专利名称:纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域：
的表面活性剂的生产方法，具体是一种纤维素 酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法。
背景技术：
微生物在代谢过程中分泌出的具有表面活性与界面活性、集亲水基与疏水基 结构于同一分子内部的两亲性化合物，称为生物表面活性剂。生物表面活性剂包 括许多不同的种类，如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂 等。生物表面活性剂可以促进土壤中难溶有机物的分散和吸收，可以增加憎水性 有机化合物与液相之间的接触面，从而增强微生物活性，提高纤维素降解率以及 堆肥效率。此外，在石油工业(如石油的生物降粘及提高原油采收率等)中生物 表面活性剂也可发挥极大的作用。而且，与化学合成的表面活性剂相比，生物表 面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外，还具有化学合 成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等特性及生物兼容性，因此，近年来 人们对生物表面活性剂的研究日益增多。但影响生物表面活性剂工业应用的主要 障碍是其低产量和高成本。
经对现有技术的检索发现，中国专利公开号为CN1657613，专利名称为"利 用生物表面活性剂提高绿色木霉纤维素酶活的方法"，该专利先将鼠李糖脂类生 物表面活性剂分离纯化，然后添加至绿色木霉的固态或液态发酵培养基中，可以 提高纤维素酶活力。但是，这种先分离纯化再添加的方法会大大增加鼠李糖脂的 生产成本。
在纤维素酶水解体系中，至今未有采用生物表面活性剂的在线生产添加方式 的相关技术报道。由于生物表面活性剂的在线生产可以省去生物表面活性剂的分 离纯化工艺，既可有效的降低其生产成本，也可以有效提高纤维素的酶水解效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法，将里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07分别 用于纤维素酶的生产与鼠李糖脂类生物表面活性剂的生产。里氏木霉ZM4-F3与 铜绿假单胞菌BSZ-07可分别由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)与中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)购到。将铜绿假单胞菌BSZ-07直接添加至用里氏木霉 ZM4-F3水解纤维素的体系中，从而实现鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产 方式。此种鼠李糖脂的在线生产添加技术能够达到降低生产成本，简化工艺流程 的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤
第一步，将收割后的稻草洗净、切断，干燥至恒重，在纤维素酶水解前，将 切好的稻草用碱进行处理；
所述将收割后的稻草洗净、切断，干燥至恒重，是指将收割后的稻草用自 来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cm的小段，切好的稻草置于 70 'C烘箱中干燥至恒重，在室温下储存。
所述将剪切好的稻草用碱进行处理，是指将10g剪好的稻草置于40m12 % (体积浓度v/v)的氢氧化钠中，保持固液体质量比为1 : 4， 85 'C水浴1 h。 用蒸馏水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至恒重。
第二步，将处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养，用以产生 还原糖。
所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养，是在30 'C、 200rpm摇床中进行。
所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养，采用的培养基的成份为稻草3g， 麸皮1 g， Mandels微量元素盐溶液0. 5 mL，营养盐10 mL，蛋白胨0. 1 g，用 蒸馏水定容至100mL， pH值调至4.8。其中所述营养盐中含有磷酸二氢钾0. 4%， 硫酸铵1.6%，硫酸镁O. 1%，蒸馏水97.9%，这是指质量浓度。
第三步，然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到第二步的 稻草水解体系中，实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产，以促进纤维素酶的水 解。
所述第三步，具体为将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以 制备种子悬液，保持密度为106孢子/mL。然后，取菌株的种子悬液5 mL，接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中，35 °C、 200 r/min摇床中振荡培养24 h 至对数生长期，用于生产生物表面活性剂。将2-6 mL处于对数生长期的铜绿假 单胞菌BSZ-07种子液接种到第二步的稻草水解体系中，其中稻草水解体系的体 积为100mL。菌种在35 'C、 200 r/min摇床中培养48 h，用于稻草水解。该步 骤中的种子培养基和发酵产生物表面活性剂培养基可以采用现有的培养基。
所述种子培养基成份为牛肉膏3 g， N我l g， (NH4)2S04 1 g， Na2HP04 1.2 g， KH2P04 1 g， MgS04 7H20 0. 01 g， CaCl2 0. 002 g，水1000 mL， pH 6. 5-7. 0。
所述发酵产生物表面活性剂培养基的成份为葡萄糖2 g，酵母膏O. 1 g， N跳0.5 g，机油2 mL， KH2P04 1 g， Na2HP041 g， MgS04 7H20 0. 02 g，微量 元素溶液0. 5 mL,水1000 mL。
与不接种铜绿假单胞菌BSZ-07的纤维素酶水解对照样相比，鼠李糖脂生物 表面活性剂的在线生产添加可对纤维素水解起显著的增效作用。由于鼠李糖脂的 在线生产可以省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺，因此可以有效降低其生产成 本，使其成为一种较有潜力的添加方式。
本发明在纤维素酶产生菌一里氏木霉ZM4-F3水解稻草的过程中，向其中直 接添加培养至对数生长期的鼠李糖脂生物表面活性剂产生菌一铜绿假单胞菌 BSZ-07,实现了鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产添加方式。由于此种在线 生产的添加方式可省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺，因此可以有效的降低鼠李 糖脂生物表面活性剂的生产成本，适用于工业生产。此外，鼠李糖脂的添加会有 效提高纤维素酶的水解效率。本发明可有效降低生物表面活性剂的生产成本、简 化其生产工艺，并适用于大规模工业化生产。
所述的里氏木霉ZM4-F3，可由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)购买， 该菌种的保藏信息里氏木霉(Trichoderma reesei)、中国工业微生物菌种保 藏中心、北京市朝阳区霄云路32号、2006年5月、编号40360。
所述的铜绿假单胞菌BSZ-07,可由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购买， 该菌种的保藏信息铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、中国典型培养 物保藏中心、武汉市武昌区珞珈山、2006年5月、编号AB93066。
图1是将铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，即实现在线生产鼠李糖脂类生物表面活性剂的添加方式与纤 维素酶水解对照样产还原糖的比较图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。
为了证实鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产添加方式对纤维素酶水解 的影响，利用752型紫外分光光度计测定了还原糖产量，并与单独纤维素酶水解 体系的对照样进行了对比。
实施例1
将收割后的稻草用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cm 的小段。切好的稻草置于7(TC烘箱中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。 在酶水解前，将剪切好的稻草用碱进行预处理，具体方法为将10g剪好的稻 草置于装有40ml2X的氢氧化钠的锥形瓶中，保持固液体质量比为1 : 4， 85 °C 水浴l h。用蒸馏水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30 °C、 200 rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以2%接种量接种到稻草水 解体系中，S卩将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬 液，保持密度为106孢子/mL。然后，取菌株的种子悬液5mL，接种到100mL发 酵产表面活性剂培养基中，35 °C、 200 r/min摇床中振荡培养24 h至对数生长 期，用以生产生物表面活性剂。将2mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07 种子液接种到稻草水解体系中，其中稻草水解体系的体积为100 mL。菌种在35 。C、 200 r/min摇床中培养48 h，用于稻草水解。
本实施例中，所述虽氏木霉ZM4-F3水解产糖培养，采用的培养基的成份为 稻草3 g，麸皮1 g， Mandels微量元素盐溶液0. 5 mL，营养盐(磷酸二氢钾0. 4%， 硫酸铵1. 6%，硫酸镁0. 1%，此处的百分含量指质量浓度)10 mL，蛋白胨0. 1 g, 用蒸馏水定容至100 mL， pH值调至4. 8。所述种子培养基成份为:牛肉膏3 g， ,31 g， (NH4)2S04 1 g， Na2HP04 1. 2 g， KH2P04 1 g， MgS04 7H20 0 . 01 g， CaCl2 0. 002 g，水1000 mL， pH 6. 5-7. 0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为葡萄糖2g，酵母膏0.1g， NH4N03 0. 5 g，机油2 mL， KH2P04 1 g， Na2HP041 g， MgS04 7H20 0. 02 g，微量元素溶 液0. 5 mL，水1000 mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表 面活性剂的在线生产添加，以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系 的对照样进行了对比。
研究发现，鼠李糖脂的在线生产添加方式，即将铜绿假单胞菌BSZ-07以2% 接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，自第48 h起其还原糖 产量即迅速增加。在对照样中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间，此时 其产还原糖量达最大值，为2. 231 g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以2%接种量 直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，产糖84 h时就可使还原糖量 达2.277 g/1。因此，此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产 量，还能明显縮短最优产糖时间。
实施例2
将收割后的稻草用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cra 的小段。切好的稻草置于7(TC烘箱中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。 在酶水解前，将剪切好的稻草用碱进行预处理，具体方法为将10g剪好的稻 草置于装有40ml2X的氢氧化钠的锥形瓶中，保持固液体质量比为1 : 4， 85'C
水浴i h。用蒸馏水洗至中性，置于70 r烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30 °C、 200 rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量接种到稻草水 解体系中将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50 mL种子培养基中以制备种子悬液， 保持密度为106孢子/mL。然后，取菌株的种子悬液5 mL，接种到100 mL发酵产 表面活性剂培养基中，35 'C、 200 r/min摇床中振荡培养24 h至对数生长期， 用以生产生物表面活性剂。将4 mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中，其中稻草水解体系的体积为100 mL。菌种在35 'C、 200 r/min摇床中培养48 h，用于稻草水解。
其中，所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养，采用的培养基的成份为稻草 3 g，麸皮l g， Mandels微量元素盐溶液0. 5 mL，营养盐(磷酸二氢钾0.4%， 硫酸铵1.6%，硫酸镁O. 1%，此处的百分含量指质量浓度)10mL，蛋白胨O. lg， 用蒸馏水定容至100 mL， pH值调至4.8。
所述种子培养基成份为牛肉膏3 g, NaN031 g， (NH4)2S04 1 g, Na2HP04 1. 2 g， KH2P04 1 g， MgS04 7H20 0. 01 g， CaCl2 0. 002 g，水1000 mL， pH 6. 5—7. 0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为葡萄糖2g，酵母膏0.1g， NH4N03 0.5 g，机油2 mL， KH2P04 1 g， Na2HP041 g， MgS04 7H20 0.02 g，微量元素溶 液0. 5 mL，水1000 mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表 面活性剂的在线生产添加，以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系 的对照样进行了对比。
研究发现，鼠李糖脂的在线生产添加方式，即将铜绿假单胞菌BSZ-07以4% 接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，自第48 h起其还原糖 产量即迅速增加。在对照样中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间，此时 其产还原糖量达最大值，为2.231 g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量 直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，产糖84 h时就可使还原糖量 达2.571 g/l。因此，此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产 量，还能明显縮短最优产糖时间。
实施例3
将收割后的稻草用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cm 的小段。切好的稻草置于70'C烘箱中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。 在酶水解前，将剪切好的稻草用碱进行预处理，具体方法为将10g剪好的稻 草置于装有40ml2X的氢氧化钠的锥形瓶中，保持固液体质量比为1 : 4， 85 °C 水浴l h。用蒸馏水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至恒重。将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30 °C、 200 rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以6%接种量接种到稻草水 解体系中将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50 mL种子培养基中以制备种子悬液， 保持密度为1(T孢子/mL。然后，取菌株的种子悬液5mL，接种到100mL发酵产 表面活性剂培养基中，35 °C、 200 r/min摇床中振荡培养24 h至对数生长期， 用以产生生物表面活性剂。将6 mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子 液接种到稻草水解体系中，其中稻草水解体系的体积为100 mL。菌种在35 °C、 200 r/min摇床中培养48 h，用于稻草水解。
其中，所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养，采用的培养基的成份为稻草 3 g，麸皮l g， Mandels微量元素盐溶液0. 5 mL，营养盐(磷酸二氢钾0.4%， 硫酸铵1.6°/。，硫酸镁0.1%，此处的百分含量指质量浓度)10mL，蛋白胨O. lg， 用蒸馏水定容至100 mL， pH值调至4.8。
所述种子培养基成份为牛肉膏3 g， NaN03l g， (NH4)2S04 1 g， Na2HP04 1.2 g， KH2P04 1 g， MgS04 7H20 0. 01 g， CaCl2 0. 002 g，水1000 mL， pH 6. 5-7. 0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为葡萄糖2g，酵母膏0.1g， NH4N03 0. 5 g，机油2 mL， KH2P04 1 g， Na2HP041 g， MgS04 7H20 0. 02 g，微量元素溶 液0. 5 mL，水1000 mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表 面活性剂的在线生产添加，以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系 的对照样进行了对比。
研究发现，鼠李糖脂的在线生产添加方式，即将铜绿假单胞菌BSZ-07以6% 接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，自第48 h起其还原糖 产量即迅速增加。在对照样中，96 h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间，此时 其产还原糖量达最大值，为2.231 g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以6%接种量 直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时，产糖84 h时就可使还原糖量 达2.432 g/1。因此，此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产 量，还能明显縮短最优产糖时间。从图1可以看出，与只有里氏木霉ZM4-F3单独水解稻草时的对照样相比， 铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解样品自第48 h起的还原糖产量 迅速增加并超过对照样之值。在对照样中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖 时间，此时其产还原糖量达最大值，为2.231 g/L。而在共水解(即在线生产) 样品中，产糖84 h时就可使还原糖量达2. 571 g/L。因此研究结果表明，铜绿 假单胞菌BSZ-07向稻草秸秆降解过程中的添加不仅能增加还原糖的产量，还能 明显縮短稻草秸秆降解时间。
权利要求
1、一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法，其特征在于，包括如下步骤
第一步，将收割后的稻草洗净、切断，干燥至恒重，在纤维素酶水解前，将切好的稻草用碱进行处理；
第二步，将处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养，用以产生还原糖；
第三步，然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到第二步的稻草水解体系中，实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产，促进纤维素酶的水解。
2、 根据权利要求
1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述将收割后的稻草洗净、切断，干燥至恒重，是指将 收割后的稻草用自来水冲洗4_5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cm的小段， 切好的稻草置于70 'C烘箱中干燥至恒重，在室温下储存。
3、 根据权利要求
1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述将剪切好的稻草用碱进行处理，是指将10 g剪好 的稻草置于40ml2X体积浓度的氢氧化钠中，保持固液体质量比为l: 4， 85 °C 水浴l h，用蒸馏水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至恒重。
4、 根据权利要求
1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养，是在30 °C、 200 rpm摇床中进行。
5、 根据权利要求
1或4所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的 在线生产方法，其特征是，所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养，采用的 培养基的成份为稻草3 g，麸皮l g， Mandels微量元素盐溶液0.5 mL，营养 盐10 mL，蛋白胨O. 1 g，用蒸馏水定容至IOO mL， pH值调至4.8。
6、 根据权利要求
5所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述营养盐中组分质量浓度磷酸二氢钾0.4%，硫酸铵 1.6%，硫酸镁O. 1%，蒸馏水97.9%。
7、 根据权利要求
1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法，其特征是，所述第三步，具体为将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL 种子培养基中以制备种子悬液，保持密度为106孢子/mL;然后，取菌株的种子 悬液5mL，接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中，35 'C、 200 r/min摇床 中振荡培养24 h至对数生长期；将2-6 mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌 BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中，其中稻草水解体系的体积为100 mL，菌 种在35 °C、 200 r/min摇床中培养48 h，用于稻草水解。
8、 根据权利要求
7所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述种子培养基成份为牛肉膏3g， NaN03lg, (NH4)2S04 1 g， Na2HP04 1. 2 g， KH2P04 1 g， MgS04 7H20 0. 01 g， CaCl2 0. 002 g，水1000 mL， pH 6. 5-7. 0。
9、 根据权利要求
7所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线 生产方法，其特征是，所述发酵产生物表面活性剂培养基的成份为葡萄糖2 g，酵母膏0. 1 g， NH萬O. 5 g，机油2 raL， KH2P04 1 g， Na2HP041 g， MgS04 , 7H20 0. 02 g，微量元素溶液0. 5 mL，水1000 mL。
专利摘要
本发明涉及一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法，属于生物技术领域：
。第一步，将收割后的稻草洗净、切断，干燥至恒重，在纤维素酶水解前，将切好的稻草用碱进行处理；第二步，将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在摇床中进行水解产糖培养，用以产生还原糖；第三步，然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到水解体系中，实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产，以促进纤维素酶的水解。由于此种在线生产的添加方式可省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺，因此可以有效的降低鼠李糖脂生物表面活性剂的生产成本，适用于工业生产。此外，鼠李糖脂的添加会有效提高纤维素酶的水解效率。
文档编号C12P39/00GKCN101538604SQ200910049013
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月9日
发明者张秋卓, 蔡伟民 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan