添加肌肽的影响[0111]在五个工作容积为I升的生物反应器中，将MY0-29细胞系以O. 9 X IO6个细胞/ 毫升的接种密度接种在无血清的接种培养基。在14天进程的第3、5、7和12天向所有生物反应器添加5% (v/v)的补料培养基。向两个对照生物反应器中第10天加入5% (v/v)补料培养基，并且其中一个含有肌肽。将生物反应器的条件设保持为37°C的温度、7. 00的pH、 并且溶解氧水平为30%空气饱和。搅动速率为200rpm，并且喷射气体为空气和7%二氧化碳的组合。[0112]将所有细胞培养4天，此时向两个生物反应器中加入20mM的肌肽，对照不加入肌肽，并在第四天将所有生物反应器的温度也都调为31°C。在生产进程的第14天收获生物反应器。在整个进程中采集样品以便监控细胞培养基的进程。对照如所预期实施。[0113]图2a显示日活细胞密度。图2b显示，具肌肽的生物反应器收获的日细胞生存力具有比无肌肽的两个生物反应器更高。图2c显示生物反应器的日滴度，并且显示，存在肌肽的两个生物反应器在收获时具有更高的滴度。图2d显示，具肌肽的培养物具有更好的累积性比细胞产量。图2e显示高分子量聚集体的量，并且显示高分子量聚集体在存有肌肽的生物反应器中减少。[0114]实施例3[0115]添加不同浓度肌肽的影响[0116]在4个工作容积为I升的生物反应器中，将MY0-29细胞以O. 4X IO6个细胞/毫升的接种密度接种到无血清的接种培养基中。在14天进程的第7天，向所有生物反应器中添加5% (v/v)的补料培养基。将生物反应器的条件保持为37°C的温度、7. 00的pH、并且溶解氧水平为30%空气饱和。搅动速率为200rpm，并且喷射气体为空气和7%二氧化碳的组合。所有细胞培养4天，此时将所有生物反应器的温度调为31°C。也在第四天，向一个生物反应器中加入20mM肌肽，向第二个生物反应器中加入40mM肌肽，对照不加入任何肌肽。在生产进程的第12天收获所有生物反应器。在整个进程中采集样品以便监控细胞培养基的进程。除了一个对照具有比先前的观察略低的日生存力之外，对照如所预期的那样进行。[0118]图3a显示日活细胞密度，除了具40mM肌肽的生物反应器外，其它不同的生物反应器都很相似。图3b显示具肌肽的生物反应器的日细胞生存力具有比两个无肌肽的对照生物反应器更高的收获生存力。图3c显示日滴度；添加肌肽的生物反应器与一个对照类似。具40mM肌肽的生物反应器培养物具有更高的累积的比细胞产量。(图3d)。图3e显示高分子量聚集体的量；总而言之，添加肌肽的生物反应器与对照相比，高分子量聚集体的量下降。[0119]尽管本 文描述了本公开的一些实施方案，但上文的描述只是说明性的。细胞培养领域的技术人员将进一步改变本文公开的实施方案，并且认为，所有这些改变都在所附权利要求
书定义的实施方案范围内。
权利要求
1.在细胞培养物中生产蛋白质的方法，其包括步骤在包含抗衰老化合物的细胞培养基中培养经遗传修饰以表达或以诱导或增强表达编码目的蛋白质的基因的哺乳动物细胞，其中所述基因在细胞培养条件下表达；和在条件下维持培养并维持足以允许蛋白质表达的时间；其中所述的细胞培养物呈现改善的细胞培养特性，所述细胞培养特性不同于缺少抗衰老化合物但其它方面相同的条件下在其它方面相同的培养基中观察到的相应的细胞培养特性；并且其中抗衰老化合物选自肌肽、乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽、和它们的组合；其中所述的改善的培养特性选自增加的滴度、增加的细胞比产量、增加的细胞生存力、 减少的高分子量聚集体累积、减少的酸性物质累积及其组合。
2.权利要求
1的方法，其中抗衰老化合物包含肌肽。
3.权利要求
1或2的方法，其中抗衰老化合物以大约5mM至大约IOOmM之间的浓度存在于细胞培养基中。
4.权利要求
1-3中任意一项所述的方法，其中向所述细胞培养物进一步提供补充组分。
5.权利要求
4的方法，其中所述的补充组分在补料培养基中提供。
6.权利要求
4或5的方法，其中所述的补充组分选自激素和/或其它生长因子、选自钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐的特定离子、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、 脂类、葡萄糖或丙酮酸、丙酮酸盐、及它们的组合。
7.权利要求
4、5或6的方法，其中所述的补充组分包括抗衰老化合物。
8.生产蛋白质的方法，其包括步骤在细胞培养基中培养经遗传修饰以表达或以诱导或增强表达编码目的蛋白质的基因的哺乳动物细胞，在利于生长期细胞生长的第一个温度或温度范围进行所述培养，其中所述基因在细胞培养条件下表达；将细胞培养基的温度或温度范围改变为利于蛋白质生产的第二个温度或温度范围； 在第二个温度或温度范围于细胞培养基中将宿主细胞培养通过转换期并进入生产期；其中向细胞培养物中加入抗衰老化合物，并因此使细胞培养物呈现改善的细胞培养特性，所述细胞培养特性不同于缺少抗衰老化合物但其它方面相同的条件下在其它方面相同的培养基中观察到的相应的细胞培养特性；并且其中抗衰老化合物选自肌肽、乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽、和它们的组合；其中所述的改善的细胞培养特性选自增加的滴度、增加的细胞比产量、增加的细胞生存力、减少的高分子量聚集体累积、减少的酸性物质累积及其组合。
9.权利要求
8的方法，其中在细胞培养过程开始时向细胞培养基中加入抗衰老化合物。
10.权利要求
8或9的方法，其中在生长期期间向细胞培养基中加入抗衰老化合物。
11.权利要求
8、9或IO的方法，其中在转换期期间向细胞培养基中加入抗衰老化合物。
12.权利要求
8-11中任意一项所述的方法，其中在生产期期间向细胞培养基中加入抗衰老化合物。
13.权利要求
8的方法，其中所述的抗衰老化合物包含肌肽。
14.权利要求
8-13中任意一项所述的方法，其中所述的抗衰老化合物以大约5mM至大约IOOmM之间的浓度存在于细胞培养基中。
15.权利要求
14的方法，其中向所述细胞培养物中进一步提供补充组分。
16.权利要求
15的方法，其中所述的补充组分在补料培养基中提供。
17.权利要求
15或16的方法，其中所述的补充组分选自激素和/或其它生长因子、选自钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐的特定离子、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂类、葡萄糖或丙酮酸、丙酮酸盐、及它们的组合。
18.权利要求
15、16或17的方法，其中所述的补充组分包括抗衰老化合物。
19.上述权利要求
中任意一项所述的方法，其中生产的蛋白质为与哺乳动物细胞异源的。
20.上述权利要求
中任意一项所述的方法，其中所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。
21.根据权利要求
1-20中任意一项所述的制备蛋白质的方法，其进一步包括从细胞培养基中分离蛋白质的步骤。
22.权利要求
21的方法，其中所述的蛋白质被进一步纯化或加工，用来制剂。
23.根据权利要求
21或22的方法，其中所述的蛋白质制剂成为药物组合物。
24.生产蛋白质的方法，其包括在细胞培养基中培养用编码目的蛋白质的基因转化了的哺乳动物细胞；向所述细胞培养基中加入有效量的抗衰老化合物，其中所述抗衰老化合物选自肌肽、 乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽、和它们的组合；维持所述细胞培养基直至所述目的蛋白质积聚；和分离所述目的蛋白质，其中相比所述目的蛋白质在无所述抗衰老化合物但在其它方面相同的条件下的生产，所述目的蛋白质的生产得到增强、细胞生存力得到维持、并且减少了1 分子量积聚体。
25.权利要求
24的方法，其中所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。。
26.权利要求
25的方法，其中所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。
27.权利要求
24的方法，其中所述的目的蛋白质为抗体。
28.权利要求
27的方法，其中所述的抗体为IgG同种型。
29.权利要求
27的方法，其中所述的抗体为重组的人抗体。
30.权利要求
27的方法，其中所述的重组抗体特异地结合至BMP-1I。
31.权利要求
27的方法，其中所述的抗体特异地与生长分化因子8或其表位反应。
32.权利要求
24的方法，其中所述的抗衰老化合物为肌肽
33.权利要求
24权利要求
25的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约5mM至大约IOOmM之间的浓度。
34.权利要求
24权利要求
24的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约IOmM至大约40mM之间的浓度。
35.权利要求
24的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约20mM的浓度。
36.权利要求
24的方法，其中所述的抗衰老化合物与补料培养基联合加入。
37.权利要求
24的方法，其中所述的细胞生存力在收获时被维持。
38.权利要求
24的方法，其中所述目的蛋白质的生产提高。
39.权利要求
24的方法，其中所述目的蛋白质的细胞比产量增加。
40.权利要求
24的方法，其中所述目的蛋白质的质量通过减少高分子量聚集体而提闻。
41.权利要求
24的方法，其中所述目的蛋白质的质量通过减少酸性物质而提高。
42.生产蛋白质的方法，其包括在细胞培养基中在利于生长期细胞生长的温度培养细胞系；将所述细胞培养基的所述温度至少变化一次到利于蛋白质生产的温度；将所述宿主细胞在所述细胞培养基中在所述利于蛋白质生产的温度培养通过转换期、 并进入生产期；在所述转换期期间向所述细胞培养基中加入一定浓度的抗衰老化合物，其中所述抗衰老化合物选自肌肽、乙酰肌肽、高肌肽、鹅肌肽、和它们的组合，并且其中相比所述目的蛋白质在无所述抗衰老化合物但在其它方面相同的条件下的生产，所述目的蛋白质的生产得到增强、细胞生存力得到维持、并且减少了高分子量积聚体。
43.权利要求
42的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约5mM至大约IOOmM之间的浓度。
44.权利要求
42的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约IOmM至大约40mM之间的浓度。
45.权利要求
42的方法，其中所述的抗衰老化合物为大约20mM的浓度。
专利摘要
提供了在包含抗衰老化合物例如抗氧化剂肌肽的细胞培养物中生产蛋白质的方法。根据本发明的教导，在包含抗衰老化合物的细胞培养基中生长的细胞呈现增加的生存力和产量。此外，在存在抗衰老化合物时生长的细胞培养物在细胞培养基中呈现降低水平的高分子量聚集体。
文档编号C12N5/00GKCN101297027 B发布类型授权 专利申请号CN 200680039626
公开日2013年4月3日 申请日期2006年10月24日
发明者Y-T·栾, W·王, P·索迪, D·德拉波, J·周 申请人:惠氏公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),