在分裂停止后的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的基因的制作方法

专利名称：在分裂停止后的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及在分裂停止后的产多巴胺型神经元中表达的新65B13基因。在帕金森氏病等神经变性疾病(PD)的移植疗法中使用的产多巴胺型神经元前体细胞可通过检测该基因有效分离。
背景技术：
多巴胺系统对哺乳动物脑中必需的运动调节、激素分泌调节、情感调节以及诸如此类的活动而言是极为重要的系统。因此，产多巴胺型神经传递的异常引起各种神经疾病。例如，帕金森氏病(Parkinson’s diseases，PD)是锥体外系统的神经变性疾病，它因中脑黑质中产多巴胺型神经元的专一性退化而发生(Harrison’s Principles of Internal Medicine，第2卷，23版，Isselbacher等编，McGraw-Hill Inc.，NY(1994)，2275-7)。口服给予L-DOPA(3，4-二羟苯丙氨酸)被作为基本治疗方法来补偿该疾病中多巴胺产量的减少；但已知该效果持续的时间不能令人满意。
最近尝试了一种治疗方法，其中含有产多巴胺型神经元始祖细胞的6-9周龄流产胎儿的中脑腹侧区域被移植，以补偿产多巴胺型神经元的损失(US5690927，Spencer等，(1992)，N.Engl.J.Med.3271541-8；Feed等(1992)N.Engl.J.Med.3271549-55；Widner等(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63；Kordower等(1995)N.Engl.J.Med.3321118-24；Defer等(1996)Brain 11941-50；Lopez-Lozano等(1997)Transp.Proc.29977-80)。然而，除细胞供给和伦理问题之外(Rosenstain(1995)Exp.Neurol.33106；Turner等(1993)Neurosurg.331031-7)，这种方法最近因各种其它问题受到批评，这些问题包括感染和污染的风险，移植的免疫排斥(Lopez-Lozano等1997)Transp.Proc.29977-980；Widner和Brudin(1988)Brain Res.Rev.13287-324)，以及由于胎儿组织主要依赖于脂类代谢而不是糖酵解造成的低成活率(Rosenstein(1995)Exp.Neurol.33106)。
为了解决伦理问题和供给的短缺，已提出使用例如猪脑皮质、层纹(stria)或中脑细胞的方法(例如，特表平10-508487号公报，特表平10-508488号公报或特表平10-509034号公报)。在这些方法中，需要涉及改变细胞表面抗原(MHC I类抗原)的复杂操作。因此，使用体外分化系统从非神经细胞例如胚胎干(ES)细胞和骨髓间质细胞而不是衍生自流产胎儿的细胞来产生产多巴胺型神经元被认为是具有前景的。将来使用ES细胞或患者自身神经干细胞进行的再生疗法的重要性似乎不断增加。有人提出，通过同时移植支持细胞(Sertoli’s cell)来进行局部免疫抑制的方法，作为消除移植排斥的方法(特表平11-509170号公报，特表平11-501818号公报，Selaxry和Cameron(1993)Cell Transplant 2123-9)。可以从具有匹配的MHC的亲属获得移植细胞，从其它个体、骨髓银行或脐带血银行获得骨髓。然而，如果有可能使用患者自己的细胞，那么排斥反应问题无需费力便可得以解决。
另一个问题是神经元始祖细胞可能分化成为不均一的细胞群。在治疗帕金森氏病时，需要选择性地移植产多巴胺的含有儿茶酚胺的神经元。过去提出的用于治疗帕金森氏病的移植细胞的例子包括纹状体(Lindvall等(1989)Arch.Neurol.46615-31；Widner等(1992)N.Engl.J.Med.3271556-63)，衍生自人胎儿神经元的无限增殖化细胞系(特表平8-509215号公报；特表平11-506930号公报；特表2002-522070号公报)，衍生自NT2Z细胞的人的分裂后神经元(特表平9-5050554号公报)，原始神经元(特表平11-509729号公报)，以及为了产生多巴胺等儿茶酚胺类物质而用外源基因转染的细胞和骨髓基质细胞(特表平2002-504503号公报；特表2002-513545号公报)。然而，其中没有一种仅含有产多巴胺型神经元或分化为产多巴胺型细胞的细胞。
有人提出，从未分化的细胞群中选择性地集中和分离产多巴胺型神经元的方法。在该方法中，将表达荧光蛋白的报道基因引入细胞群的各个细胞，使之受表达在产多巴胺型神经元中的酪氨酸羟化酶等基因的启动子/增强子控制，然后分离那些发出荧光的细胞。观察到活力状态的产多巴胺型神经元，然后将其集中、分离并鉴定(特表2002-51775号公报)。该方法需要导入外源基因的步骤，并且，在用于基因疗法时报道基因的存在引起毒性和免疫原性问题。

发明内容
目前，帕金森氏病(PD)移植疗法的主要问题之一是，流产胎儿中脑腹侧区或体外分化的产多巴胺型神经元前体细胞是多种细胞的混合物。考虑到神经回路形成中的安全性，优选使用仅含有目的细胞类型的分离的细胞。此外，考虑到肿瘤发生的风险，一般认为使用分离的分裂停止后的神经元更好。而且，考虑到细胞在脑中移植部位的存活，以及它们适当形成网络的能力，预期通过在尽可能早的阶段分离前体细胞可进一步改善治疗效果。因此，本发明人旨在分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因。
为了分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因，使用E12.5小鼠中脑腹侧和背侧RNA，通过改进扣除方法(subtraction method)(N-RDA；表现度示差分析法；RDA法(Listsyn NA(1995)Trends Genet.11303-7)，(“Methodfor Homogenizing the Amount of DNA Fragments and Subtraction Method”，日本专利申请2001-184757号(申请日2001年6月19日))扩增具有差异表达的基因，并分析所扩增的基因的序列。结果得到新基因65B13。使用RACE法确定基因的全长序列，获得了两种同工型，65B13-a和65B13-b。所述同工型的核苷酸序列表示为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。由核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列分别表示为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4(图1-4)。
根据这些基因通过原位杂交分析表达的结果，和通过比较脊髓生长标记Ki67和成熟标记NCAM获得的表达模式，认为65B13在刚刚停止分裂的神经前体细胞中瞬时表达。此外，中脑中65B13与酪氨酸羟化酶(TH)沿背-腹轴方向的表达区域完全一致，后者是产多巴胺型神经元的标记基因。因此认为，63B13在刚刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞中特异地瞬时表达(图10和11)。
使用抗-65B13抗体通过免疫染色进一步证明原位杂交的结果(图13)。此外，表达65B13的细胞群可使用抗-65B13抗体通过流式细胞仪有效分离(图14)。
依据上述结果，通过从中脑腹侧区或含有体外分化的产多巴胺型神经元的细胞培养物中分离65B13表达细胞，可以将抗-65B13抗体用于获得纯的早期产多巴胺型神经元前体细胞。以这种方式获得的细胞仅含有分裂停止后的前体细胞，并且由于只有目的细胞类型被分离，这些细胞即使用于移植疗法时也非常安全。由于使用了最早期的可能的前体细胞，在其存活率、网络形成能力等方面可预期高的治疗效能。此外，在不能用这些分裂结束后马上获得的早期前体细胞获得最好的治疗效果的情况、以及在需要使用成熟细胞的情况中，通过该方法得到的早期前体细胞可进行简单地体外培养成熟直至适当的分化阶段。因此，可容易地制备适合于靶移植疗法的分化阶段的材料(图12)。
此外，纯化的产多巴胺型神经元前体细胞还具有寻找帕金森氏病治疗标靶、分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因或产多巴胺型神经元前体细胞成熟过程中阶段特异性基因等用途。另外，使用本发明方法获得的最早的可能的前体细胞还可用于阐明产多巴胺型神经元的成熟过程，以便用成熟作为指标来筛选系统等。
更具体地，本发明涉及[1]含有选自核苷酸序列(1)-(5)的序列的多核苷酸，其中核苷酸序列编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽，或其抗原片段(1)含有SEQ ID NO1的第177-第2280个核苷酸或SEQ ID NO2的第127-第2079个核苷酸的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；(2)编码氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；(3)编码缺失信号序列部分的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；(4)编码其中缺失、插入、取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；和，(5)在严格条件下与核苷酸序列(1)杂交的核苷酸序列；[2]含有如[1]所述的多核苷酸的载体；[3]含有如[1]所述的多核苷酸或如[2]所述的载体的宿主细胞；[4]由如[1]所述的多核苷酸编码的多肽；[5]如[4]所述多肽的片段，其中所述多肽片段含有至少8个氨基酸残基；[6]如[4]所述的多肽或如[5]所述的多肽片段的抗体；[7]编码如[5]所述的多肽片段的核苷酸链； 选择产多巴胺型神经元的方法，所述方法包括将如[6]所述的抗体与认为含有产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触的步骤；[9]选择产多巴胺型神经元的方法，所述方法包括将含有如[4]所述多肽的至少胞外部分的肽与认为含有产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触的步骤；[10]刚刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞，所述细胞通过[8]或[9]所述的方法选择；[11]分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因以及产多巴胺型神经元成熟过程的各个阶段的特异性基因的方法，其中所述方法包括以下步骤检测和分离在如[10]所述的前体细胞或从所述前体细胞分化、诱导或增殖得到的细胞中特异性表达的基因；和[12]用成熟作为指标进行筛选的方法，所述方法包括以下步骤将试验物质与如[10]所述的前体细胞接触；检测由接触步骤引起的前体细胞的分化和增殖。
<多核苷酸>
本发明的多核苷酸可用于通过遗传工程技术制备抗原，以制备可用于选择产多巴胺型神经元前体细胞的抗体。本发明的多核苷酸编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽，并包含SEQID NO1的核苷酸177-2280(图1和2)，SEQ ID NO2的核苷酸127-2079(图3和4)，或与这些序列中任何一个互补的序列。
本文中，“多核苷酸”指含有多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的核苷酸或核苷酸对的聚合体，并包括DNA、cDNA、基因组DNA、化学合成DNA和RNA。如果需要，多核苷酸还可包括非天然发生的核苷酸，例如4-乙酰胞苷、5-(羧基羟基甲基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β-D-半乳糖基辫苷、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷、β-D-甘露糖基辫苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫-N6-异戊烯腺苷、N-((9-β-D-核糖呋喃基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-羟基乙酸-甲酯、尿苷-5-羟基乙酸、wybutoxosine、假尿苷、辫苷、2-硫基胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-核糖呋喃基嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。
此外，本发明的多核苷酸编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽，并包含SEQ ID NO3(图1、3和5)或SEQ ID NO4(图2、4和5)描述的氨基酸序列，或它们的互补序列。除核苷酸序列SEQ ID NO1和2外，编码这种氨基酸序列的核苷酸序列包括那些由于遗传密码简并性而与序列SEQ ID NO1和2有差别的序列。可以根据宿主密码子使用频率，通过选择具有高表达效率的核苷酸序列，而用遗传工程技术设计本发明的多核苷酸来表达多肽(Grantham等，(1981)NucleicAcids Res.943-47)。本发明的多核苷酸还包含编码缺乏信号序列部分的氨基酸序列SEQ ID NO3或4的氨基酸序列的核苷酸序列。氨基酸序列SEQID NO3或4的最初17个氨基酸残基相当于信号序列。
本发明的多核苷酸还包含一种核苷酸序列，或与该核苷酸序列互补的序列，其编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽或其抗原片段，其中在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或添加了一个或多个氨基酸。众所周知，含有通过缺失、插入、取代或添加一个或多个氨基酸所得到的氨基酸序列的突变多肽可以保持与原始多肽相同的生物活性(Mark等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-6；Zoller和Smith(1982)Nucleic Acids Res.106487-500；Wang等.(1984)Science 2241431-3；Dalbadie-McFarland等.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA796409-13)本文中，氨基酸取代指将序列中一个或多个氨基酸残基改变为不同类型的氨基酸残基的突变。当由本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列通过取代而改变时，如果要保持蛋白质的功能，优选进行保守取代。保守取代是指改变序列，以使它编码与取代前的氨基酸具有相似特性的氨基酸。氨基酸基于它们的特性可分为非极性氨基酸(Ala，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Val)，不带电氨基酸(Asn，Cys，Gln，Gly，Ser，Thr，Tyr)，酸性氨基酸(Asp，Glu)，碱性氨基酸(Arg，His，Lys)，中性氨基酸(Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val)，脂肪族氨基酸(Ala，Gly)，支链氨基酸(Ile，Leu，Val)，羟基氨基酸(Ser，Thr)，酰胺类氨基酸(Gln，Asn)，含硫氨基酸(Cys，Met)，芳族氨基酸(His，Phe，Trp，Tyr)，杂环氨基酸(His，Trp)，亚氨基酸(Pro，4Hyp)等。具体地，为了保持蛋白质特性，在Ala，Val，Leu，和Ile；Ser和Thr；Asp和Glu；Asn和Gln；Lys和Arg；以及Phe和Tyr之间取代是优选的。突变氨基酸的数量和位点没有具体限制，只要多核苷酸编码的氨基酸具有65B13抗原性。
编码在序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或添加一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列的多核苷酸，可根据例如定点诱变的方法制备，这些方法描述于(Molecular Coning，A Laboratory Manual第二版.(ColdSpring Harbor Press(1989))，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley和Sons(1987-1997)；具体是第8节，1-8.5)，Hashimoto-Goto等(1995)Gene 152271-5，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-92，Kramer和Fritz(1987)Method.Enzymol.154350-67，Kunkel(1988)Method.Enzymol.852763-6)等。
本发明的多核苷酸还可以是含有在严格条件下与包含SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或与这些序列中的任何一个互补的序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽，或其抗原片段。除两种具有本发明实施例中获得的序列SEQID NO1和2的65B13同工型外，还可能存在其它同工型和等位突变。因此，所述其它同工型和等位突变也包括在本发明的多肽中。通过使用由含有SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SFQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列组成的多核苷酸探针，以集落杂交、蚀斑杂交或DNA印迹等已知杂交方法，可从衍生自人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、猪、母牛、山羊和绵羊等动物的cDNA文库或基因组文库获得这种多肽。参见“Molecular Coning，A Laboratory Manual第二版.”(Cold Spring Harbor Press(1989))的cDNA文库构建方法。另外，还可使用商业购得的cDNA文库或基因组文库。
更具体地，在cDNA文库构建中，首先通过胍超速离心(Chirwin等(1979)Biochemistry 185294-5299)或AGPC(Chomczynski和Sacchi(1987)Anal.Biochem.162156-159)等已知技术，从表达本发明多核苷酸的细胞、器官、组织等中制备总RNA，随后使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等纯化mRNA。还可使用直接制备mRNA的试剂盒，例如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)。然后，使用反转录酶从获得的mRNA合成cDNA。cDNA合成试剂盒例如AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Seikagaku Corporation)也经商业购得。还可使用用5’-RACE方法通过PCR合成和扩增cDNA的其它方法(Frohman等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-9002；Belyavsky等(1989)Nucleic Acid Res.172919-32)。此外，为了构建含有高百分比全长克隆的cDNA文库，还可使用例如寡-加帽方法等已知技术(Maruyama和Sugano(1994)Gene 138171-4；Suzuki(1997)Gene 200149-56)。以这种方法获得的cDNA然后掺入适当的载体。
本发明杂交条件的例子包括“2xSSC，0.1％SDS，50℃”，“2xSSC，0.1％SDS，42℃”和“1xSSC，0.1％SDS，37℃”。更严格条件的例子包括“2xSSC，0.1％SDS，65℃”，“0.5xSSC，0.1％SDS，42℃”和“0.2xSSC，0.1％SDS，65℃”。更具体地，使用快速杂交缓冲液的方法(Amersham LifeScience)可以如下完成在68℃预杂交30分钟或更长时间，加入探针使之在68℃1小时或更长时间形成杂交体，在2xSSC/0.1％SDS中室温洗涤3次，每次20分钟，在1xSSC/0.1％SDS中37℃洗涤3次，每次20分钟，最后在1xSSC/0.1％SDS中50℃洗涤2次，每次20分钟。这还可使用例如Expresshyb Hybridization Solution(CLONTECH)，通过在55℃预杂交30分钟或更长时间，加入标记探针并在37℃-55℃保温1小时或更长时间，在2xSSC/0.1％SDS中室温洗涤3次，每次20分钟，并用1xSSC/0.1％SDS在37℃洗涤20分钟1次来完成。本文中，可通过提高预杂交、杂交或第二次洗涤的温度来获得更严格的条件。例如，60℃的预杂交和杂交温度可提高到更严格的68℃。除例如缓冲液盐浓度和温度等因素外，本领域普通的技术人员还可整合探针浓度、探针长度和反应时间等其它因素，以得到本发明实施例中获得的小鼠65B13同工型和等位突变，以及来自其它生物的对应基因。
关于杂交步骤的详细资料，可查阅参考文献例如Molecular Cloning，ALaboratory Manual第二版(Cold Spring Harbor Press(1989)；9.47-9.58节)，Current Protocol in Molecular Biology(John Wiley和Sons(1987-1997)；6.3-6.4节)，DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach第二版(Oxford University(1995)；特别是2.10节的条件)。杂交多核苷酸的例子包括含有与包含SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列具有至少50％或更多，优选70％，更优选80％和甚至更优选90％(例如95％或更多，或99％)的同一性的核苷酸序列的多核苷酸。这种同一性可通过BLAST算法确定(Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-8；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-7)。基于这一算法开发的程序的例子包括测定氨基酸序列同一性的BLASTX程序，和测定核苷酸序列同一性的BLASTN程序(Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215403-10)。这些程序可用于本发明的序列(分析方法的具体例子见http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
65B13同工型或等位突变体，以及具有65B13样结构或功能的其它基因可通过基于SEQ ID NO1和2的核苷酸序列设计引物，使用基因扩增技术(PCR)，从例如人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、鸡、猪、母牛、山羊和绵羊等动物的cDNA文库和基因组文库获得(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons(1987)6.1-6.4节)。
例如，BLAST搜索结果揭示了功能未知的3种人序列与本发明小鼠65B13的核苷酸序列(GenBank登录号XM 048304，AL136654，BC007312)具有84％的同一性。它们各自的核苷酸序列为SEQ ID NO5、7和9，预测的氨基酸序列为SEQ ID NO6、8和10，并被认为是小鼠65B 13的人同源物。根据本发明方法，这种人同源物可用于选择人产多巴胺型神经元前体细胞。根据报道信息，认为这三个序列都是衍生自染色体19上相同基因的序列。这些序列中，两个序列AL136654(SEQ ID NO7)和BC007312(SEQID NO9)是cDNA片段，而认为第三个序列XM 048304(SEQ ID NO5)是从基因组预测的mRNA序列。这些预测的序列具有与本发明65B 13大小相似的ORF，并且预测的氨基酸序列与65B13共享84％的同一性。
本发明的多核苷酸序列可使用常规序列测定方法确定。例如，可使用二脱氧核苷酸链终止法(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463)。此外，还可使用适当的DNA测序仪分析序列。
<核苷酸链>
此外，本发明提供了与本发明的多核苷酸互补的包含至少15个核苷酸的核苷酸链。本文中，“互补序列”不仅是指有至少15个连续核苷酸完全与模板配对的那些核苷酸序列，还包括有至少70％，优选80％，更优选90％，甚至更优选95％或更多(例如97％或99％)的连续核苷酸与模板配对的那些核苷酸序列。配对形成是指链形成，其中在模板多核苷酸的核苷酸序列中T(RNA时为U)对应A，A对应T或U，G对应C，C对应G。可通过与上述多核苷酸杂交中使用的方法相似的方法测定同一性。
本发明这种核苷酸链可用做检测或分离用探针，或作为扩增本发明多核苷酸的引物。当用做探针时所述核苷酸链通常由15-100个核苷酸组成，优选15-35个，当用做引物时，至少由15个核苷酸组成，优选30个。可设计引物，以便在其5’-端加入限制性内切酶识别序列，标记等，并且在3’-端加入与靶序列互补的序列。本发明的核苷酸链可与本发明的多核苷酸杂交。而且，细胞内本发明多核苷酸的突变可使用这些探针或引物检测。某些情况下，这些突变可引起本发明多肽活性或表达的异常，因此，认为本发明核苷酸链具有疾病诊断等用途。
另外，本发明核苷酸链包括反义核酸和核酶，反义核酸通过与mRNA或DNA结合抑制本发明多核苷酸细胞表达，核酶通过特异性裂解mRNA来进行抑制。
抑制靶基因表达的反义机制的例子包括(1)通过形成三联体抑制转录起始，(2)通过在由RNA聚合酶形成的局部开环结构位点形成杂交抑制转录，(3)合成过程中通过与RNA形成杂交抑制转录，(4)通过在内含子-外显子连接区形成杂交抑制剪接，(5)通过在剪接体形成位点形成杂交抑制剪接，(6)通过与mRNA形成杂交抑制mRNA迁移到细胞质，(7)通过在加帽部位或poly A添加部位形成杂交抑制剪接，(8)通过在起始因子结合部位形成杂交抑制翻译起始，(9)通过在核糖体结合部位形成杂交抑制翻译，(10)通过在mRNA编码区或多核糖体结合部位形成杂交抑制肽链延长，和(11)通过在核酸/蛋白质作用位点形成杂交抑制基因表达(Hirashima和Inoue，“New Biochemistry Experiment Course 2，Nucleic Acids IV，Gene Replicationand Expression”，Japanese Biochemical Society编，Tokyo Kagaku Dozin出版，319-347(1993))。
包含于本发明核苷酸链的反义核酸可以是通过上述(1)-(11)中描述的任何一个机制抑制基因表达的核酸。也就是，它可包含表达被抑制的靶基因的不但编码区而且非编码区序列的反义序列。可通过与允许其表达的适当的调控序列连接使用编码反义核酸的DNA。反义核酸不需要与靶基因的编码区或非编码区完全互补，只要它能有效抑制基因表达。这种反义核酸具有至少15bp或更长的链长，优选100bp或更长，更优选500bp或更长，一般在3000bp以内，优选在2000bp以内，更优选在1000bp以内。这种反义核酸与靶基因转录产物的互补链优选具有90％或更多的同一性，更优选95％或更多。这些反义核酸可根据硫代磷酸盐(phosphorthionate)方法(Stein(1988)Nucleic Acid Res.163209-3221)使用本发明的多核苷酸制备。
“核酶”是指具有RNA成分的催化剂的总称，并且核酶被大致分为大核酶和小核酶。大核酶是酶切核酸磷酸酯键的酶，并在反应结束时带着5’-磷酸和3’-羟基离开反应位点。大核酶进一步分成(1)I组内含子RNA，它在5’-剪接位点进行尿苷起始的反式酯化反应，(2)II组内含子RNA，它用合成的套索结构进行两步自我剪接反应，和(3)RNA酶P的RNA成分，它通过水解反应在其5’端酶切前体tRNA。相反，小核酶是酶切RNA的相对比较小的结构单元(约40bp)，形成5’-羟基和2’-3’环状磷酸。小核酶包括，例如，锤头型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225)和发卡型核酶(Buzayan(1986)Nature 323349；Kikuchi和Sassaki(1992)Nucleic Acids Res.196571；H.Kikuchi(1992)Chemistry and Biology 30112)。由于核酶容易改变和合成，所以已知各种修饰方法。例如，通过设计核酶底物结合部分与近靶位点的RNA序列互补，可制备识别和酶切靶RNA中的核苷酸序列UC、UU或UA的锤头型核酶(Koizumi等(1988)FEBS Lett.228225；M.Koizumi和E.Ohtsuka(1990)Protein，Nucleic Acid，和Enzyme 352191；Koizumi等(1989)Nucleic Acid Res.177059)。发卡型核酶也可使用已知的方法设计和制备(Kikuchi和Sasaki(1992)Nucleic Acid Res.196571；H.Kikuchi(1992)Chemistry and Biology 30112)。
包含于本发明核苷酸链中的反义核酸和核酶也可用做衍生自反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒等的病毒载体，使用脂质体的非病毒载体，或裸DNA，以使用基因疗法的回体或体内方法控制细胞中基因表达。
本发明核苷酸链的核苷酸序列可通过相同于上述多核苷酸使用方法证实。
<载体>
本发明提供含有本发明多核苷酸的载体。本发明载体用于在宿主细胞中携带本发明的多核苷酸，或者用于表达由所述多核苷酸编码的多肽。所述载体包括各种载体，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、克隆载体和表达载体(Molecular Cloning，A Laboratory Manual第二版，Cold Spring HarborPress(1989)；Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987))。在优选实施例中，本发明的多核苷酸通过与调节序列下游连接在宿主细胞中表达，该细胞中导入了本发明的载体。本文中，“调节序列”包括原核宿主细胞情况下的启动子、核糖体结合位点和终止子，以及真核宿主细胞情况下的启动子和终止子，在某些情况下，还可包括反式激活蛋白、转录因子、稳定转录产物的poly A信号、剪接和多腺苷酸化信号及其它。这种调节序列包含与之连接的多核苷酸表达所需的所有成分。另外，本发明的载体优选包含选择标记。此外，将细胞内表达的多肽导入内质网腔或当宿主是革兰氏阴性微生物时的胞外周质或胞外区所需的信号肽，也可通过与目的多肽连接掺入表达载体。这种信号肽可包括在天然发生的65B13中可见的17个氨基酸残基。换句话说，它可以是衍生自不均一蛋白的信号肽。此外，可加入接头，且需要时可插入起始(ATG)或终止密码子(TAA、标记或TGA)。
本发明载体优选表达载体。“表达载体”是指能体外表达在靶宿主细胞中的表达载体中编码的多肽的构建物。本发明的表达载体包括克隆载体、双运载体、整合载体等。表达过程包括将包含于表达载体上的编码序列转录为可翻译的mRNA，翻译mRNA为本发明的多肽，在某些情况下，表达的多肽分泌到内质网腔、外周胞质或胞外区。
pBEST(Promega)是能体外表达多核苷酸的载体的例子。另外，能在例如E.coli等的原核细胞中表达多核苷酸的启动子的例子包括PL、araB(Better等.(1988)Science 2401041-3)、LacZ(Ward等.(1989)Nature 341544-6；Ward等.(1992)FASEB J.62422-7)、trp、tac和trc(lac和trp的融合)。此外，也可使用衍生自trpA、噬菌体和rrnB核糖体RNA的终止子。并且，在E.coli中使用的载体优选具有在宿主内扩增载体的“ori”，以及用于选择转化宿主的标记基因。优选使用抗药基因，这使得宿主通过例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素和氯霉素等药物而被识别。可使用pelB信号序列，特别是如果多肽将分泌到外周胞质时(Lei等.(1987)J.Bacteriol.1694379)。例子包括M13载体、pUC载体、pBR322、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、pEGFP、pBluescript(Stra标记ene)和pET(Invitrogen；该载体的优选宿主是表达T7聚合酶的BL21)。另外，亚克隆或切除载体可具体通过pGEM-T、pDIRECT和pT7说明。
除E.coli外细菌宿主的例子是杆菌，载体例子包括pUB110和pc194载体。具体例子包括衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的pPL608和pKTH50。还开发了载体用于宿主细菌，例如，假单胞菌属的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)，短杆菌属(Brevibacterium)例如乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(pAJ43(Gene 39281(1985)等))，棒杆菌属(Corynebacterium)例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)(pCS11(未经审查而出版的日本专利申请Sho57-183799)；pCB101(Mol.Gen.Genet.196175(1984)，等))，链球菌属(Streptococcus)(pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26239(1985))；pGK1(Appl.Environ.Microbiol.5094(1985))等)，乳杆菌属(Lactobacillus)(pAMβ1(J.Bacteriol.137614(979)，等))，红球菌属(Rhodococcus)例如紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(J.Gen.Microbiol.1381003(1992))，和链霉菌属(Streptomyces)例如变青链霉菌(Streptomyces lividans)和弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)(参见Genetic Manipulation of StreptomycesALaboratory Manual，Hopwood等，Cold Spring Harbor Laboratories(1985；pIJ486(Mol.Gen.Genet.203468-478(1986))，pKC1064(Gene 10397-9(1991))，pUWL-KS(Gene 165149-50(1995)))。微生物宿主中有用的载体见文献例如“Basic Microbiology Course 8-Genetic Engineering”(Kyoritsu Publishing)。可利用例如氯化钙方法(Mandel and Higa(1970)J.Mol.Biol.53158-162；Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166557-580)和电穿孔等技术将载体导入宿主。
此外，真核细胞宿主中的表达调控元件通过酵母宿主的AOX1和GAL1启动子举例说明。衍生自酵母的表达载体的例子包括Pichia Expression Kit(Invitrogen)、pNV11和SP-Q01。可用于酵母的载体详细描述于例如Adv.Biochem.Eng.4375-102(1990)和Yeast 8423-88(1992)中。更具体地，载体例如YRp、Yep、Ycp和Yip可用于酵母菌属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。允许插入大量基因拷贝并可稳定保持插入基因的整合载体(例如EP537456)特别有用。其它载体的例子包括衍生自酿酒酵母的2μm载体、pKD1载体(J.Bacteriol.145382-90(1981)，pGK11-衍生载体、和克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)例如乳克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)等克鲁维酵母菌自主复制基因KARS载体；Mol.Cell.Biol.680(1986)中描述的载体和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的pAUR224(Takara Shuzo)；Zygosaccharomyces属的pSB3-衍生载体(NucleicAcids Res.134267(1985))；描述于丈献，例如Yeast 7431-43(1991)，Mol.Cell.Biol.53376(1985)和Nucleic Acids Res.153859(1987)中的Pichia例如Pichia angusta和Pichia pastoris的载体；描述于特开平8-173170中的载体，或使用衍生自麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的ARS(Agri.Biol.Chem.5115871987))的麦芽糖假丝酵母、白色念珠菌(C.albicans)、热带假丝酵母(C.tropicalis)或产朊假丝酵母(C.utilis)的载体；描述于Biotechnology 7283-7(1989)中Trend中的曲霉属(Aspergillus)例如黑曲霉(Aspergillus niger)、和米曲霉(A.oryzae)的载体；和木霉菌属(Trichoderma)中使用衍生自胞外纤维素酶基因的启动子的载体(Bio/technology 7596-603(1989))。
对于哺乳动物细胞或其它动物细胞宿主，可使用腺病毒晚期启动子(Kaufman等(1989)Mol.Cell.Biol.9946)、CAG启动子(Niwa等(1991)Gene108193-200)、CMV立即早期启动子(Seed and Aruffo(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843365-9)、EF1α启动子(Mizushima等(1990)Nucleic Acids Res.185322；Kim等(1990)Gene 91217-23)、HSV TK启动子、SRα启动子(Takebe等(1988)Mol.Cell.Biol.8466)、SV40启动子(Mulligan等(1979)Nature 277108)、SV40早期启动子(Genetic Engineering Vol.3，Williamson编，Academic Press(1982)83-141)、SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers(1982)J.Mol.Appl.Genet.1385-94)、RSV(劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus))-LTR启动子(Cullen(1987)Methods Enzymol.152684-704)、MMLV-LTR启动子、CMV增强子、SV40增强子和珠蛋白内含子等。
此外，载体优选包含抗药基因以允许细胞通过药物例如新霉素或G418识别。为了提高细胞内基因拷贝的数量，拷贝数可通过使用氨甲喋呤(MTX)在例如核酸合成途径中缺损的CHO宿主中，使用具有DHFR基因以补偿所述缺损的载体例如pCHOI扩增。另一方面，为了瞬时表达基因，在其染色体上具有SV40T抗原基因的COS细胞可用做宿主，可使用具有SV40复制起点的载体，例如pcD、或具有腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)、多形瘤病毒等的复制起点的载体。此外，编码氨基糖苷转移酶(APH)、胸苷激酶(TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)等的基因可用做增加基因拷贝数量的选择性标记。已知适当的载体例子是Okayama-Berg表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8(Nature 329840-2(1987))、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCOBRL)、pSV2dhfr(Mol.Cell.Biol.1854-64(1981))、pEF-BOS(Nucleic AcidsRes.185322(1990))、pCEP4(Invitrogen)、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13、和pME18S(Mol.Cell.Biol.8466-72(1988))。
具体地，在动物体内表达本发明多核苷酸使用的载体的例子包括腺病毒载体例如pAdexlcw和反转录病毒载体例如pZIPneo。载体可使用如下方法导入宿主，例如腺病毒法、电穿孔法(Cytotechnology 3133(1990))，阳离子脂质体法(Cationic Liposome DOTAP(Boehringer Mannheim)等)，导入使用带正电的聚合体、静电型脂质体法、内型脂质体法、基因枪法、脂质体法、脂转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413(1987))、磷酸钙法(未经审查的而出版的日本专利申请.Hei 2-227075号)、受体-介导的基因导入法、反转录病毒法、DEAE葡聚糖法、病毒-脂质体法(Experimental MedicineSupplement，″Basic Technology of Gene Therapy″，Yodosha(1997)；Experimental Medicine Supplement，″Experimental Method of GeneIntroduction and Expression Analysis″，Yodosha(1997)；J.Clin.Invest.931458-64(1994)；Am.J.Physiol.271R1212-20(1996)；Molecular Medicine 301440-8(1993)；Experimental Medicine 121822-6(1994)；Protein，Nucleic acid，和Enzyme 421806-13(1997)；Circulation 92(增刊II)479-82(1995))，和DNA直接转化法。还可使用用衍生自除腺病毒和反转录病毒外的其它病毒的病毒载体制备的载体，这样的病毒例如腺伴随病毒、新培斯病毒(Sindbisvirus)、仙台病毒(Sendai virus)、披膜病毒(Togavirus)、副粘病毒(Paramyxovirus)、痘病毒(poxvirus)、、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、疱疹病毒(herpes virus)、慢病毒(lentivirus)和痘苗病毒(vaccinia virus)。活体给药可使用回体或体内方法进行。
另外，昆虫表达系统作为表达不均一多肽的系统也是已知的。例如，外源基因可使用苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(Autographa californianucleopolyhedrosis virus)(AcNPV)作为载体，在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉蚊夜蛾(Trichoplusia)幼虫细胞中表达。本文中，将目的外源基因克隆到病毒的非必需区。例如，它可在多角体蛋白启动子控制下与区域连接。在这种情况下，多角体蛋白基因失活，产生缺乏外壳蛋白的重组病毒，目的多肽在已用病毒感染的草地夜蛾、粉蚊夜蛾幼虫等细胞中表达(Smith(1983)J.Virol.46584；Engelhard(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-7)。其它已知的昆虫细胞-衍生的表达载体的例子包括Bac-to-BAC杆状病毒表达系统(Bigco BRL)和pBacPAK8。
当植物细胞用做宿主时，例如，可使用利用花椰菜花叶病毒的35S启动子的载体。将载体导入植物细胞的已知方法包括PEG、电穿孔、土壤杆菌方法和基因枪方法。
DNA插入载体可使用限制性内切酶位点在连接酶反应中进行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987)11.4-11.11节；Molecular Cloning，A Laboratory Manual第二版，Cold Spring HarborPress(1989)5.61-5.63节)。
<宿主>
本发明提供包含本发明多核苷酸或载体的宿主。可使用体外或体内制备系统制备本发明的多肽。本发明宿主包括古细菌、细菌、真菌、植物、昆虫、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳动物原核和真核细胞。本发明宿主在其细胞中包含编码本发明多肽的多核苷酸。只要多核苷酸不在宿主细胞基因组天然发生的位置上，所述多核苷酸可由其自身的启动子调控，掺入宿主基因组，或维持染色体外结构。
细菌宿主的例子包括属于大肠杆菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)或芽胞杆菌(Bacillus)的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，例如E.coli(JM109，DH5α，HB101和XL1Blue)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。
真核生物宿主的例子包括真菌细胞例如酵母、高等植物(烟草)(Nicotiana tabacum)衍生细胞、昆虫(果蝇(Drosophila)S2、草地夜蛾(Spodoptera)Sf9、Sf21、Tn5)、鱼类、两栖类(非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)(Valle等(1981)Nature 291358-40)、爬行类、鸟类和哺乳类(CHO(J.Exp.Med.108945(1995)。其中，包括基因缺陷型dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-20(1980))和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 601275(1968))、COS、Hela、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤细胞)、骨髓瘤、非洲绿猴肾细胞株系(Vero)、Namalwa、Namalwa KJM-1和HBT5637(未经审查而出版的日本专利申请Sho 63-299号)，和植物(马铃薯、烟草、玉米、稻、油菜、大豆、番茄、小麦、大麦、黑麦、苜蓿和大麻)。除属于糖酵母菌属(Saccharomyces)的酿酒酵母，和属于毕赤酵母属(Pichia)的酵母外，使用真菌作为宿主的表达系统，例如属于曲霉属的黑曲霉细胞也是已知的。
将载体导入宿主细胞可使用如下方法进行，例如电穿孔(Chu et al.(1987)Nucleic Acids Res.151311-26)、阳离子脂质体方法、电脉冲穿孔(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons(1987)9.1-9.9节)、使用显微玻管直接注射、显微注射、脂转染法(Derijard(1994)Cell 71025-37；Lamb(1993)Nature Genetics 522-30；Rabindran等.(1993)Science 259230-4)，脂转染胺(lipofectamine)方法(GIBCO-BRL)，磷酸钙方法(Chen和Okayama(1987)Mol.Cell.Biol.72745-52)，DEAE葡聚糖方法(Lopata等.(1984)Nucleic Acids Res.125707-17；Sussman和Milman(1985)Mol.Cell.Biol.41642-3))和FuGene6试剂(Boehringer-Mannheim)。
<多肽和多肽片段>
本发明的“多肽”是指由本发明的多核苷酸编码的肽多聚体。优选的例子包括具有氨基酸序列SEQ ID NO3或4的蛋白质。本发明的多肽可包含天然产生或修饰的氨基酸残基。氨基酸残基修饰的例子包括酰化作用、乙酰化作用、酰胺化作用、精氨酰化作用、GPI锚形成、交联、γ-羧基化作用、环化作用、共价交联形成、糖基化作用、氧化作用、脂类或脂肪衍生物的共价联结、胱氨酸形成、二硫键形成、硒酰基化(selenoylation)、脱甲基作用、蛋白质片段化处理、核苷酸或核苷酸衍生物共价联结、羟基化作用、焦谷氨酸形成、黄素共价联结、异戊二烯化、与血红素部分共价联结、磷脂酰肌醇的共价联结、甲酰化作用、豆蔻酰化、甲基化作用、遍在蛋白化、碘化作用、消旋作用、ADP-核糖基化、硫酸盐化和磷酸化。此外，本发明多肽包括含有信号肽部分的前体，缺少信号肽部分的成熟蛋白，和用其它肽序列修饰的融合蛋白。添加至本发明多肽的肽序列可以选自，有利于用诸如pcDNA3.1/Myc-His载体(Invitrogen)纯化蛋白质的序列，或在重组蛋白制备中赋予稳定性的序列。这种序列的例子是流感病毒血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、物质P、多组氨酸标记(例如6xHis和10xHis)、蛋白质C片段、麦芽糖-结合蛋白(MBP)、免疫球蛋白恒定区、α-微管蛋白片段、β-半乳糖苷酶、B-标记、c-myc片段、E-标记(单克隆噬菌体上的表位)、FLAG(Hopp等.(1988)Bio/Technol.61204-10)、lck标记、p18HIV片段、HSV-标记(人单纯疱疹病毒糖蛋白)、SV40T抗原片段、T7-标记(T7基因10蛋白)、和VSV-GP片段(水泡性口炎病毒糖蛋白)。
此外，本发明还提供本发明多肽的片段。本发明多肽片段与本发明多肽的部分相同，含有至少8个氨基酸残基或更多(例如8、10、12或15个氨基酸残基或更多)。特别优选的片段可以是缺少氨基端、羧基端和跨膜结构域的多肽片段。本发明多肽片段包括含有α-螺旋和α-螺旋形成区、α-两亲性区、β-折叠和β-折叠形成区、β-两亲性区、底物结合区、高抗原指数区、螺旋(coil)和螺旋形成区、亲水区、疏水区、转角和转角形成区和表面形成区。本发明多肽片段可以是任何片段，只要它具有本发明多肽的抗原性。多肽的抗原决定位点可使用分析氨基酸序列的蛋白疏水性和亲水性的方法(Kyte-Doolittle(1982)J.Mol.Biol.157105-22)，或二级结构分析方法(Chou-Fasman(1978)Ann.Rev.Biochem.47251-76)预测，并可使用计算机程序证实(Anal.Biochem.151540-6(1985)，或PEPSCAN方法，其中短肽合成后证实其抗原性(特表Sho 60-500684)。
本发明多肽或多肽片段可使用已知的遗传重组技术或化学合成制备。当使用遗传重组技术制备本发明的多肽或多肽片段时，根据选择的宿主类型，产生的多肽可能经过或未经过糖基化作用，并可能分子重量、等电点等不同。通常，当多肽使用原核生物细胞例如E.coli作为宿主表达时，得到的多肽以具有与原始多肽的N端附着的蛋氨酸残基的形式制备。由于宿主细胞的这种差别形成的具有不同结构的多肽也包含于本发明的多肽中。
<多肽制备>
体外制备多肽时，可在体外无细胞系统中用例如体外翻译方法制备多肽(Dasso and Jackson(1989)Nucleic Acids Res.173129-44)。相反，当使用细胞制备多肽时，首先从上述宿主中选择适当的细胞宿主，然后用目的DNA转化细胞。随后，可培养转化的细胞以获得目的多肽。使用已知适于所选细胞宿主的方法进行培养。例如，当选择动物细胞时，使用例如DMEM(Virology 8396(1959))、MEM(Science 122501(1952))、RPMI1640(J.Am.Med.Assoc.199519(1967))、199(Proc.Soc.Biol.Med.731(1950))或IMDM培养基，在pH约6-8和温度为30℃-40℃培养约15-200小时，并在需要时加入血清，例如胎牛血清(FCS)。另外，若需要，在培养过程中更换、充气或搅拌培养基。
另一方面，为了建立体内多肽制备系统，将目的DNA导入动物或植物，使多肽在体内制备。已知动物系统的例子(Lubon(1998)Biotechnol.Annu.Rev.41-54)包括哺乳动物例如山羊、猪、绵羊、小鼠和母牛，昆虫例如蚕(Susumu(1985)Nature 315592-4)。此外，在哺乳动物系统中也可使用转基因动物。
例如，当在山羊奶中分泌目的多肽时，可以将编码多肽的DNA与编码蛋白(例如β-酪蛋白)的DNA连接，使目的多肽的融合蛋白在羊奶中特异性表达。接着，将编码融合蛋白的DNA导入山羊胚胎。然后将携带所述DNA的胚胎送回雌山羊的子宫。由该雌山羊产生的转基因山羊或它们的子代在其羊奶中分泌目的多肽。需要时也可给予激素以提高羊奶的产量(Ebert et al.(1994)Bio/Technology 12699-702)。
使用例如烟草等植物的转基因植物多肽制备系统是已知的。首先，将编码目标多肽的DNA掺入植物表达载体例如pMON530，然后将所述载体导入细菌中，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后用携带所述DNA的细菌感染植物，例如烟草(Nicotina tabacum)，使植物体再生，目的多肽可从获得的转基因植物的叶中分离(Julian等(1994)Eur.J.Immunol.24131-8)。其它成熟方法的例子包括，使用PEG将DNA导入原生质体，随后使植物体再生的方法(Gene Transfer to Plants，Potrykus和Spangenberg编(1995)66-74适合于印度水稻(Indian rice)变种)，使用电脉冲将DNA导入原生质体，随后使植物体再生的方法(Toki等.(1992)Plant Physiol.1001503-7；适合于日本水稻(Japanese rice)变种)，用基因枪法将DNA直接导入植物细胞，随后使植物体再生的方法(Christou等.(1991)Bio/Technology 9957-62)，和通过土壤杆菌将DNA导入细胞，随后使植物体再生的方法(Hiei等(1994)Plant J.6271-82)。植物再生方法参见Toki等(1995)Plant Physiol.1001503-7。
一旦获得转基因植物，产生本发明多肽的植物宿主可使用植物的种子、果实、块茎、根、根茎、插条、愈伤组织或原生质体以相同的方式繁殖。
通常，如果多肽在细胞外分泌，通过基因重组技术制备的本发明多肽可从培养基中回收，或从转基因生物的体液中回收。当多肽在细胞内制备时，将细胞溶解并从溶解产物中回收多肽。然后通过适当结合已知的蛋白质纯化方法来纯化目的多肽，所述方法例如盐析、蒸馏、层析、凝胶电泳、凝胶过滤、超滤、重结晶、酸提取、渗析、免疫沉淀、溶剂沉淀、溶剂提取和硫酸铵或乙醇沉淀。层析的例子包括离子交换层析，例如阴离子或阳离子交换层析、亲和层析、反相层析、吸收层析、凝胶过滤层析、疏水层析、羟基磷灰石层析、磷酸纤维素层析、和凝集素层析(Strategies for ProteinPurification and CharacterizationA Laboratory Course Manual，Marshak等编，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。层析可使用液相层析例如HPLC或FPLC进行。
另外，还可纯化和获得天然产生的多肽。例如，使用下文中描述的本发明多肽的抗体通过亲和层析纯化多肽(Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons(1987)16.1-16.19节)。另外，GST-融合蛋白可使用谷胱甘肽柱进行纯化，或组氨酸融合蛋白可使用镍柱纯化。当以融合蛋白的形式产生本发明多肽时，可以在纯化后根据需要，用凝血酶或因子Xa切掉不需要的部分。此外，需要时，还可使用例如胰凝乳蛋白酶、葡糖苷酶、胰蛋白酶、蛋白激酶、和赖氨酰内肽酶。
除上述合成和基因工程技术外，本发明多肽片段还可使用适当的酶例如肽酶通过酶切本发明多肽来制备。
<抗体>
本发明还提供本发明多肽或多肽片段的抗体。本发明抗体也包含多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFV)(Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83；The Pharmacology of Monoclonal Antibody，113卷，Rosenburg和Moore编，Springer Verlag(1994)269-315)，人源化抗体、多特异性抗体(LeDoussal等(1992)Int.J.Cancer Suppl.758-62；Paulus(1985)Behring Inst.Mitt.78118-32；Millstein和Cuello(1983)Nature 305537-9；Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)，和抗体片段例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc、和Fv。此外，需要时，本发明抗体还可被PEG等修饰。本发明抗体还可以是与β-半乳糖苷酶、麦芽糖-结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)等融合的蛋白，从而能在不使用第二抗体的情况下进行检测。此外，抗体可以用生物素等标记，以便能使用抗生物素蛋白、链抗生物素蛋白进行回收。
本发明抗体可使用本发明多肽，其片段，或细胞制备，作为致敏抗原，所述细胞是表达本发明多肽或多肽片段的细胞。另外，本发明短肽或其片段也可通过与例如牛血清清蛋白、匙孔血蓝蛋白(keyhole-limpet hemocyanin)和卵清蛋白等载体偶联用做免疫原。此外，本发明多肽或其片段可与已知佐剂例如铝佐剂、弗氏完全(或不完全)佐剂或百日咳杆菌佐剂等组合使用，以增强对抗原的免疫反应。
将本发明多肽或其片段与所需佐剂偶联，用其免疫哺乳动物，可以从该免疫动物的血清中获得多克隆抗体。对所用的哺乳动物没有具体限制，典型的例子包括啮齿动物、兔类动物(lagomorph)和灵长类动物。具体的例子包括啮齿动物如小鼠、大鼠和仓鼠，兔类动物例如兔，以及灵长类动物例如猴，包括食蟹猴、猕猴、狒狒和黑猩猩。动物免疫如下进行将致敏抗原在磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水中适当稀释并悬浮，根据需要与佐剂混合直至乳化，对动物进行腹腔注射或皮下注射。与弗氏不完全佐剂混合的致敏抗原优选每4-21天给予几次。可用常规方法测定血清中目标抗体的水平来证实抗体的生成。最后，血清本身可用做多克隆抗体，或它可进一步纯化。具体方法参见，例如“现代分子生物学方法”(Current Protocols inMolecular Biology)(John Wiley和Sons(1987)11.12-11.13节)。
可以从按照上述方式免疫的动物体内取脾，从脾中分离免疫细胞，用聚乙二醇等使这些免疫细胞与适当的骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤，从而产生单克隆抗体。细胞融合可依据Milstein方法进行(Galfre and Milstein(1981)Methods Enzymol.733-46)。本文中，适当的骨髓瘤细胞可以是允许对融合细胞进行化学选择的细胞。当使用这种骨髓瘤细胞时，融合的杂交瘤可以通过在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(HAT培养基)中培养来选择，这种培养基可以破坏除融合细胞以外的其它细胞。接着，从已建立的杂交瘤中选出产生抗本发明多肽或其片段的抗体的克隆。随后，将选出的克隆导入小鼠等的腹腔，收集腹水以获得单克隆抗体。具体方法还可参见“现代分子生物学方法”(John Wiley和Sons(1987)11.4-11.11节)。
杂交瘤也可以如下获得将已被EB病毒感染的人淋巴细胞在体外用免疫原致敏，使致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞(例如U266)融合，获得产生人抗体的杂交瘤(特开昭63-17688号公报)。还可以用人抗体基因所有组成部分免疫转基因动物，产生抗体生成细胞，来获得人抗体(WO92/03918；WO93-02227；WO94/02602；WO94/25585；WO96/33735；WO96/34096；Mendez等(1997)Nat.Genet.15146-156，等)。不使用杂交瘤的方法例如是，将癌基因导入产抗体的淋巴细胞等无限增殖化免疫细胞中。
还可通过基因重组技术制备抗体(参见Borrebaeck和Larrick(1990)Therapeutic Monoclonal Antibodies，MacMillan Publishers Ltd.，UK)。从杂交瘤或抗体生成细胞(例如致敏淋巴细胞)克隆出编码抗体的基因。将获得的基因插入适当载体，将载体导入宿主，然后培养宿主以产生抗体。这种重组载体也包括在本发明的抗体中。重组抗体的典型例子包括，含有非人抗体可变区和人抗体恒定区的嵌合抗体，以及含有非人抗体互补决定区(CDR)、人抗体构架区(FR)和人抗体恒定区的人源化抗体(Jones等(1986)Nature 321522-5；Reichmann等(1988)Nature 332323-9；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-6；；Methods Enzymol.20399-121(1991))。
本发明抗体片段可以用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶处理前述的多克隆或单克隆抗体来制备。或者，抗体片段可用编码抗体片段的基因通过遗传工程技术制备(参见Co等，(199)J.Immunol.1522968-76；Better和Horwitz(1989)Methods Enzymol.178476-96；Pluckthun and Skerra(1989)Methods Enzymol.178497-515；Lamoyi(1986)Methods Enzymol.121652-63；Rousseaux等(1986)121663-9；Bird and Walker(1991)TrendsBiotechnol.9132-7)。
本发明的多特异性抗体包括双特异性抗体(BsAb)、二体抗体(diabodies，Db)等。多特异性抗体k可以如下制备，例如(1)将具有不同特异性的抗体用不同类型的双功能接头化学偶联(Paulus1985))Behring Inst.Mill.78118-32)，(2)使分泌不同单克隆抗体的杂交瘤融合(Millstein和Cuello(1983)Nature 305537-9)，或(3)用不同多克隆抗体的轻链基因和重链基因(4种类型的DNA)转染真核生物细胞表达系统，例如小鼠骨髓瘤细胞，随后分离双特异性单价部分(Zimmermann(1986)Rev.Physio.Biochem.Pharmacol.105176-260；Van Dijk等(1989)Int.J.Cancer 43944-9)。另一方面，二体抗体是含有可通过基因融合构建的两个二价多肽链的二聚体抗体片段。这些可使用已知的方法制备。(参见Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-8；EP404097；WO93/11161)。
回收和纯化抗体和抗体片段可以使用A蛋白和G蛋白进行，或根据“Production of Polypeptide”(AntibodiesA Laboratory Manual，Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))中详细描述的蛋白纯化技术进行。例如，当使用A蛋白纯化本发明抗体时，可使用已知的A蛋白柱例如Hyper D、POROS或Sepharose F.F.(Pharmacia)。所得抗体的浓度可通过测定吸光度或通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定。
抗体的抗原结合活性可通过吸光度测定、或使用荧光抗体法、酶免疫分析(EIA)法、放射免疫分析(RIA)法或ELISA确定。当使用ELISA时，先将本发明抗体固定在支持物例如平板上。加入本发明多肽，然后加入含有目标抗体的样品。本文中，含有目标抗体的样品包括，例如抗体-生成细胞的培养上清、纯化的抗体等。其次，加入识别本发明抗体的第二抗体，然后保温平板。随后，洗涤平板并检测结合在第二抗体上的标记。即，如果第二抗体用碱性磷酸酶标记，抗原结合活性可通过加入酶底物例如对硝基苯磷酸并测定吸光度来确定。另外，也可使用商业购得的系统例如BIAcore(Pharmacia)评估抗体活性。
本发明抗体可用于纯化本发明的多肽或其片段。另外，也可用本发明抗体获得适用于帕金森氏病等疾病的细胞移植治疗的产多巴胺型神经元前体细胞。
<选择产多巴胺型神经元>
本发明提供选择性获得刚刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞均一群体的方法。更具体地，表达本发明多肽的细胞，也就是说，刚刚停止分裂后的产多巴胺型神经元前体细胞，可通过将本发明65B13多肽的抗体与含有潜在的产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触，然后选择与所述抗体结合的细胞而获得(见图12-14)。抗体在与细胞接触前也可固定在适当的支持物上。换句话说，通过细胞与抗体接触并使之结合，并通过亲和层析纯化所述抗体，可选择性地回收与所述抗体结合的细胞。例如，如果本发明抗体与生物素偶联，它可在结合有抗生物素蛋白或链抗生物素蛋白的平板或柱上纯化。
另外，65B13含有具Ig结构域的粘附分子样结构(见图6)，当其在培养细胞中表达时，表达65B13的细胞互相粘附，但不与不表达65B13的细胞粘附。因此，认为65B13介导的粘附涉及同嗜性粘附。基于65B13多肽的这种特性，也可通过利用65B13多肽，特别是其胞外部分选择产多巴胺型神经元前体细胞。例如，可通过在适当的支持物上固定65B13多肽的胞外部分，然后将支持物与细胞接触，获得产多巴胺型神经元前体细胞。因此，本发明提供选择产多巴胺型神经元前体细胞的方法，所述方法包括将含有本发明多肽的至少胞外部分的肽与含有产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触的步骤。
本发明中，刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞可使用抗-65B13抗体通过流式细胞仪有效分离(实施例4，图14)。
另外，产多巴胺型神经元前体细胞也可使用65B13的启动子来选择(见，例如，特开2002-51775号公报)。例如，可以将含有编码检测标记物的基因(例如GFP)与通过后文所述的分析65B13表达调节区而获得的启动子区连接成构建体，将含有该构建体的载体导入细胞。还可以将编码标记物的基因敲入65B13基因座。两种情况下，都可以通过检测产多巴胺型神经元前体细胞的特异性标记基因的表达来选择特异性细胞。
本发明使用的细胞样品优选包括中脑腹侧区细胞或含体外分化的产多巴胺型神经元的细胞培养物的细胞。产多巴胺型神经元体外分化可通过已知方法使用例如已知的ES细胞、骨髓间质细胞、无限增殖化神经元衍生细胞系(特表平8-509215号公报，特表平11-506930号公报；特表2002-522070号公报)或原始神经元细胞(特表平11-509729号公报)等细胞作为起始物质进行。通常，可通过将从脑的产多巴胺型神经元区获得的组织与衍生自神经组织的支持细胞层共培养，来分化产多巴胺型神经元。此外，从通常不产生多巴胺的神经组织例如纹状体和脑皮质衍生的产多巴胺型细胞的方法也是已知的(特表平10-509319号公报)。另外，已报道在含氧量低的条件下培养，以制备含有更多产多巴胺型神经元的细胞(特表2002-530068号公报)。用于选择本发明产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品可以是通过任何方法分离或培养的细胞群。
另外，用于固定本发明抗体或多肽的支持物对细胞必需是安全的。这种载体的例子包括合成的或天然产生的有机高分子化合物，玻璃珠、硅胶、矾土(alumina)和活性炭等无机材料，以及表面由多糖或合成高分子包被的那些材料。对载体的形式没有特别限制，其例子包括薄膜、纤维、颗粒、中空纤维、非编织织物、多孔支持物、或蜂窝状支持物，并且可通过以各种方式改变接触表面的厚度、表面积、宽度、长度、形状和大小，来控制接触表面的面积。
<产多巴胺型神经元前体细胞>
由于以这种方式获得的细胞是刚停止分裂的神经元前体细胞，它们在其安全性、存活率和网络形成能力方面与常规的混合细胞群或携带外源基因的产多巴胺型神经元相比，在神经退化疾病例如帕金森氏病的移植疗法中是优选的。此外，由于根据本发明方法获得的本发明细胞(或细胞群)是刚停止分裂的前体细胞，它们也可通过选择体外条件(例如培养基)而分化至适当的阶段，并且是各种神经移植疗法的优选材料。当使用本发明方法获得的神经元前体细胞用于移植时，优选移植1×103-1×106个细胞，更优选5×104-6×104个细胞。基本方法是定位脑固定术(stereotaxic surgery)，其中将细胞悬液移植到脑中。另外，细胞也可通过显微外科手术移植。有关移植神经元组织的方法参见Backlund等(Backlund等(1985)J.Neurosurg.62169-73)，Lindvall等(Lindvall等(1987)Ann.Neurol.22457-68)或Madrazo等(Madrazo等(1987)New Engl.J.Med.316831-4)。
此外，本发明细胞还可用于分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因，以及从前体细胞成熟为产多巴胺型神经元期间各个阶段的特异性基因。它们还可用于寻找帕金森氏病的治疗目标，阐明产多巴胺型神经元的成熟过程，以及用成熟作为指标进行筛选。
<比较基因表达水平>
使用本发明抗体获得的刚分裂的产多巴胺型神经元前体细胞可用做分离在这些细胞中特异性表达的基因的材料。它们也可用于研究和分离在已从本发明的产多巴胺型神经元前体细胞分化、诱导、或增殖的细胞中特异性表达的基因。另外，也可将它们用于研究产多巴胺型神经元体内分化所需的基因，方法是研究在从原始前体细胞分化、诱导或增殖的细胞中具有不同表达水平的基因。由于这种基因是治疗由产多巴胺型神经元缺陷引起的疾病的潜在候选者，它们的测定和分离极为有用。
将本发明产多巴胺型神经元前体细胞中基因表达水平与已从其分化、诱导或增殖的细胞或其他细胞的基因表达水平进行比较；或将分化、诱导或增殖的细胞的基因表达水平与其他细胞的进行比较，可通过通常使用的方法进行，例如细胞原位杂交、Northern印迹杂交、RNA斑点杂交、反转录PCR、RNA酶保护试验、DNA微阵列杂交、基因表达系列分析(SAGE)(Velculescu等(1995)Science 270484-487)，扣除杂交和表现度示差分析(RDA)(Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-307)。
在细胞原位杂交时，从细胞制备总RNA或polyA+RNA，使之与指定RNA序列的特异性标记探针杂交，可研究个体细胞中发生RNA加工、转运和细胞质定位的位置。另外，RNA大小可使用凝胶电泳通过大小分级分离进行测定。此外，RNA转录产物可使用适用于本发明的定量荧光原位杂交(FISH)和数字成象显微镜进行原位观察(Femino等(1998)Science 280585-90)。
当用反转录PCR分析基因表达时，可粗略定量特异性基因的表达。单链RNA转录产物的各种同工型也可使用本发明方法检测和分析。对于反转录PCR，当使用外显子特异性引物进行反应，并检测除预测产物外的扩增产物时，通过备选剪接制备的mRNA同工型可通过分析这些产物予以鉴定。详细内容参见，例如，Pykett等(1994)Hum.Mol.Genet.3559-64中描述的方法。当需要快速、粗略地分析表达方式时，使用本发明PCR进行的本发明方法就其高速、高敏感性和简易性来说，特别优选。
基因表达筛选的效率可通过使用DNA芯片来改善。本文中，DNA芯片是指微阵列，其中寡核苷酸、DNA克隆等以高密度固定在支持物表面例如玻璃上。例如，为了进行多重表达筛选，可以将每种目标基因的cDNA克隆或特异于每一基因的寡核苷酸固定在芯片上以制备微阵列。接着，从本发明多巴胺-特异性神经元前体细胞，或从其分化、诱导或增殖得到的细胞来制备RNA，经反转录酶处理产生cDNA。然后，将所得cDNA样品用荧光标记物或其它标记物标记，随后与微阵列杂交。结果，在细胞中活跃表达的基因具有较高的总标记cDNA百分率，而未被显著表达的基因具有较低的百分率。也就是说，代表标记cDNA与芯片上cDNA克隆或寡核苷酸之间杂交的荧光信号强度，反映了标记cDNA中每一序列的表达水平，并因此使基因表达能够量化。
另外，本发明的产多巴胺型神经元前体细胞或从其分化、诱导或增殖而得到的细胞中的多个基因可通过mRNA差别展示同时进行分析，这包括使用简并PCR引物进行反转录PCR。
首先，制备修饰的oligo dT引物，其改变了指定mRNA的poly A尾3’端的一个或两个核苷酸。然后，从本发明前体细胞、从其分化或增殖的细胞、或用于比较表达的对照细胞分离总RNA，用其进行反转录反应(Liang等(1993)Nucleic Acids Res.213269-3275)。如果改变的核苷酸是“G”，那么可选择性扩增在其poly A尾之前紧接“C”的那些mRNA。如果改变的核苷酸是“CA”，那么可选择性扩增在其poly A尾之前紧接“TG”的那些mRNA。接着，制备长约10个核苷酸的任意核苷酸序列作为二次引物，使用上述修饰的oligo dT引物和该二次引物进行PCR扩增反应。扩增产物用泳动距离长的聚丙烯酰胺凝胶通过电泳进行大小分级分离。由在本发明细胞或对照细胞中特异性表达的mRNA所衍生的cDNA，可以用这种方法测出，表现为仅出现在电泳后的该样品中的带。该方法还可用于分析未知基因的表达。
SAGE分析不需要特殊检测装置，是可以同时检测大量转录产物的表达的优选分析方法之一。首先，使用标准方法从本发明产多巴胺型神经元前体细胞或从其分化、诱导或增殖而得到的细胞中提取poly A+RNA。接着，使用生物素化oligo(dT)引物将RNA转变为cDNA，然后用识别4-碱基的限制性内切酶(锚着酶(Anchoring Enzyme)AE)处理。本文中，经AE-处理的片段在其3’端包含生物素基团。随后，将经AE-处理的片段与链抗生物素蛋白保温以便发生结合。将结合的cDNA分成两部分，使各部分与不同的双链寡核苷酸衔接子(接头)A或B连接。这些接头组成如下(1)突出的单链部分，它具有与经锚着酶作用形成的突出部分序列互补的序列，(2)IIS-型限制性内切酶(作为标记酶(TE)，在距离识别位点不超过20bp的预定位置酶切)的5’核苷酸识别序列，和(3)用于构建PCR-特异性引物的足够长的附加序列。本文中，与接头连接的cDNA用标记酶酶切，仅保留与接头连接的cNDA序列部分，为短链序列标记形式。接着，使来自两种不同接头的短链序列标记混合物彼此连接，随后用特异于接头A和B的引物进行PCR扩增。结果，获得的扩增产物是含有与接头A和B连接的两种毗邻序列标记(双标记(di标记s))的多样化(myriad)序列的混合物。扩增产物用锚着酶处理，游离双标记部分在标准连锁反应中与链连接。然后对扩增产物经克隆。测定克隆的核苷酸序列，以此获得恒定长度的连续双标记的读数。一旦测定克隆的核苷酸序列，结合如此获得的序列标记的信息，就可鉴别对应于每一标记的mRNA的存在。
扣除杂交常常用于克隆那些在多种组织或细胞中具有不同表达水平的基因，还可用于克隆在本发明产多巴胺型神经元前体细胞或从其分化、诱导或增殖而得到的细胞中特异性表达的基因。首先，从上述本发明细胞制备试验用细胞DNA样品(下文中称试验DNA)。其次，制备比较用细胞DNA(下文中称做供试探针DNA)。试验DNA和供试探针DNA还可交换使用。在任一种情况中，检测存在于试验DNA但不存在于供试探针DNA中的基因。然后，将制备的试验DNA与过量的供试探针DNA混合，变性，形成单链DNA，随后退火。通过调节退火条件，可将不存在于供试探针DNA中的特异性序列作为仅含有试验DNA序列的双链DNA形式而分离。关于本方法进一步详细的资料参见Swaroop等(1991)Nucleic Acids Res.191954和Yasunaga等(1999)Nature Genet.21363-9。
RDA方法是使用PCR选择性扩增不存在于供试探针DNA中的试验DNA序列的方法，像其他上述方法一样，该方法可用于本发明。详见Lisitsyn(1995)Trends Genet.11303-7和Schutte等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA925950-4。
特异于产多巴胺型神经元前体细胞或从其分化、诱导或增殖而得到的细胞的基因如上所述进行检测和分离，并可插入载体等，以便使用上述各种已知方法进行序列测定和表达分析。
<用前体细胞成熟作为指标进行筛选>
本发明提供筛选方法，该方法包括将试验物质与本发明的产多巴胺型神经元前体细胞接触，并检测由所述接触引起的前体细胞的分化和增殖。由于通过这种筛选方法获得的化合物显示了在产多巴胺型神经元的分化、增殖等方面的调节功能，它们被认为可以作为由产多巴胺型神经元缺陷引起的疾病的潜在治疗候选者。
本文中，“试验物质”可以是任何类型的化合物，其例子包括基因文库的表达产物、合成低分子化合物文库、合成肽文库、抗体、由细菌释放的物质、细胞(微生物、植物细胞或动物细胞)提取物、细胞(微生物、植物细胞或动物细胞)培养上清、纯化或部分纯化的多肽、海洋生物、植物或动物提取物、土壤、随机噬菌体肽显示文库等。
细胞分化和增殖可通过与不存在试验物质时的细胞状态对比来进行检测。细胞分化和增殖可通过在显微镜下观察形态或通过检测和定量细胞中产生的物质例如多巴胺来进行检测。
<分析65B13表达调节区>
本发明提供65B13表达调节区。本发明的表达调节区可使用本发明多核苷酸通过已知方法从基因组DNA克隆。例如，确立转录起始位点的方法(如SI作图法)是已知的并可用于本发明(细胞工学，增刊8，新细胞工学实验方案，东京大学医科学研究所制癌研究部编，秀润社(1993)362-374)。通常，基因的表达调节区可以用探针DNA筛选基因组DNA文库来克隆，所述探针DNA含有基因5’端的15-100bp片段，优选30-50bp片段(本发明中，SEQ ID NO1之1-176核苷酸或SEQ ID NO2之1-126核苷酸的全部或部分)。以这种方式获得的克隆包含5’非编码区的10kbp或更多，可以经核酸外切酶处理而截短或切断。最后，含有潜在的表达调节区的截短型序列部分可以用报道基因评估其表达、长度、调节等，从而使得可以测定保持本发明65B13表达调节区活性所需的最小单元。
可以用Neural Network(http//www.fruitfly.org./seq tools/promoter.html；Reese et al.，BiocomputingProceedings of the 1996 Pacific Symposium，Hunterand Klein ed.，World Scientific Publishing Co.，Singapore，(1996))等程序预测基因表达调节区。此外，预测表达调节区活性所需的最小单元的程序也是已知的，(http//biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan.htm；Prestridge(1995)J.Mol.Biol.249923-932)，并可用于本发明。
以这种方式分离的65B13基因的表达调节区，可用于体内产生特异于分裂停止后的产多巴胺型神经元前体细胞的目的蛋白。
<配体鉴别>
本发明提供本发明多肽的配体。本发明多肽具有跨膜结构域，因此被认为在天然状态中它们包埋在细胞膜内。据信这些多肽参与神经元成熟，因为它们在刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞中瞬时表达。因此，那些对本发明多肽显示激动功能或拮抗功能的潜在配体，可用于体内、回体和体外调节产多巴胺型神经元的分化。在鉴别本发明多肽的配体时，可以先使本发明多肽与候选化合物接触，检测结合的存在。在这种情况下，可使用固定在支持物上或包埋于细胞膜中的本发明多肽。对于候选化合物没有具体限制，其例子包括基因文库的表达产物、衍生自海洋生物的天然物质、各种细胞的提取物、已知化合物和肽、衍生自植物的天然物质、机体组织提取物、微生物培养上清和通过噬菌体展示方法随机制备的肽群(J.Mol.Biol.222301-10(1991))。此外，可使候选化合物带上标记，以便检测结合。


图1显示65B13-a的cDNA序列和氨基酸序列。在信号序列和跨膜结构域下划线。
图2显示65B13-a的cDNA序列和氨基酸序列。在信号序列和跨膜结构域下划线。该图是图1的连续。
图3显示65B13-b的cDNA序列和氨基酸序列。在信号序列和跨膜结构域下划线。
图4显示65B13-b的cDNA序列和氨基酸序列。在信号序列和跨膜结构域下划线。该图是图3的连续。
图5是65B13-a和65B13-b的氨基酸序列的对比。
图6是65B13结构的示意图。阴影部分表示跨膜结构域，而Ig代表Ig结构域。
图7是显示在E12.5小鼠脑中通过原位杂交分析65B13mRNA表达结果的一组照片。A矢状截面，B旁矢状截面，HB后脑，MB中脑，SC脊髓，CB小脑原基。
图8是显示在E12.5小鼠脊髓中通过原位杂交分析65B13mRNA表达结果的一组照片。A65B13，BNCAM，C65B13、Ki67和NCAM表达区的对比(显示为A和B中框架区的放大照片)。
图9是显示在E12.5小鼠的中脑腹侧区中通过原位杂交分析65B13mRNA表达和分析酪氨酸羟化酶(TH)mRNA表达结果的一组照片。A65B13，BTH。
图10是显示中脑中65B13表达模式的示意图。
图11是显示整个时间内65B13表达模式的示意图。
图12是说明使用抗-65B13抗体分离和利用产多巴胺型神经元前体细胞的方法的示意图。
图13是显示使用抗每种蛋白的抗体通过免疫荧光染色方法分析65B13(Cy3)、Nurrl(FITC)和TH(Cy5)蛋白表达结果的照片。
图14是一组照片，显示在(A)E12.5小鼠胚胎的中脑腹侧区和(B)包含从ES细胞体外分化的产多巴胺型神经元前体细胞的细胞群中，用65B13单克隆抗体检测65B13-表达细胞的流式细胞术分析结果。
进行本发明的最佳方式本发明将参考实施例进行更详细的说明，但并不意味着限制本发明的范围。
产多巴胺型神经元前体细胞特异性基因的分离和序列分析为了分离产多巴胺型神经元前体细胞的特异性基因，使用来自E12.5小鼠中脑腹侧和背侧的RNA通过扣除法(N-RDA)扩增在其表达中有差别的基因，并分析得到的基因序列。
1.N-RDA方法1-1接头制备下列寡核苷酸彼此退火，并制备100μM。
(ad2ad2S+ad2A，ad3ad3S+ad3A，ad4ad4S+ad4A，ad5ad5S+ad5A，ad13ad13S+ad13A)ad2Scagctccacaacctacatcattccgt(SEQ ID NO11)ad2Aacggaatgatgt(SEQ ID NO12)
ad3Sgtccatcttctctctgagactctggt(S EQ ID NO13)ad3Aaccagagtctca(SEQ ID NO14)ad4Sctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt(SEQ ID NO15)ad4Aacacactcacag(SEQ ID NO16)ad5Sccagcatcgagaatcagtgtgacagt(SEQ ID NO17)ad5Aactgtcacactg(SEQ ID NO18)ad13Sgtcgatgaacttcgactgtcgatcgt(SEQ ID NO19)ad13Aacgatcgacggt(SEQ ID NO20)。
1-2.cDNA合成使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从E 12.5小鼠胚胎(Japan SLC)的腹侧和背侧中脑区制备总RNA，并用cDNA合成试剂盒(Takara)合成双链cDNA。用限制性内切酶RsaI消化后加入ad2。用ad2S作为引物，通过在72℃保温5分钟，然后在94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分钟进行15轮PCR，最后在72℃保温2分钟扩增cDNA。在所有情况下，N-RDA PCR使用含有如下成分的反应溶液进行。
10xExTaq 5μl2.5mM dNTP 4μlExTaq 0.25μl100μM 引物0.5μlcDNA 2μl蒸馏水38.25μl1-3供试探针(driver)制备经ad2S扩增的cDNA通过在94℃保温2分钟，然后进行5个PCR循环94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分钟，最后在72℃保温2分钟来进一步扩增。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA，并用RsaI消化。3μg用于各次扣除循环。
经ad2S扩增的cDNA通过在94℃保温2分钟，然后进行5个PCR循环94℃30秒、65℃30秒、和72℃2分钟，最后在72℃保温2分钟来进一步扩增。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化cDNA，并用RsaI消化。将ad3加入60ng的经RsaI-消化的cDNA中。
1-5第一轮扣除杂交混合上述1-3和1-4节中制备的试验对象和供试探针，乙醇沉淀，然后溶解于1μl的1xPCR缓冲液中。98℃5分钟后，加入1μl 1xPCR缓冲液+1MNaCl。再经98℃5分钟后，试验对象和供试探针在68℃杂交16小时。
用ad3S作为引物，通过在72℃保温5分钟，并进行10个PCR循环94℃30秒、65℃30秒和72℃2分钟来使杂交的cDNA扩增。接着，扩增的cDNA用绿豆核酸酶(Takara)消化并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。然后，通过在94℃保温2分钟，并进行13个PCR循环94℃30秒、65℃30秒、72℃2分钟，最后在72℃保温2分钟，来进行扩增。
1-6.均一化将1μl 2xPCR缓冲液加入8ng第一轮扣除杂交中扩增的cDNA。98℃保温5分钟后，加入2μl 1xPCR缓冲液+1M NaCl。98℃再保温5分钟后，所述cDNA在68℃杂交16小时。
杂交的cDNA用RsaI消化，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化。然后，用ad3S作引物，通过在94℃保温2分钟，并进行11个PCR循环94℃30秒、65℃30秒和72℃2分钟，最后在72℃保温2分钟来进行扩增。然后，PCR产物用RsaI消化，随后加入ad4。
1-7.第二轮扣除杂交将已在上述1-6节中加入了ad4的cDNA取20ng用做试验对象，与上述1-3节的供试探针混合，进行上述1-5节中使用的同样的减法步骤。最后，该cDNA经RsaI消化后加入ad5。
1-8.第三轮扣除杂交将已在上述1-7节中加入了ad5的cDNA取2ng用做试验对象，与上述1-3节的供试探针混合，进行上述1-5节中使用的同样的减法步骤。最后，cDNA经RsaI消化后加入ad13。
1-9.第四轮扣除杂交将已在上述1-8节中加入了ad13的cDNA取2ng用做试验对象，与上述1-3节的供试探针混合，进行上述1-5节中使用的同样的减法步骤。将扩增的cDNA克隆进入pCRII载体(Invitrogen)，并使用ABI3100序列分析仪分析其核苷酸序列。
接着，使用通过N-RDA法获得的65B13片段序列，根据下文描述的方法进行RACE。
2.RACE方法使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从E12.5小鼠胚脑制备总RNA，以便使用μM ACS mRNA分离试剂盒(Miltenyi Biotec)制备mRNA。然后使用Superscript Choice System(Invitrogen)和pCRII载体(Invitrogen)从上述制备的mRNA再制备cDNA丈库。然后从所述cDNA文库制备质粒DNA。使用下列引物进行PCRTAU2GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTC(SEQ ID NO21)TAU4CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC(SEQ ID NO22)TAD3AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG(SEQ ID NO23)TAD4CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG(SEQ ID NO24)65B13F1CTTCCCGTATGCTACCTTGTCTCCAC(SEQ ID NO25)65B13F2TCCATCTCTCCAAGTGAAGGGTCTTG(SEQ ID NO26)65B13R1CCAACAGTCCTGCATGCTTGTAATGA(SEQ ID NO27)65B13R2TCCTTCAATGTTCAGTTTTGGAGGGG(SEQ ID NO28)PCR条件描述如下第一轮PCR10xExTaq 2μl2.5mM dNTP 1.6μlExTaq 0.1μl
100μM TAU2或TAD30.04μl100μM 65B 13F1或R10.2μlcDNA(10ng/μl)1μl蒸馏水15.06μl94℃保温5分钟后，进行25个PCR循环94℃30秒，65℃30秒和72℃5分钟，最后在72℃保温2分钟。接着将第一轮PCR获得的产物100倍稀释后，进行第二轮PCR。第二轮PCR的条件显示如下。
第二轮PCR10xExTaq 5μl2.5mM dNTP 4μlExTaq 0.25μl100μM TAU4或TAD4 0.1μl100μM 65B13 F2或R20.5μl1/100第一轮PCR产物1μl蒸馏水15.06μl94℃保温5分钟后，进行25个PCR循环94℃30秒，65℃30秒和72℃5分钟，最后在72℃保温2分钟。将扩增的cDNA片段克隆进入pCRII载体，使用ABI3100序列分析仪分析其序列。
得到的65B13-a和65B13-b两个基因的核苷酸序列显示为SEQ ID NO1(图1和2)和SEQ ID NO2(图3和4)。65B13-a的编码区起始于SEQ IDNO1第177位的″A″，终止于核苷酸2278-2280的终止密码子，产生包含700个氨基酸的蛋白质。由核苷酸177-228的序列编码的17个氨基酸残基是信号序列。由核苷酸1717-1767的序列编码的17个氨基酸残基是跨膜结构域。相比之下，65B13-b的编码区起始于SEQ ID NO2第127位的″A″，终止于核苷酸2077-2079的终止密码子，产生包含650个氨基酸的蛋白质。由核苷酸127-177的序列编码的17个氨基酸残基是信号序列，由核苷酸1516-1566的序列编码的17个氨基酸残基是跨膜结构域。由65B13-a和65B 13-b基因编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO3和4。如图5所示，由这两个基因编码的氨基酸序列的对比表明，65B13-a和65B13-b是备选剪接导致的同工型，并且651B3-b的N端比65B13-a缺少50个氨基酸。基于同源性检索结果，认为由65B13基因编码的蛋白是具有如图6所示的5个Ig结构域的单链跨膜蛋白。
65B13基因的表达分析然后，根据如下方法通过原位杂交进行这些基因的表达分析。
首先，将E12.5小鼠胚胎包埋于O.C.T中，制备16μm厚的冷冻切片。在载玻片上干燥后，室温将切片于4％PFA中固定30分钟。用PBS洗涤后，65℃杂交40小时(1μg/ml DIG-1标记的RNA探针，50％甲酰胺，5xSSC，1％SDS，50μg/ml酵母RNA，50μg/ml肝素)。随后，切片在65℃洗涤(50％甲酰胺，5xSSC，1％SDS)。然后在室温用RNA酶(5μg/ml RNA酶)处理5分钟。65℃用0.2xSSC洗涤和室温用1xTBST洗涤后，进行封闭(封闭剂Roche)。然后切片与碱性磷酸酶标记的抗-DIG抗体(DAKO)反应，洗涤(1xTBST，2mM左旋咪唑(Levamisole))，并用NBT/BCIP(DAKO)作为底物进行显色。
通过原位杂交分析这些基因的表达，结果显示，在与产多巴胺型神经元发育对应的阶段，65B13在E12.5的中脑腹侧、小脑原基、后脑和脊髓中表达(图7)。65B13在脊髓中的表达进一步与生长标记Ki67和成熟标记NCAM的表达比较。在发生Ki67-阳性神经始祖细胞增殖的脑室区(VZ)，65B13在一些细胞中表达。相反，在存在分裂停止后成熟的NCAM-阳性前体细胞的外套层(ML)中没有观察到65B13的表达(图8)。相似地，在脊髓以外区域，可以在VZ内的一些细胞中观察到表达。依据这些表达方式，认为65B13在刚停止分裂的神经前体细胞中瞬时表达。
中脑中，仅在脑室区的大部分腹侧区观察到表达。由于作为产多巴胺型神经元标记基因的酪氨酸羟化酶(TH)仅在ML中表达，因此对TH表达和65B13表达的比较显示，二者不在相同细胞中表达，但是，它们沿背-腹轴方向的表达区完全一致(图9)。通常，已知神经管中的神经细胞在VZ中增殖，随着分化的开始停止细胞分裂，然后迁移到位于VZ外侧的ML中成熟。因此，认为产多巴胺型神经元始祖细胞在与TH表达区邻近的VZ中增殖，并在细胞分裂结束后转移到外侧表达TH。由于这些发生始祖细胞增殖的VZ区与65B13表达区一致，即认为细胞周期结束后65B13立即在中脑的产多巴胺型神经元前体细胞中特异地瞬时表达(图10和11)。
65B13蛋白的表达分析接着，用编码胞外区的部分65B13基因序列制备抗-65B13抗体，以便通过免疫组织化学染色分析表达。
首先，将编码胞外区的部分65B13基因序列导入293E细胞，表达并回收65B13蛋白的胞外区。用回收的蛋白免疫仓鼠后，提取淋巴细胞并与骨髓瘤细胞融合。然后将融合细胞移植到小鼠的腹腔，收集腹水，并纯化抗-65B13单克隆抗体。接着，E12.54、鼠胚胎4℃于4％PFA/PBS(-)中固定2小时，然后在20％蔗糖/PBS(-)中4℃静置过夜，随后用O.C.T包埋。制备12um厚的切片。将切片固定在载玻片上后，室温干燥30分钟，然后用PBS(-)重新润湿。随后，室温封闭(Block Ace)20分钟。具有组织切片的玻片用所得抗-65B13单克隆抗体(10ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)、抗-TH抗体(Chemicon，0.7ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)和抗-Nurrl抗体(Santa Cruz，4ug/ml，2.5％Block Ace/PBS)室温保温1小时，并4℃过夜。然后，具有组织切片的玻片用0.1％Triton X-100/PBS(-)室温洗涤4次，每次10分钟，并用Cy3-标记的抗-仓鼠IgG抗体、FITC-标记的抗-兔IgG抗体和Cy5-标记的抗-小鼠IgG抗体(Jackson，10ug/ml，2.5％Block Ace)室温保温1小时。玻片以相同方式洗涤，随后用PBS(-)室温再洗涤10分钟，然后包埋。
与通过原位杂交进行的表达分析相似，使用制备的抗-65B13单克隆抗体通过免疫组织化学染色进行的表达分析显示，65B13在与产多巴胺型神经元发育对应的E12.5中脑腹侧区表达(图13)。比较65B13蛋白的表达与产多巴胺型神经元标记TH和Nurrl蛋白的表达，表明65B13蛋白在发生TH和Nurrl蛋白表达的中脑最腹侧的VZ侧表达。因此，认为65B13蛋白在产多巴胺型神经元前体细胞中表达。
通过流式细胞术检测65B13-表达细胞下面，使用抗-65B13单克隆抗体通过流式细胞术检测表达65B13的细胞。
首先，将从12.5日龄小鼠胚胎切除的中脑腹侧区，或含有从ES细胞体外分化的产多巴胺型神经元前体细胞的细胞群分散于细胞分散缓冲液(Invitrogen)中。然后，样品未经预先的固定或渗透就用抗-65B13单克隆抗体(10ug/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)4℃染色20分钟。随后，样品用1％胎牛血清和1mM EDTA/PBS(-)4℃洗涤3分钟3次，用PE-标记的抗-仓鼠IgG抗体(Pharmingen，4ug/ml，1％胎牛血清，1mM EDTA/PBS)4℃染色20分钟，然后以相同方式洗涤。然后通过流式细胞术检测65B13-表达细胞。
使用产生的抗-65B13单克隆抗体通过流式细胞术检测表达65B13蛋白的细胞群(图14)。由于不经固定或渗透即可检测65B13-表达细胞，因此认为可将65B13-表达细胞通过使用配备了细胞分选仪的流式细胞仪以活细胞的形式分离。由于认为65B13蛋白在产多巴胺型神经元前体细胞中表达，有人相信65B13具有分离产多巴胺型神经元前体细胞的用途。
工业适用性根据本发明，可以获得细胞分裂结束后在产多巴胺型神经元前体细胞中立即特异且瞬时表达的新65B13基因。就其安全性、存活率和网络形成能力来说，65B13的细胞表达可用做指示物，来选择用于帕金森氏病等神经变性疾病的移植疗法的适当细胞。另外，由于刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞是选择地获得的，当用于需要成熟细胞的疗法时，它们可容易地体外分化为适当的状态。此外，使用本发明基因获得的产多巴胺型神经元前体细胞也可用于分离在这些细胞中特异性表达的基因。有人还认为所述细胞在开发帕金森氏病等神经变性疾病的药物中有用。刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞是涉及早期神经元形成的前体细胞，它们在阐明神经元成熟过程，也就是说，鉴别涉及成熟过程的各种因子中有用。预期阐明这些因子对治疗神经变性疾病具有很大作用。此外，这些细胞的成熟可用做筛选可调控(抑制或促进)成熟过程的物质的指标。
序列表<110>卫材株式会社(Eisai Co.，Ltd.)<120>在分裂停止后的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的基因<130>E1-A0203P<150>JP 2002-307573<151>2002-10-22<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2876<212>DNA<213>小鼠<400>1gatgagccag atttcgggga ctctgggcca gacataaaat cttccagccc ggagagaatt 60gtgtgcagag aggggctcca gtccagcgtg gtgtgagagg cgtgctatca agaaagaagt 120tggaggggaa ccagtgcaac cctaactcta cgagatcttg gggtacacac actcgggatg 180ctggcctccg ccctcctcgt tttcctttgc tgtttcaaag gacatgcagg ctcatcgccc 240catttcctac aacagccaga ggacatggtg gtgctgttgg gggaggaagc ccggctgccc 300tgcgctctgg gcgcgtacag ggggctcgtg cagtggacta aggatgggct ggctctaggg 360ggcgaaagag accttccagg gtggtcccgg tactggatat cggggaattc agccagtggc 420cagcatgacc tccacattaa gcctgtggaa ttggaagatg aggcatcgta tgagtgccag 480gcttcgcaag caggtctccg atcacgacca gcccaactgc acgtgatggt ccccccagaa 540gctccccagg tactaggcgg cccctctgtg tctctggttg ctggagttcc tggaaatctg 600acctgtcgga gtcgtgggga ttcccgacct gcccctgaac tactgtggtt ccgagatggg 660atccggctgg atgcgagcag cttccaccag accacgctga aggacaaggc cactggaaca 720gtggaaaaca ccttattcct gaccccttcc agtcatgatg atggcgccac cttgatctgc 780agagcgcgaa gccaggccct gcccacaggg agggacacag ctgttacact gagccttcag 840tatcccccaa tggtgactct gtctgctgag ccccagactg tgcaggaggg agagaaggtg 900actttcctgt gtcaagccac tgcccagcct cctgtcactg gctacaggtg ggcgaagggg 960ggatccccgg tgctcggggc acgtgggcca aggttggagg tcgttgcaga tgccactttc 1020ctgactgagc cggtgtcctg cgaggtcagc aacgcggtcg gaagcgccaa ccgcagcacg 1080gcgctggaag tgttgtatgg acccattctg caggcaaaac ctaagtccgt gtccgtggac 1140gtggggaaag atgcctcctt cagctgtgtc tggcgcggga acccacttcc acggataacc 1200tggacccgca tgggtggctc tcaggtgctg agctccgggc ccacgctgcg gcttccgtcc 1260gtggcactgg aggatgcggg cgactatgta tgcagggctg agccgaggag aacgggtctg 1320ggaggcggca aagcgcaggc gaggctgact gtgaacgcac cccctgtagt gacagccctg 1380
caacctgcac cagcctttct gaggggtcct gctcgcctcc agtgtgtggt gtttgcctcc 1440cctgccccag actcggtggt ttggtcttgg gacgagggct tcttggaggc aggctcactg 1500ggcaggttcc tagtggaagc cttcccagcc ccggaagtgg aggggggaca gggccctggc 1560cttatttctg tgctacacat ttccggaacc caggagtccg actttaccac cggcttcaac 1620tgcagtgccc gcaaccggct aggagaggga cgagtccaga tccacttggg ccgtagagat 1680ttgctgccta ctgtccggat tgtggctggt gcagcatctg cagccacctc tctccttatg 1740gtcatcactg gagtggtcct ctgctgctgg cgccatggct ctctctctaa gcaaaagaac 1800ttggtccgga tcccaggaag cagcgagggt tccagttcac gtggccctga ggaggagaca 1860ggcagcagtg aggaccgggg tcccattgtg cacaccgacc acagtgattt ggttcttgag 1920gaaaaagagg ctctggagac aaaggatcca accaacggtt actacaaggt tcgaggggtc 1980agtgtgagcc ttagccttgg ggaagctcct ggaggaggcc tcttcttgcc accgccctct 2040ccgatcggtc tcccagggac tcctacttac tatgacttca agccacatct ggacttagtc 2100cctccctgca gactgtacag agcgagggca ggttatctta ccacccccca tccccgtgcc 2160ttcaccagct acatgaaacc cacatccttt ggacccccag atttgagctc tggaactccc 2220cccttcccgt atgctacctt gtctccaccc agccaccagc gtctccagac tcatgtgtga 2280atccatctct ccaagtgaag ggtcttggaa tcttctgttt gccatatagt gtgttgtcca 2340gatttctggg gagtcagaac aagttgatga ccaacccctc caaaactgaa cattgaagga 2400gggaaagatc attacaagca tcaggactgt tggtgtacac tcagttcagc caaagtggat 2460tctccaagtg ggagcaatat ggccgctttc ccatgagaaa gacattcaag atggtgacta 2520aatgactaaa tactttgcag agggacaaag atgggaacta gggatacgga tggaagtagt 2580agagaagata tatgaccatc tgcatcaaga ggaaggataa catatgacaa atcaagatga 2640aagaaataat ccaccccacc cccaccgcgt cctggccaat aagtatagcc tacatggctg 2700ttcattatct gggaaccaaa atggccacta tcttgactcc ttccttaaag atacagaaag 2760aattgaatcc aaggaatggg gtagggtgga aatagaagaa atgaagggga ctcttgggct 2820aagaatactt atgtttaata ataaaagggg gaggcaaaga tgcaaaaaaa aaaaaa 2876<210>2<211>2243<212>DNA<213>小鼠<400>2gagagaattg tgtgcagaga gaggctccag tccagcgtgg tgtgagaggc gtgctatcaa 60gaaagaagtt ggaggggaac cagtgcaacc ctaactctac gagatcttgg ggtacacaca 120ctcgggatgc tggcctccgc cctcctcgtt ttcctttgct gtttcaaagg acatgcaggg 180tggtcccggt actggatatc ggggaattca gccagtggcc agcatgacct ccacattaag 240cctgtggaat tggaagatga ggcatcgtat gagtgccagg cttcgcaagc aggtctccga 300tcacgaccag cccaactgca cgtgatggtc cccccagaag ctccccaggt actaggcggc 360ccctctgtgt ctctggttgc tggagttcct ggaaatctga cctgtcggag tcgtggggat 420tcccgacctg cccctgaact actgtggttc cgagatggga tccggctgga tgcgagcagc 480ttccaccaga ccacgctgaa ggacaaggcc actggaacag tggaaaacac cttattcctg 540accccttcca gtcatgatga tggcgccacc ttgatctgca gagcgcgaag ccaggccctg 600cccacaggga gggacacagc tgttacactg agccttcagt atcccccaat ggtgactctg 660
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Leu Val Leu Glu Glu Glu Gly Thr Leu Glu Thr Lys Asp Pro Thr Asn100 105 110Gly Tyr Tyr Lys Val Arg Gly Val Ser Val Ser Leu Ser Leu Gly Glu115 120 125Ala Pro Gly Gly Gly Leu Phe Leu Pro Pro Pro Ser Pro Leu Gly Pro130 135 140Pro Gly Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Phe Asn Pro His Leu Gly Met Val145 150 155 160Pro Pro Cys Arg Leu Tyr Arg Ala Arg Ala Gly Tyr Leu Thr Thr Pro165 170 175His Pro Arg Ala Phe Thr Ser Tyr Ile Lys Pro Thr Ser Phe Gly Pro180 185 190Pro Asp Leu Ala Pro Gly Thr Pro Pro Phe Pro Tyr Ala Ala Phe Pro195 200 205Thr Pro Ser His Pro Arg Leu Gln Thr His Val210 215<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>11cagctccaca acctacatca ttccgt 26<210>12<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头
<400>12acggaatgat gt 12<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用接头<400>13gtccatcttc tctctgagac tctggt 26<210>14<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>14accagagtct ca 12<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>15ctgatgggtg tcttctgtga gtgtgt 26<210>16<211>12<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>16acacactcac ag 12<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>17ccagcatcga gaatcagtgt gacagt 26<210>18<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>18actgtcacac tg 12<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>19gtcgatgaac ttcgactgtc gatcgt 26
<210>20<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述cDNA扩增所用的接头<400>20acgatcgaca gt 12<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>21ggctttacac tttatgcttc cggctc 26<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>22cagctatgac catgattacg ccaagc 26<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物
<400>23aggcgattaa gttgggtaac gccagg 26<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>24ccagtcacga cgttgtaaaa cgacgg 26<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>25cttcccgtat gctaccttgt ctccac 26<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>26tccatctctc caagtgaagg gtcttg 26<210>27<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>27ccaacagtcc tgcatgcttg taatga 26<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述RACE方法中所用的引物<400>28tccttcaatg ttcagttttg gagggg 2权利要求
1.一种含有选自核苷酸序列(i)-(iv)的序列的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异性表达的65B13多肽，或其抗原片段，(i)含有SEQ ID NO1的核苷酸177-2280或SEQ ID NO2的核苷酸127-2079的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列中任意一个互补的序列；(ii)编码氨基酸序列SEQ ID NO3或4的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；(iii)编码在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失信号序列部分所得的氨基酸序列的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；(iv)编码在氨基酸序列SEQ ID NO3或4中缺失、插入、取代或增加一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列互补的序列；和(v)在严格条件下与核苷酸序列(i)杂交的核苷酸序列。
2.一种载体，包含权利要求1的多核苷酸。
3.一种宿主细胞，包含权利要求1的多核苷酸或权利要求2的载体。
4.一种多肽，由权利要求1的多核苷酸编码。
5.权利要求4所述多肽的片段，包含至少8个氨基酸残基。
6.抗体，抗权利要求4的多肽或权利要求5的多肽片段。
7.核苷酸链，编码权利要求5的多肽片段。
8.一种选择产多巴胺型神经元的方法，包括将权利要求6所述抗体与认为包含产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触的步骤。
9.一种选择产多巴胺型神经元的方法，包括将含有权利要求4所述多肽的至少胞外部分的肽与认为含有产多巴胺型神经元前体细胞的细胞样品接触的步骤。
10.刚刚停止分裂的产多巴胺型神经元前体细胞，用权利要求8或9的方法选出。
11.分离基因的方法，所述基因是产多巴胺型神经元前体细胞特异性基因以及前体细胞成熟为产多巴胺型神经元过程中的阶段-特异性基因，所述方法包括检测和分离在权利要求10的前体细胞或其分化、诱导或增殖后得到的细胞中特异性表达的基因。
12.以成熟作为指标进行筛选的方法，包括如下步骤，将试验物质与权利要求10的前体细胞接触，并检测因接触导致的所述前体细胞的分化或增殖。
全文摘要
本发明涉及刚刚停止分列的产多巴胺型神经元前体细胞中特异和瞬时表达的新基因65B13。65B13在细胞中的表达可作为指标来选择在其安全性、存活率和网络形成能力方面适合于帕金森氏病等神经变性疾病的移植治疗的细胞。
文档编号C12N15/12GK1729290SQ20038010723
公开日2006年2月1日 申请日期2003年10月21日 优先权日2002年10月22日
发明者皆木康子, 尾野雄一, 坂本佳正, 水原英理, 中谷智哉, 高井义美 申请人:卫材株式会社