专利名称:一种从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法
技术领域：
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法。
背景技术：
石蒜属(Lycoris Herb.)植物是石蒜科(Amaryllidaceae)中的一个重要属，为多 年生草本植物。据不完全统计，其在全世界约有20多种，主要分布于东亚的暖温带 至亚热带。石蒜中含有大量生物碱。国外科学家在20世纪初就提取分离出大量生物 碱。如Lycorine (石蒜碱)，tazettine (多花水仙碱)，homolycorine (高石蒜碱)，力口可 拉敏(lycoramine)，石蒜伦碱(lycorenine)，伪石蒜碱(pseudlycorine)，去甲普鲁维因 (norpluviine),表力口兰力口敏(epigalanthamine)，维他廷(vittatine)，普鲁维因(pluviine)， 小星蒜碱(hippeastrine)等生物碱。
我国科技相对落后，到了 20世纪50年代才开展石蒜生物碱的研究，也取得了一 定成果。如洪山海、马广恩等对我国石蒜也进行了植物化学及药理方面的研究，并从中 分离出新的化合物紫花石蒜碱(squamigerine)。
现代药理研究和临床表明，石蒜生物碱具有多种生物活性和疗效加兰他敏是 治疗老年期痴呆症、小儿麻痹后遗症及重症肌无力的特效药，对痴呆患者和脑器质性病 变引起的记忆障碍亦有改善作用；石蒜碱具有抗阿米巴原虫、抗癌、降压、催吐、祛 痰、解痉，比吗啡强5倍的镇痛作用、比阿司匹林也有更强的镇痛作用。其衍生物石 蒜碱内铵盐用于治疗消化道癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、恶性淋巴瘤等，其中 对胃癌、卵巢癌疗效较好；力可拉敏用于脊髓灰质炎后遗症性瘫痪，脑血管意外所致的 偏瘫，坐骨神经炎；多花水仙碱具有拟胆碱样作用，对吉田肉瘤的生长具有很好抑制作 用。
目前，现有技术中以石蒜为原料，经过烦琐的提取分离纯化步骤，只生产一种 石蒜生物碱单体产品而废弃富含其它宝贵活性成分的生物碱，没有充分利用石蒜资源， 并且生产周期长、产率收率不高、产品远没有达到药用级的高纯度要求。中国专利文献
“一种石蒜氢溴酸加兰他敏酸水浸提生物碱提取方法及工艺”(公开号CN1569856，公开 日为2005.01.26)中大量使用酸提取，生产过程中使用大量酸碱，排放大量废酸废碱，严 重污染环境，不利于产业化；“从石蒜粗提物中分离高纯度加兰他敏的方法”(公开号 CN1490319,
公开日为2004.04.21)中的工艺中大量使用有机溶剂，生产安全系数低，成 本高，工业化生产受到限制；中国专利文献“从石蒜或雪花莲属原料中提取加兰他敏的 方法”(公开号CN1696131，
公开日为2005.11.16)中所用仪器价格昂贵、处理量小、需 要高级技术人员才能操作，不适宜放大生产，产业化受到限制；并且大多数工艺都只得 到单一产品，造成资源浪费。如“从石蒜粗提物中分离高纯度加兰他敏的方法”、“从 石蒜粗提物中分离高纯度加兰他敏的方法”、“一种石蒜氢溴酸加兰他敏树脂吸附除杂 方法及工艺”和“从石蒜属植物中提取力可拉敏的工艺方法”等专利文献。[0006]总之，现有以石蒜为原料生产生物碱的方法存在以下不足产品单一、步骤烦 琐、周期长、产品收得率不高、安全系数低、成本高、石蒜资源利用率不高和环境污染 严重，以及不易产业化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法，该方法产 品收得率高，可以同时得到多种产品，并且环境污染低。
本发明提供的从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法，其步骤包括
(1)在切碎后的石蒜属植物中加入体积为2 10倍量的水，再加入复合纤维素 酶，复合纤维素酶与石蒜属植物的质量百分比为0.1 0.5%，调节pH值至5 8，在温 度20 60°C下酶解2 24小时，再将酶解后石蒜属植物细胞破碎，过滤，得到提取液；
(2)浓缩上述提取液，得到提取物浓缩液，该浓缩液的比重在20°C测量时为 1.05 1.15 ；
(3)按pH值分步对上述提取物浓缩液进行萃取；
(4)将萃取各步得到的产物以粗产品比填料为1 60 1 5的量分别进行柱层 析，再进行洗脱；
(5)将柱层析分离得到的相同组分合并，反复重结晶，得到多种高纯度单体。
本发明方法对上述技术方案进行了下述优化，
步骤(1)中复合纤维素酶的组分及质量比为纤维素酶40-50 %，果胶酶 30-40%,半纤维素酶20-30%。
步骤(3)按下述过程进行萃取
第一步萃取将提取物浓缩液的pH调至5 7，加入0.5 3倍体积有机溶剂 进行萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第一步萃取产物；
第二步萃取将第一步萃取得到的水相调pH值至7 10，加入0.5 3倍体积 有机溶剂进行萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第二步萃取产物；
第三步萃取将第二步萃取得到的水相调pH值至10 11，加入0.5 3倍体积 有机溶剂进行萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第三步萃取产物；
萃取用的有机溶剂为氯仿、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醚和异戊醇中的一 种。
步骤(4)中，柱层析分离用的载体为大孔树脂、硅藻土、碳18填料、硅胶或氧 化铝中的一种；层析柱分离用的洗脱液为水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和乙 醚中的一种或几种混合。
步骤(5)中重结晶用的溶剂为水、甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、正丙醇和异丙醇 中的一种或几种混合。
本发明方法具有以下技术效果
(1)提取率高，生产步骤简单采用生物酶解技术将植物细胞壁部分分解，再 利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的化学成分与 溶剂充分接触，使有效成分快速溶解转移，在极短时间内达到内外溶解平衡，既大幅度 提高植物中生物碱的溶出，又避免高温提取时的杂质溶出，提高生产过程中的滤过速度和纯化效果，简化后续分离纯化步骤。本发明与传统提取方法比较，使用酸碱和有机溶 剂的量大大减少，因而对环境无污染、成本低。
(2)本发明采用的分段萃取技术，与以往工艺产品单一不同，根据pH的不同将 提取物分成3段，至少得到3种主要产品，综合利用石蒜，大大提高了经济作物石蒜的价值。
(3)本发明产品纯度高加兰他敏纯度达到99.5%、力可拉敏纯度达到99%以 上，多花水仙碱纯度可达99%，达到药用要求，或可制备药用其衍生物。
具体实施方式
下面举例加以说明，这些实施例只是对本发明方法的进一步详细描述，并不意 味着对本发明的任何限制。
实施例1
(1)提取
取10kg干石蒜片，30kg水溶液，于多功能提取罐中，调pH在6-7之间，温度为 室温，加入纤维素酶13.5g、果胶酶9.6g、半纤维素酶6.9g，酶解8小时，酶解结束后， 采用机械破碎技术将植物组织捣碎，过滤，滤液在真空度为0.08-0.09MPa、70°C浓缩， 得到1.3L比重为1.10(20°C时)的提取物浓缩液。
机械破碎技术可以是组织捣碎勻浆技术、固体样品粉碎技术、高压细胞破碎技 术或闪式提取技术。
(2)萃取
第一步萃取调提取物浓缩液的pH至6.5，加入乙醚进行2次萃取，用量分别 为1.3L、0.65L,合并乙醚相减压回收乙醚，得第一步萃取产物；
第二步萃取第一步萃取的水相调pH值至8.5-9.5，乙酸乙酯萃取5次，每次用 量为0.5L，合并乙酸乙酯相减压回收乙酸乙酯，得第二步萃取产物；
第三步萃取第二步萃取分出的水相调pH值至10.5-11，乙醚萃取两次，用量 分别为0.6L、0.4L,合并乙醚相减压回收乙醚得第三步萃取产物；
(3)分离精制
第一步萃取产物加少量水溶解，碳酸氢钠碱化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比 例第三步萃取次，合并乙酸乙酯相减压回收乙酸乙酯，以产品比硅胶1 20上柱，石油 醚乙酸乙酯(10 1-1 10)梯度洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，甲醇-氯仿重 结晶，烘干得1.8g多花水仙碱。
第二步萃取产物加少量水溶解，以产品比碳18为1 10上柱，分别以水，30% 甲醇、60%甲醇、纯甲醇、乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘 干得11.2g加兰他敏。
第三步萃取产物加少量水溶解，以产品比硅藻土为1 50上柱，以石油醚、乙 酸乙酯、丙酮、甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得 13.7g力可拉敏。
实施例2
(1)提取[0042]取10kg干石蒜片，40kg水溶液，于多功能提取罐中，调pH在5-6之间，温度为 40加入纤维素酶8.4g、果胶酶6.6g、半纤维素酶5g，酶解2小时后使用组织捣碎勻浆 破碎样品，过滤，滤液在真空度为0.08-0.09MPa、77°C浓缩，得到1.2L比重为1.07 (20°C 时)的提取物浓缩液。
(2)萃取
第一步萃取调提取物浓缩液的pH至5.0，加入正丁醇进行3次萃取，用量分 别为0.6L、0.4L、0.4L,合并正丁醇相，减压回收正丁醇，得第一步萃取产物；
第二步萃取第一步萃取的水层调pH值至9.0-9.5，氯仿第三步萃取次，用量分 别为0.6L、0.4L、0.4L,合并氯仿相减压回收氯仿，得第二步萃取产物；
第三步萃取第二步萃取的水层调pH值至10.0-10.5，异戊醇萃取6次，用量分 都为0.4L，合并异戊醇相减压回收异戊醇，得第三步萃取产物；
(3)分离精制
第一步萃取产物加少量水溶解，氢氧化钠碱化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1第 三步萃取次，合并乙酸乙酯相减压回收，以产品比大孔树脂1 60上柱，水，25%、 50%, 75%乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醚重结晶，烘干得1.6g多花水 仙碱。
第二步萃取产物加少量水溶解，以产品比硅胶为1 10上柱，分别以石油醚， 氯仿、无水乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘干得7.8g加兰他敏。
第三步萃取产物加少量水溶解，以产品比氧化铝为1 40上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得15.6g力可拉 敏。
实施例3
(1)提取
取10kg干忽地笑片，100kg水溶液，调pH在7-8之间，温度为55度，加入纤 维素酶21.15g、果胶酶13.95g、半纤维素酶9.9g，酶解24小时，使高剪切闪式提取器 破碎样品10分钟，过滤，滤液在真空度为0.08-0.09MPa，77°C浓缩，得到2.1L比重为 1.05(20°C时)的提取物浓缩液。
(2)萃取
第一步萃取调提取物浓缩液的pH至6.0，加入乙酸乙酯进行4次萃取，每次 用量为0.6L，合并乙酸乙酯相，减压回收乙酸乙酯得第一步萃取产物；
第二步萃取第一步萃取的水相调pH值至9.3-9.8，氯仿萃取二次，用量为0.8L 和0.6L，合并氯仿相，减压回收氯仿，得第二步萃取产物；
第三步萃取第二步萃取的水相调pH值至10.7-10.9，乙醚萃取三次，用量均为 0.6L，合并乙醚相，减压回收乙醚，得第三步萃取产物；
(3)分离精制
第一步萃取产物加少量水溶解，碳酸氢钠碱化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取， 合并乙酸乙酯相减压回收乙酸乙酯，以产品比氧化铝1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、 甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇-水重结晶，烘干得4.5g多花水仙碱。
第二步萃取产物加少量水溶解，以产品比硅胶为1 35上柱，分别以石油醚， 氯仿、无水乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘干得13.7g加兰他敏。
第三步萃取产物加少量水溶解，以产品比氧化铝为1 30上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得11.6g力可拉 敏。
权利要求
1. 一种从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法，所述活性生物碱为多花水仙碱、加 兰他敏和力可拉敏，该方法的步骤包括(1)在切碎后的石蒜属植物中加入体积为2 10倍量的水，再加入复合纤维素酶，复 合纤维素酶与石蒜属植物的质量百分比为0.1 0.5%，调节pH值至5 8，在温度20 60°C下酶解2 24小时，再将酶解后石蒜属植物细胞破碎，过滤，得到提取液；复合纤 维素酶的组分及质量比为纤维素酶40-50%、果胶酶30-40%、半纤维素酶20-30%;(2)浓缩上述提取液，得到提取物浓缩液，该浓缩液的比重在20°C测量时为1.05 1.15 ；(3)按pH值分步对上述提取物浓缩液进行萃取，萃取过程为第一步萃取将提取物浓缩液的pH调至5 7，加入0.5 3倍体积有机溶剂进行 萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第一步萃取产物；第一步萃取采用 的有机溶剂为乙醚、正丁醇或乙酸乙酯；第二步萃取将第一步萃取得到的水相调pH值至7 10，加入0.5 3倍体积有机 溶剂进行萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第二步萃取产物；第二步 萃取采用的有机溶剂为乙酸乙酯或氯仿第三步萃取将第二步萃取得到的水相调pH值至10 11，加入0.5 3倍体积有 机溶剂进行萃取1 4次，合并有机溶剂相，减压回收有机溶剂得第三步萃取产物；第三 步萃取采用的有机溶剂为乙醚或异戊醇(4)多花水仙碱按照下述方式A1-A3中的一种进行分离(A1)第一步萃取产物加少量水溶解，碳酸氢钠碱化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比例 萃取3次，合并乙酸乙酯相减压回收乙酸乙酯，以产品比硅胶1 20上柱，石油醚乙 酸乙酯按10 1-1 10梯度洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，甲醇-氯仿重结晶， 烘干得到多花水仙碱；(A2)第一步萃取产物加水溶解，氢氧化钠碱化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1萃取3 次，合并乙酸乙酯相减压回收，以产品比大孔树脂1 60上柱，水、25%、50%, 75% 乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醚重结晶，烘干得到多花水仙碱；(A3)第一步萃取产物加水溶解，碳酸氢钠碱化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取，合并乙 酸乙酯相减压回收乙酸乙酯，以产品比氧化铝1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、甲醇分 别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇-水重结晶，烘干得到多花水仙碱； 加兰他敏按照下述方式B1-B3中的一种进行分离(B1)第二步萃取产物加水溶解，以产品比碳18为1 10上柱，分别以水、30%甲 醇、60%甲醇、纯甲醇、乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘干 得到加兰他敏；(B2)第二步萃取产物加水溶解，以产品比硅胶为1 10上柱，分别以石油醚、氯 仿、无水乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘干得到加兰他敏；(B3)第二步萃取产物加水溶解，以产品比硅胶为1 35上柱，分别以石油醚、氯 仿、无水乙醇洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，乙醇重结晶，烘干得到加兰他敏； 力可拉敏按照下述方式C1-C3中的一种进行分离(C1)第三步萃取产物加水溶解，以产品比硅藻土为1 50上柱，以石油醚、乙酸乙 酯、丙酮、甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得到力 可拉敏；(C2)第三步萃取产物加水溶解，以产品比氧化铝为1 40上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得到力可拉敏；(C3)第三步萃取产物加水溶解，以产品比氧化铝为1 30上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分别洗脱，薄层跟踪检测，合并相同组分，正丙醇重结晶，烘干得到力可拉敏； (5)将柱层析分离得到的相同组分合并，反复重结晶，得到多种高纯度单体。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于重结晶用的溶剂为水、甲醇、乙醇、 氯仿、乙醚、正丙醇和异丙醇中的一种或几种混合。
专利摘要
本发明公开了一种从石蒜属植物中提取活性生物碱的方法，采用酶法与现代机械破壁技术结合提取石蒜生物碱，达到在温和条件下高效高产率提取石蒜中的生物碱，减小其它杂质的溶出，减小提取液粘度利于后续分离纯化的处理；并根据石蒜生物碱碱性强弱不同，使用分段萃取技术同步得到多种石蒜生物碱粗产品，再经过柱层析和反复重结晶得到高纯度的石蒜生物碱单体(加兰他敏、石蒜碱、力可拉敏、多花水仙碱)。本发明路线简单、无污染、周期短、产品收得率高、安全系数高、成本低、产品多样，提高了石蒜综合利用度，同时降低了石蒜深加工的生产成本，工业化大生产可行性强。
文档编号C12P17/18GKCN101157947 B发布类型授权 专利申请号CN 200710053207
公开日2011年4月20日 申请日期2007年9月13日
发明者余龙江, 崔永明, 廖娜, 张明, 敖明章, 江喜敏 申请人:华中科技大学, 恩施市锦华生物工程有限责任公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),