专利名称：:亚麻ttc和atc重复基序微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种亚麻的DNA分子遗传标记。技术背景微卫星(Microsatellite)，又称为简单序列重复(simplesequencer印eat，SSR)或短串联重复(shorttandemr印eat，STR)，是以少数几个核苷酸(1-6个)为重复单位的串联重复DNA序列。由于微卫星具有高水平的杂合性和突变率、双亲遗传模式等优势，加之便于检测，费用低廉，因此广泛用于遗传图谱构建、基因定位、标记辅助育种、家系分析、品种鉴定以及进化分析等研究。如用微卫星标记研究樱桃品种间的亲缘关系(艾呈祥等，2007，果树学报，24(4):460-465)、用微卫星DNA标记进行猪品种分类的专利申请"适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记"(公开号CN1370834A)。亚麻(LinumusitatissmumL.)是亚麻禾斗(Linaceae)亚麻属(Linum)的一年生草本纤维植物，已经有六七千年的栽培历史。亚麻既是世界第3大纤维作物，又是5大油料作物之一。作为一种重要的经济作物，亚麻在微卫星分子标记方面的研究远远滞后于其他作物。大豆、棉花、水稻、葡萄、花生的SSR标记已有许多研究，并公开发表了大量可以直接利用引物序列，而现有亚麻的微卫星标记数量非常有限，仅有法国科学家Roose-Amsaleg等分离的28个微卫星标记(Roose-AmsalegC等，2006，MolecularEcologyNotes,6(3):796-799)。这严重制约了微卫星标记在亚麻遗传学、分子生物学方面的研究和应用。因此，迫切需要获得更多独立分离的、多态性丰富的亚麻微卫星标记。
发明内容本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立亚麻的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行品种分类，遗传关系分析和辅助育种。实现上述发明目的的技术方案包括亚麻(TTC)n和(ATC)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到28个含有(TTC)n和10个含有(ATC)n的微卫星克隆，确定了38个多态性丰富的微卫星标记LU26、LU27、LU28、LU29、LU30、LU31、LU32、LU33、LU34、LU35、LU36、LU37、LU38、LU39、LU40、LU41、LU42、LU43、LU44、LU45、LU46、LU47、LU48、LU49、LU50、LU51、LU52、LU53、LU54、LU55、LU56、LU57、LU58、LU59、LU60、LU61、LU62、LU63;其中LU26为405个核苷酸、LU27为283个核苷酸、LU28为518个核苷酸、LU29为280个核苷酸、LU30为284个核苷酸、LU31为283个核苷酸、LU32为283个核苷酸、LU33为379个核苷酸、LU34为333个核苷酸、LU35为340个核苷酸、LU36为345个核苷酸、LU37为351个核苷酸、LU38为416个核苷酸、LU39为688个核苷酸、LU40为562个核苷酸、LU41为330个核苷酸、LU42为291个核苷酸、LU43为362个核苷酸、LU44为390个核苷酸、LU45为341个核苷酸、LU46为280个核苷酸、LU47为326个核苷酸、LU48为405个核苷酸、LU49为321个核苷酸、LU50为348个核苷酸、LU51为469个核苷酸、LU52为277个核苷酸、LU53为448个核苷酸、LU54为424个核苷酸、LU55为367个核苷酸、LU56为611个核苷酸、LU57为4431、核苷酸、LU58为297个核苷酸、LU59为261个核苷酸、LU60为t核苷酸、LU62为501个核苷酸、LU63为399个核苷酸。1374个核苷酸、LU61为380Il是用LU26位点的特异2是用LU27位点的特异3是用LU28位点的特异4是用LU29位点的特异5是用LU30位点的特异6是用LU31位点的特异7是用LU32位点的特异8是用LU33位点的特异9是用LU34位点的特异10是用LU35位点的特异11是用LU36位点的特异12是用LU37位点的特异13是用LU38位点的特异14是用LU39位点的特异15是用LU40位点的特异16是用LU41位点的特异17是用LU42位点的特异18是用LU43位点的特异19是用LU44位点的特异20是用LU45位点的特异21是用LU46位点的特异22是用LU47位点的特异23是用LU48位点的特异24是用LU49位点的特异25是用LU50位点的特异26是用LU51位点的特异27是用LU52位点的特异28是用LU53位点的特异29是用LU54位点的特异30是用LU55位点的特异31是用LU56位点的特异32是用LU57位点的特异33是用LU58位点的特异134是用LU59位点的特异135是用LU60位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图生引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图生引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图生引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图生引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图[0041]图36是用LU61位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图；图37是用LU62位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图；图38是用LU63位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。具体实施方式1、亚麻微卫星富集文库的构建(1)以亚麻品种白花幼苗为材料，采用改进的CTAB法(参见邓欣等，2007，中国麻业科学，29(4)184-188)提取亚麻基因组DNA。用限制性内切酶MseI酶切10iig亚麻基因组DNA，酶切产物经1.5X琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收300-1500bp的DNA片段。(2)将碱基互补的寡核苷酸primerA(5'-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3')和primerB(5'-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3')等摩尔混合，95。C变性5min，60。C退火lh，形成具有粘性末端的接头。(3)将酶切产物和接头用T4DNA连接酶连接。连接产物用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提一次，离心收集上清液，在上清液中加0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰乙醇纯化沉淀DNA，加入15iiL去离子水溶解。(4)接头连接片段的PCR扩增连接产物以primerA为引物进行PCR扩增。用普通DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN)纯化PCR产物，并将其浓縮至15iiL。(5)用生物素标记的探针(TTC)8和(ATC)8分别与纯化的接头连接DNA片段杂交。具体操作为建立50iiL杂交混合液反应体系含5iiL探针(10mol/L)，5iiLprimerA，15iiL20XSSC，10%SDS0.5iiL及12.5iiLddH20，68。C预热。将15iiL连接产物DNA片段于95t:变性5min，再加预热的杂交混合液，于68。C杂交lh。(6)将杂交混合液加入100yL链霉亲和素包被的磁珠(DynalM-280)中，于25°C温育20min。(7)用磁力架吸附磁珠，弃上清。依次用200iiL洗液1、洗液11(3XSSC，0.1%SDS)、洗液III(6XSSC)洗涤磁珠，去除不含微卫星的序列。方法是用洗液I在室温洗2次，每次静置8min;洗液II在68t:洗2次，每次静置15min;洗液III在室温快速洗2次。(8)用0.1XTE200yL在室温快速洗2次，加入0.1XTE50yL，95。C变性10min，小心吸取上清，上清液即含有微卫星序列的单链DNA，以primerA为引物，以单链DNA为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。(9)将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体(大连宝生物)上，然后将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞(TIANGEN)，转化液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选，得到微卫星基因组文库。2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计(1)挑取白色单菌落接种到lmLLB培养液中，于37t:培养过夜。(2)以菌液为模板，采取PIMA方法(参见Lunt等，1999，MolecularEcology,8:891-894)筛选含有(TTC)n和(ATC)n微卫星序列的阳性克隆。(3)将阳性克隆测序，分析是否含有(TTC)n和(ATC)n重复序列。[0059](4)根据微卫星重复序列两侧的保守序列设计引物。(5)测序结果采用SSRHunter1.3软件分析序列，并用BioeditSequenceAlignmentEditor软件对所有序列进行比对分析、归类，再用Premier3软件进行引物设计。对高度相似的一类微卫星序列设计特异引物，对进一步筛选的阳性克隆进行第二次PCR扩增，以提高筛选效率。3、利用亚麻微卫星DNA标记分析亚麻品种间的遗传差异将上述微卫星标记用于8个亚麻品种的分析，确定了38个多态性丰富、适用于亚麻品种分类的微卫星标记LU26、LU27、LU28、LU29、LU30、LU31、LU32、LU33、LU34、LU35、LU36、LU37、LU38、LU39、LU40、LU41、LU42、LU43、LU44、LU45、LU46、LU47、LU48、LU49、LU50、LU51、LU52、LU53、LU54、LU55、LU56、LU57、LU58、LU59、LU60、LU61、LU62、LU63(表1)。具体操作过程如下(1)按邓欣等的方法(参见邓欣等，2007，中国麻业科学，29(4):184-188)提取各个亚麻品种的DNA作为模板，进行PCR。(2)分别用LU26、LU27、LU28、LU29、LU30、LU31、LU32、LU33、LU34、LU35、LU36、LU37、LU38、LU39、LU40、LU41、LU42、LU43、LU44、LU45、LU46、LU47、LU48、LU49、LU50、LU51、LU52、LU53、LU54、LU55、LU56、LU57、LU58、LU59、LU60、LU61、LU62、LU63这38个位点的38对引物(引物序列见表1)扩增这8个亚麻品种的DNA。(3)将PCR产物在8%的丙烯酰胺凝胶上电泳，银染并拍照，得到图1-38。(4)结果分析每个扩增条带按有或无记录，扩增条带存在时赋值为l，否则赋值为0。采用SPSS10.1forwindows统计分析软件中的系统聚类分析程序，距离测量选用相关系数距离法，用类间平均连锁法(Between-groupslinkage)进行聚类分析并建立系统树。由附图1-38可看出，本发明的38个微卫星引物在供试的8个品种中都出现扩增片段的多态性，由此可见，本发明的这38个微卫星标记能用于亚麻品种分类和遗传关系分析。表1引物特性表引物序列，退火温度，片段大小位点基序引物序列(5'-3，)产物大小(bp)退火温度rc)F:TCATTCATCTCCTTCCACTAAAALU26(TTC)m17958R:TTGAAAGCCCTAGTAGACACCAF:TCCGGACCCTTTCAATATCALU27(TTC)u14560R:AACTACCGCCGGTGATGAGCTCGTGATCTCCTTCATCCL腦(TTC)"16260R:MAACCACGTCCAGATGCTCF:TTATTTCCGGACCCTTTCAALU29(TTC),014861R:AAACTACCGCCGGTGATGATF:GTCACTGGGTGTGTGTTTGCLU30(TTC)714060R:AGCAGAAGAAGATGGCGAAAF:CCCCATTTCTACCATCTCCTTLU31(TTC)713760R:CAACAGCGGAACTGATGAAAF:CATCCMCAAAGGGTGGTGLU32(TTC)2114660R:GGAACAAAGGGTAGCCATGA(TTC)l2TTT(TTF:TCCCGTAATATTCTATGTTCTTCCLU3319858C)22TTT(TTC)7R:TGAGTTGGACCTTACAAGACTCAF:TTGCGTGATTATCTGCTTCGLU34(TTC)1713260R:ATGGCAGGTTCTGCTGTTTCF:GCCTAAAGCTGATGCGTTTCLU35(TTC)1015060R:TGTCAGGCTCCTTCTTTTGC<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>F:CCTGCAGGAA嵐GTGAAGCLU51(TTC)u13560R:CTGCAAACAGCACMCTTCCF:GTTTGAGAAGAGGGCATCCALU52(TTC)4T(TTC)1716760R:GTTGGGGTGAAGAGGAACAAF:GCTGTTAGCACTCAGCAGCALU53(TTC),。13760R:CACGTTGACCMCAAAACCAF:GGGCAGTGATTGATTGGTTTLU54(ATC)511860R:GGCGGCMTTGCTACATT(ATC)s...(ATCF:TCTTGACCATCAGCATCACCLU5516860R:GAGGCACAGGGAAACTAACGF:TCTTTGTTTGGTGCCMAGTTLU56(ATC)1211258R:TTCATGATCTCACCTAACCTGAF:ACGCGTAAACTTTCCGTTTCLU57(ATC)1214760R:ATAATGTCGGCTGCTTCTGCF:TTCTCCATCATCTCACATCCALU58(ATC)416859R:CCAAATCAGAATGTGCGTGTF:GGAAGAATTGGAAGAGGAAGGLU59(ATC)512860R:CCTTCTCCCATGATCAAACAAF:CCAACGGATCATCCTCTAGCLU60(ATC)514961R:GGACAGAAAGGGGAAAGGAAF:GAAGTTCGTGGGAGGAGTTGLU61(ATC)1412760R:CCACATGAACCGCTGTAGAAF:AGTACCCAACGCCCAGATTT(ATC)912560LU62R:AACAGCAGTCCTGGCAGTCTF:GATCTTGTTGCCTGGGAAAGLU63(ATC)910460R:TTCGTTTGCAATACGTCAGC表l中F表示5'端引物，R表示3'端引物。本发明提供了38个亚麻微卫星位点的DNA序列及扩增上述38个亚麻微卫星位点的引物序列和扩增方法。38个亚麻微卫星位点用于亚麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。SEQUENCELISTING〈110〉中国农业科学院麻类研究所110076]〈120〉亚麻TTC和ATC重复基序微J0077]〈130〉亚麻TTC和ATC重复基序微J0078]〈160>380079]〈170>PatentInversion3.30080]〈210>10081]〈211>4040082]〈212>DNA0083]〈213〉亚麻0084]〈220〉0085]〈221〉TTC重复0086]〈222〉(95).(197)0087]〈400>10088]cateaacttc0089]cattcatctccttccactea0090]tcttcttcttcttcttcttcttcttcttct0091]tcttcttcttcttcttcggt0092]tC3Cg3gC3gc朋tecagc3atettgcctc0093]tegctggtegcttccaaacagcctcagcag0094]gtgg朋gCgElcgctttcgacactetgggte0095]〈210>20096]〈211>2830097]〈212>DNA0098]〈213〉亚麻0099]〈220〉0100]〈221〉TTC重复0101]〈222〉(131).(163)0102]〈400>20103]atgttecccttctccttcttcttctcttga0104]acttetttccggaccctttcaatatcaeca0105]tecctcctgcttcttcttcttcttcttctt0106]caccgacgccaccatcatcaceggeggteg0107]cga朋朋tggtcaattcttgttgaaegget0108]〈210>30109]〈211>5180110]0111]〈212>DNA〈213〉亚麻0112]〈220〉0113]〈221〉TTC重复0114]〈222〉(117).(150)星DNA标记星DNA标记cctcattegaatcatccctc60tcgccttcttcttcttcttcttcttcttct120tcttcttcttcttcttcttcttcttcttct180atec皿tggtgtctectegggctttcaaga240tegteccattgctgctgctgaccatttgga300cttggctccgagcccatgcaaccttctecg360tgtecacatc404tttgcaacgtcaateccgccgttegttetg60teacctcatttcteccatctccttcattct120cttcttcttcttcatttccgccgccgcccc180tttcatcagttccgctgttgtttettgagg240atccctttctgtt283<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0154]〈213〉亚麻0155]〈220〉0156]〈221〉TTC重复0157]〈222〉(143)(157)0158]〈400>60159]acgttecccttctccttcttcttctcttga0160]acttetttccggaccctttcaatatcaeca0161]tecctcctgcttcttcttctccttcttctt0162]caccgacgccaccatcatcaceggeggteg0163]cga朋朋tggtcaattcttgttgaaegget0164]〈210>70165]〈211>2830166]〈212>DNA0167]〈213〉亚麻0168]〈220〉0169]〈221〉TTC重复0170]〈222〉(113).(182)0171]〈400>70172]attggagggtggtggtggCgg郷ag腿g0173]cc朋ca朋gggtggtggtggg皿cgg皿cg0174]cttctttcttcttcttcttcttcttcttct0175]tcctcatggcteccctttgttcctcttcac0176]acaagttettttctttttgt0177]〈210>80178]〈211>3790179]〈212>DNA0180]〈213〉亚麻0181]〈220〉0182]〈221〉TTC重复0183]〈222〉(136).(168)0184]〈400>80185]朋teggttgtctgtttctctategtctcte0186]gac朋c朋gcgagagcactctecagagttc0187]gtcttggtctctetcttcttcttcttcttc0188]ttcttcttcttcttcttcttcttcttcttc0189]ttcttcttcttcttcttcttcttctcagtg0190]tgagtttggc3gC3Cg3Cgtgctgttccte0191]gg卿gg3Cgaatctetct0192]〈210>9tttgcaacgtcaateccgccgttegttetg60teaccccatttcteccatctccttcattct120cttcttcttcttcatttccgccgccgcccc180tttcatcagttccgctgttgtttettgagg240atccctttctgtt283gtegtgccgttgggtttgag60cacatgctcgcacatgtecactttcttctt120tcttcttcttcttcttcttcttcttcttct180cccaacttggctccttcttettectectec240aggttgecactct283tetettgtggtegttttcattttgtgg皿g60aattcccgteatettctetgttcttcccaa120ttcttcttcttcttcttctttttcttcttc180ttcttcttcttcttcttcttcttcttcttt240agtcttgteaggtccaactcaggegteatt300tcattgtetccttegagategatgettcat360379[0193]〈211>333〈212>DNA〈213〉亚麻〈220〉〈221〉重复〈222〉(248).(295)〈400>93gtgCCC3朋3CCg朋tCg3ctcaateaccacgtcaacatccttttgtgt60ccaactcttegcaccatgttcacateactctgcaaccattaggatcctcttgactcctgt120agtcatcagtCC3朋tgtg3cgtggggg皿tetegc皿tetgcaccatcgcggctetcca180朋c朋ggcactgcgtgcacatttgcgtgattetctgcttcgtcatgaacgacatcgttgt240gtttctcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttcttctttga300tctctttgctcagaacctgccat333〈210>10〈211>340〈212>DNA〈213〉亚麻〈220〉〈221〉TTC重复〈222〉(79).(106)〈400>10郷ggtttgtctctgccgccte皿gctgatgcgtttcagtctcttttgtg60ttttctcgttccttcgctcttcttcttcttcttcttcttcttcttctttttttttctcgg120atetttgteatttgtecaacteggatea皿ttgtcttgca皿3g皿gg3gCCtg3C皿3g180caccggagatgg皿gtcagctggattg皿gcctctgattctgtttcccgtcgtttccagt240tcgaacccgacggttecctttctgtgagtgttctetctttatttcccttgtcatcttttg300tcctgttcatttcccgtcgattgcgcaatt340〈210>11〈211>345〈212>DNA〈213〉亚麻〈400>11atggcaggttctgctgtttcgttegca皿gag皿g皿g皿g皿g皿g皿g60朋g朋g朋gaag皿g皿g皿g皿g皿g皿g皿g皿g皿gag皿3C3c皿cgatgtcgttc120atgacg朋gcagateatcacgca皿tgtgcacgcagtgccttgtttggatagccgcgatg180gtgcatettgctetettcccccacgtcacatttggactgatgactecaggagtc皿gagg240atccteatggttgcagagttatgtg^catggtgcte卿300gacgtggttettgagtettttggactcgattcggttttgggtect345〈210>12[0232]〈211>351〈212>DNA〈213〉亚麻〈220〉〈221〉TTC重:复〈222〉(106),..(120)〈400>12attggagggtggtggCgg3g皿3ggC3gtg朋ggg郷tggtggg雄gg皿CgC3C3tgctcttcttcttcttcategcctttgttcctactegttetttttctctggcttgcttttctttggagtettatetegtectatetetgg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