专利名称:细菌性阴道病联合检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外诊断用检测试剂，尤其涉及一种细菌性阴道病联合检测试剂， 通过该检测试剂可以评价阴道微生态环境、清洁度及细菌性阴道病的致病状况。
背景技术：
细菌性阴道病(Bactarial Vaginosis,简称BV)是育龄妇女最常见的阴道感染性疾病， 国内报道在健康妇女中，BV患病率为18.9%，在妇科门诊有异常阴道分泌物的患者中 为43.3%，在性乱人群中为36.7%，在孕妇患病率为12.5%，它是由于阴道正常菌群(含 乳酸杆菌)被阴道加德纳菌、厌氧菌、人型支原体构成的混合菌群所取代，造成菌群失 调而引起的疾病。虽然它不属于国内监测的性病，值得注意是它在性病高危人群更为多 见，可增加艾滋病、淋病、非淋菌性尿道炎等性病的易感性，。BV的主要表现为阴道分 泌物增多伴有恶臭，并引起宫颈、子宫体感染及盆腔炎症性疾病(PID)的危险。由于 40~50%的BV患者无任何症状，所以BV的诊断不能仅根据临床表现，而是要进行实验 室检测。如何及时地发现BV病毒人并及早地采取相应的治疗措施是诊治BV的关键所 在。
细菌性阴道病常见的诊断手段有传统的细菌学检测、Amsel诊断方法、ELISA(酶联 接免疫吸附剂测定)方法、聚合酶链式反应法及酶化学反应法等方法。由于细菌学检査 操作比较麻烦，已很少使用。Amsd诊断方法是国际公认的诊断BV的金标准，即在下 列四项中有三项阳性表现则可诊断为BV:第一，阴道pl^4.5;第二，胺试验阳性；第 三，涂片中找到线索细胞；第四，阴道分泌物变稀有异臭。PH测定用试纸法测定，人 为判断误差比较大，胺试验的测定因人而异，可靠性与近期是否有性交行为有关，而且， 测定过程中味道比较难闻，影响工作人员的工作态度，因此，目前国内较少推广使用。 根据Amsel诊断方法也延伸了一些改进的诊断试剂，如专利号为ZL200420111847.9的 中国实用新型专利《细菌性阴道炎快速诊断试剂盒》(授权公告号CN2760549Y)，将各 种试剂和检测物件统一设于试剂盒中，以方便快速使用；又如申请号为200510022508.2 的中国发明申请公开《白带pH、胺试验联合检测试剂》(公开号CN1793865A)，该申 请对采用pH试剂检测pH值，并对胺检测试剂作了改进。
酶活性方面的检测方法依据BV与阴道中特有的微生物的代谢产物有关，通过检测 阴道中特有的微生物的代谢产物而达到诊断阴道病变情况的原理，然而单项酶活性测定
3诊断BV的特异性较差，可靠性不高。
为此，检测方便、快捷且可靠的细菌性阴道病联合检测试剂慢慢得到应用，常见的 有唾液酸苷酶与白细胞酯酶组合、唾液酸苷酶与三甲胺组合、唾液酸苷酶与过氧化氢的 组合等。公开的文献如申请号为200610056827.X的中国发明申请公开《细菌性阴道病 联合测定试剂盒》(公开号CN1850985A)，该申请中采用过氧化氢试剂、白细胞酯酶试 剂和唾液酸苷酶试剂组合，克服了传统单一手段诊断阴道病的不客观、不科学及不准确 的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而另外提供一种检测方便、快捷 且可靠佳的细菌性阴道病联合检测试剂。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 一种细菌性阴道病联合检测试剂， 包括过氧化氢反应垫泡液、唾液酸苷酶反应垫泡液、白细胞酯酶反应垫泡液和pH反应 垫泡液，其特征在于
所述的氧化氢反应垫泡液包括如下组分及配比0. l~0.5mM的氯化亚铁、0. l~0.5mM 的淀粉、10~50mg/L的2-羟基-3,5-二氯苯磺酸钠盐、300~500U酶活力/L辣根过氧化物 酶、体积百分比为0.01%的2-硫基乙醇，缓冲系统为0.1MPB液，该PB液pH为4 5;
所述的唾液酸苷酶反应垫泡液包括如下组分及配比O.l-l.OmM的5'-溴-2'-氯-刚 哚-3，-氧唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神经氨酸或百里酚酞乙酰基神经氨 酸、0.1~lmg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1~lmg/ml的葡萄糖，缓 冲系统为0.1M的PB液，该PB液pH为5 6;
所述的白细胞酯酶反应垫泡液包括如下组分及配比0.5~1.5mM的l-乙酰基-5-溴 -4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.2 1.0mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.3~1.5mg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1~lmg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的 PB液，该PB液pH为6^7，
所述的pH反应垫泡液采用0.02M的氢氧化纳溶液溶配成质量百分比0.1°/^0.5%溴 甲酚绿。
进一步，还包括稀释液，该稀释液采用0.01lVM).lMpH6.9PIPES缓冲液。 作为优选，所述的唾液酸苷酶反应垫泡液所使用的指示剂为0.01M 0.05M氢氧化钠。
所述的各反应垫的载体可以采用Whatman3MM玻璃纤维滤纸、Whatman玻璃纤维 滤纸、GF/AWhatman的纤维滤纸Grade3、定量滤纸中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的优点在于可同时测定多组数据，分别反映微生态环境、 致病菌和分泌物状况，测定更加全面可靠，同时，操作简单快速，无需使用仪器设备，成本较低。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例本实施例中的细菌性阴道病联合检测试剂放在一个试剂盒内，具体包括过 氧化氢反应垫泡液、唾液酸苷酶反应垫泡液、白细胞酯酶反应垫泡液、pH反应垫泡液、 稀释液和指示剂。
氧化氢反应垫泡液包括如下组分及配比0.1~0.5mM的氯化亚铁、0.1~0.5mM的淀 粉、10 50mg/L的2-羟基-3，5-二氯苯磺酸钠盐、300-500U酶活力/L辣根过氧化物酶、 体积百分比为0.01%的2-硫基乙醇，缓冲系统为0.1MPB液，该PB液pH为4 5;
唾液酸苷酶反应垫泡液包括如下组分及配比O.l-l.OmM的5'-溴-2'-氯-H引哚-3'-氧 唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神经氨酸或百里酚酞乙酰基神经氨酸、 0.1~lmg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1~lmg/ml的葡萄糖，缓冲系 统为0.1M的PB液，该PB液pH为5 6;
白细胞酯酶反应垫泡液包括如下组分及配比0.5~1.5mM的l-乙酰基-5-溴-4-氯吲 哚-3-乙酸酯、0.2 1.0mM的乙酸-5-溴4-氯-3-哼l哚氧基酯、0.3~1.5mg/ml的3-(N-对甲苯 磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1~lmg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的PB液， 该PB液pH为^7，
pH反应垫泡液采用0.02M的氢氧化纳溶液溶配成质量百分比0.1%~0.5%溴甲酚绿。
稀释液采用0.01M 0.1MpH6.9PIPES缓冲液。
唾液酸苷酶反应垫泡液所用使用的指示剂为0.01M 0.05M氢氧化钠。 优选配比如下
氧化氢反应垫泡液包括如下组分及配比0.3mM(毫摩尔每升)的氯化亚铁、0.3mM 的淀粉,30mg/L的2-羟基-3，5-二氯苯磺酸钠盐、400U酶活力/L辣根过氧化物酶、体积 百分比为0.01%的2-硫基乙醇，缓冲系统为0.1M PB液，该PB液pH为4.5;
唾液酸苷酶反应垫泡液包括如下组分及配比0.5mM的5'-溴-2'-氯-喷哚-3'-氧唾液 酸苷或5-溴4-氯-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神经氨酸或百里酚酞乙酰基神经氨酸、0.5mg/ml 的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.5mg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的 PB液，该PB液pH为5.5;
白细胞酯酶反应垫泡液包括如下组分及配比lmM的1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.6mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.9mg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙 氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.5mg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的PB液，该PB液pH 为6.5，pH反应垫泡液采用0.02M的氢氧化纳溶液溶配成质量百分比0.3%溴甲酚绿。
稀释液采用0.05M pH 6.9PIPES缓冲液。
唾液酸苷酶反应垫泡液所用使用的指示剂为0.03M氢氧化钠。
各反应垫的载体可以采用Whatman3MM玻璃纤维滤纸、Whatman玻璃纤维滤纸、 GF/A Whatman的纤维滤纸Grade3和普通定量滤纸。
取阴道分泌物进行检测，直接通过颜色变化判断患病情况。阴道病联合检测 试条包含有过氧化氢H202、唾液酸苷酶NAcase、白细胞酯酶LE和pH底物的反应垫， 当标本中H202、唾液酸苷酶NAcase、白细胞酯酶LE达到一定浓度、pH值大于4.5时， 会与各自底物发生化学或者水解反应，而使过氧化氢11202反应垫由无色变为红色或者 紫红色，唾液酸苷酶NAcase反应垫由无色变为红色、紫红色或蓝色，白细胞酯酶LE 反应垫由无色变为蓝绿色、蓝色或深蓝色，pH反应垫由浅蓝色变为蓝色或深蓝色。当 没有11202、唾液酸苷酶NAcase、白细胞酯酶LE或者未达到一定浓度，与底物接触不 发生以上化学或者水解反应而保持原来的颜色，pH值小于4.5时(正常)反应垫变为黄色。
操作过程如下
① 将试剂盒从4 3(TC取出，平衡到室温开始使用；
② 撕掉铝箔包装，取出反应装置并轻轻揭掉铝箔条，将反应装置避光放置，并在当 天使用完毕；
③ 用棉签于阴道后穹窿处旋转10 20秒，以清晰见到棉签上有分泌物附着为准，先 在反应装置标识有pH的反应盲孔中点印一下，立刻观察结果，然后加40(Hil稀释液反 复挤压棉签，使样品释出；
④ 在反应装置的其他三个孔中每孔滴加一滴处理过的样品，约35inl，以没过反应孔 1/2为宜，之后在"唾液酸苷酶"反应中滴另一滴"显色液"；
⑤ 将反应装置放在室温静置，过氧化氢H202、唾液酸苷酶NAcase、白细胞酯酶LE 等指标在5~30min内判读结果，pH值在l~5sec内判读结果；
A) 过氧化氢反应孔呈红色、紫色为阴性；显无色为阳性。
B) 唾液酸苷酶反应孔不显色为阴性；显红色、红紫色或蓝色为阳性，显蓝色表示 唾液酸酶活性浓度很高。
C) 白细胞酯酶反应孔不显色为阴性。蓝绿色为"+"、蓝色为"++"、深蓝色为
"III"
D) pH反应孔显黄色为阴性，蓝色为阳性。
6
权利要求
1、一种细菌性阴道病联合检测试剂，包括过氧化氢反应垫泡液、唾液酸苷酶反应垫泡液、白细胞酯酶反应垫泡液和pH反应垫泡液，其特征在于所述的氧化氢反应垫泡液包括如下组分及配比0.1～0.5mM的氯化亚铁、0.1～0.5mM的淀粉、10～50mg/L的2-羟基-3，5-二氯苯磺酸钠盐、300～500U酶活力/L辣根过氧化物酶、体积百分比为0.01％的2-硫基乙醇，缓冲系统为0.1M PB液，该PB液pH为4～5；所述的唾液酸苷酶反应垫泡液包括如下组分及配比0.1～1.0mM的5’-溴-2’-氯-吲哚-3’-氧唾液酸苷或5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸或百里酚酞乙酰基神经氨酸、0.1～1mg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-吲哚、0.1～1mg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的PB液，该PB液pH为5～6；所述的白细胞酯酶反应垫泡液包括如下组分及配比0.5～1.5mM的1-乙酰基-5-溴-4-氯吲哚-3-乙酸酯、0.2～1.0mM的乙酸-5-溴-4-氯-3-吲哚氧基酯、0.3～1.5mg/ml的3-(N-对甲苯磺酰基-L-丙氨酰氧基)-5-苯基吡咯、0.1～1mg/ml的葡萄糖，缓冲系统为0.1M的PB液，该PB液pH为6～7，所述的pH反应垫泡液采用0.02M的氢氧化纳溶液溶配成质量百分比0.1％～0.5％溴甲酚绿。
2、 根据权利要求
1所述的细菌性阴道病联合检测试剂，其特征在于还包括稀释液， 该稀释液采用0.01M~0.1M pH 6.9PIPES缓冲液。
3、 根据权利要求
l所述的细菌性阴道病联合检测试剂，其特征在于所述的唾液酸 苷酶反应垫泡液所用使用的指示剂为0.01M 0.05M氢氧化钠。
4、 根据权利要求
1所述的细菌性阴道病联合检测试剂，其特征在于所述的各反应 垫的载体至少采用Whatman3MM玻璃纤维滤纸、Whatman玻璃纤维滤纸、GF/A Whatman 的纤维滤纸Grade3、定量滤纸中的至少一种。
专利摘要
一种细菌性阴道病联合检测试剂，包括过氧化氢反应垫泡液、唾液酸苷酶反应垫泡液、白细胞酯酶反应垫泡液和pH反应垫泡液，与现有技术相比，本发明的优点在于可同时测定多组数据，分别反映微生态环境、致病菌和分泌物状况，测定更加全面可靠，同时，操作简单快速，无需使用仪器设备，成本较低。
文档编号C12Q1/28GKCN101487041SQ200910037435
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月26日
发明者陈文武 申请人:广州鸿琪光学仪器科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan