一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用的制作方法

专利名称:一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，具体涉及一株高产不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸菌 株，以及获得该菌株的诱变筛选方法和该菌株的应用。
背景技术：
DHA (Docosahexaenoic acid, 22 :6Δ4· 7. 10. 13. 16. 19，全名二十二碳六烯酸)是 一种重要的长链多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，简称PUFA)，属于ω-3系 列。DHA作为细胞膜合成的必要成分，具有增强视力、促进脑细胞发育等作用，是婴幼儿大脑 生长发育和成年人大脑正常功能维持的必要成分，被誉为“脑黄金”。DHA也可以降血脂、预 防和治疗动脉硬化、抗炎、抗癌等作用。因而，DHA受到了食品界和医疗界的广泛关注。
传统鱼油来源的DHA，难以满足人们对高品质保健品的要求以及不断增长的市 场需求。1968年，Harrington，GW等发现异养培养Crypthecodinium cohnii (早期称 Gyrodinium cohnii)可得到较高产量的DHA，且脂肪酸组成较为单一，总脂含量达20%，其 中DHA占30 50%，其他不饱和脂肪酸百分率小于1%，是DHA高效的生产菌之一。1994 年，Yano等人自深海鱼肠分离得到5株细菌Vibrio sp.产生DHA，其中有一株6天内能 产生0. 8mg/L的DHA ；1998年，王黎等从鲐鱼和鲭鱼肠道中分离出8株富含多不饱和脂肪 酸的革兰氏阴性菌，其中一株WL1021的DHA含量较高；戴传超等筛选出一株产DHA的头 孢霉属丝状真菌，菌丝含油脂21. 23%, DHA占总脂肪酸的2. 51% ；Bajpai等发现破囊弧 菌Thraustochytrium arueum ATCC34304总脂肪酸中50 %均为DHA，在含2. 5 %淀粉的培 养基上培养其DHA产量达到511mg/L ；Iida等对培养基进行了优化后细胞产量达到5. 7g/ L ；Lizuyi等则发现Tharustochrtuim arueumATCC28201在培养基中有更分散的形态，在 初步优化培养基条件后，ATCC28210最高DHA产量达到850mg/L。Singh等对发酵培养基 和条件进行优化后，结果ATCC28210的5d培养生物量和DHA产量达到10. 4g/L和1. Ollg/ L ；Vazhappilly等研究了 20株微藻在三角瓶中光自养生产DHA的潜能，DHA含量最高的 是隐甲藻 Crypthecodiniumcohnii (19. 9% )，然后是 Amphidinium carterax (17. O % )和 Thraustochytrium aureum(16. 1%)0张秋会等为了筛选高产DHA藻株，对8种海洋微藻进 行培养，通过气相色谱测定DHA高产株等鞭金藻，其DHA产量为3. 2mg/L ；赵玉巧等以海水 中分离得到产DHA的酒香酵母为出发菌株，对其进行诱变处理，选择吸光值相对较高的菌 株，采用有机溶剂萃取法测定油脂含量，其中得到一株菌油脂含量达50.4%。
近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。目前国内 已公开有三篇涉及微藻发酵生产长链多不饱和脂肪酸DHA方法的专利(公开号分别为 CN1101034A、CN1264967C、CN1986822)，其中CN1264967C以裂殖弧菌为研究对象，生物量 14 25g/L，DHA占菌体含量18 35% ；CN1101034A以隐甲藻为生产菌，生物量只有48g/L ；前两篇专利产量均较低，无技术优势。CN1986822为2007年刚公开的专利，公开了一 种隐甲藻发酵产DHA的培养方法，生物量20 40g/L，海藻细胞含油量20 50%，但较国 外发酵水平仍有较大差距，主要原因与所选菌种、发酵工艺有关，难以抵抗国外先进技术带来的竞争压力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一株高产二十二碳六烯酸的生产菌株。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述菌株的诱变筛选方法，该方法是一种 基于微生物代谢途径分析的全新的理性筛选技术。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述生产菌株在制备生产二十二碳六烯酸 中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
本发明通过诱变筛选获得一株高产DHA的海洋微藻为HX-308，其分类命名为隐甲 藻(Crypthecodinium cohnii)。
目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址武汉 武汉大学；邮编=430072 ；登记入册的编号=CCTCC NO =M 208246 ；保藏日期:2008年12月8 日。以此菌作为生产菌株。
CCTCC NO =M 208246菌株具有下述特征
(1)菌落形态
将菌种稀释涂布在固体培养基上，20 25°C培养，菌落呈乳白色，边界光滑圆润。
(2)菌体形态
将菌种至光学显微镜下观察，球状单细胞，直径5-18 μ m，有鞭毛。
(3)底物
可以利用葡萄糖作为底物。
⑷代谢
主要代谢产物为不饱和脂肪酸，包括DHA、EPA等。该菌株在20°C 30°C均能生 长，25°C 28°C为最适生长温度，DHA积累最适温度为25°C ；菌体适合在中性pH培养液中 生长，发酵过程中pH基本恒定，在5 8之间。
上述DHA高产菌隐甲藻CCTCC NO =M 208246的诱变筛选方法包括如下步骤
(1)种子的培养；
(2)种子液的预处理；
(3)对步骤⑵得到的种子处理液进行诱变；
(4)筛选
(4a)初筛初筛平板采用添加了红四氮唑染色剂(TCC)的固体培养基，2030°C，培养2 5天，挑出生长速率较快、被红四氮唑染色剂染色较深、较大的菌落，保证筛 选出的菌株具有高的生长活力和高的脂肪酸积累效率，以待复筛；
(4b)复筛复筛平板采用添加了菌种EMP途径抑制剂或呼吸抑制剂的固体培养 基，将初筛得到的菌株接种于复筛平板中，20 30°C，培养2 5天，挑选出生长速率较快、 较大的菌落；由于复筛平板中添加了菌种EMP途径抑制剂，因而能够存活下来的菌种的菌 体NADPH积累较出发菌株强，对脂肪酸的积累具有积极的作用；
(4c)再筛将复筛得到的菌株转接到种子培养基中进行传代培养，分别进行摇瓶 发酵，20 30°C，培养2 5天，以摇瓶发酵后的脂肪酸含量和二十二碳六烯酸含量为筛选指标，获得二十二碳六烯酸的高产菌株。
步骤(1)中，种子的培养方法为将具有二十二碳六烯酸产生能力的微生物接种 于种子培养基中，接种量为0. 2 2% (v/v), 20 30°C培养20 50小时，待种子生长至 对数期。其中，所述的种子培养基包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素，其中碳源为葡萄 糖，氮源为酵母膏，无机盐离子为钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的任意一种或多种，微 量元素为Mn2+、Co2/ Mn042/ Ni2+和Fe2+中的任意一种或多种。
步骤(2)中，种子液的预处理方法为将步骤(1)得到的种子液，用20 40g/L的 人工海水、或pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液稀释，接于已经灭菌处理过的平铺有玻璃珠的三角 瓶中，室温下振荡处理2 lOmin，使藻体细胞分散，用灭过菌的2 8层纱布、或脱脂棉、或 1 3层擦镜纸过滤，即得种子处理液。
步骤(3)中，所述的诱变方法为紫外诱变、化学诱变和紫外化学复合诱变中的任 意一种或几种。
所述的紫外诱变方法为将步骤(2)得到的种子处理液，均勻涂布于空白的无菌 平板上，保证菌液厚度为1 3mm，黑暗条件下进行紫外诱变。诱变条件紫外灯20 30W， 照射距离20 35cm，照射时间为1 30min。最后红灯条件下，取出平板，用20 40g/L 的人工海水、或pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液稀释后进行平板涂布。
所述的化学诱变方法为将步骤(2)得到的种子处理液与化学诱变剂混合，2030°C、150 200rpm下，振荡处理10 40min，然后离心机中5000 12000rpm转速下离心 3 15min，弃上清液，用20 40g/L的人工海水、或pH =7.4的磷酸盐缓冲液重悬洗涤细 胞，离心弃上清，重复重悬和离心操作2 5次，最后用20 40g/L的人工海水、或pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液稀释后平板涂布。所述的化学诱变剂为亚硝基胍(NTG)或甲基磺酸乙 酯(EMS)。化学诱变剂先经丙酮及20 40g/L的人工海水、或pH =7.4磷酸盐缓冲液溶解 配成溶液，使得浓度为0. 001 0. 05g/mL,再用0. 22 y m或0. 44 y m无菌滤膜过滤，化学诱 变剂溶液与种子处理液的用量体积比为15 9。
所述的紫外化学复合诱变为将步骤(2)得到的种子处理液先进行紫外诱变在进 行化学诱变，或者，先进行化学诱变再进行紫外诱变。紫外诱变的方法以及化学诱变的方法 如前所述。
步骤(4a)中，固体培养基中红四氮唑染色剂的加入量为0. 5 2%0 (v/v)。
步骤(4b)中，所述的EMP途径抑制剂为碘乙酸或碘乙酸钠，所述的呼吸抑制剂为 丙二酸，固体培养基中EMP途径抑制剂或呼吸抑制剂的加入量为0. 02 0. 08g/L。其中碘 乙酸、碘乙酸钠或丙二酸等的预处理方法为去离子水溶解后再利用0. 22 y m或0. 44 y m无 菌滤膜过滤，避光保存。
本发明诱变筛选方法的创新之处在于，筛选剂的选择是通过对微生物代谢途径分 析后，确定制约脂肪酸合成的关键点为还原力NADPH和前体物质乙酰辅酶A的足量供应。 本发明重点分析的途径包括微生物糖酵解途径、三羧酸转运体系、脂肪酸合成途径等，发现 在糖酵解途径中、TCA循环及柠檬酸裂解途径中可以利用碘乙酸、碘乙酸钠及丙二酸对部分 关键酶的抑制，增加还原力及前体物质的供应。本发明的诱变筛选方法适用于海洋隐甲藻 (Crypthecdodinium)、裂殖弧菌属(Schizochytrium)、破囊弧菌属(Thraustochytrium)、 被孢霉(Mortierella)等一系列脂肪酸生产菌的微生物选育工作。[0037]上述二十二碳六烯酸生产菌株在发酵生产二十二碳六烯酸中的应用。具体生产方法为将发酵培养基在115 121°C的高温下灭菌15 35min，冷却后备用，将菌株 CCTCCNO :M 208246按5 30% (v/v)的接种量接种于发酵培养基中(菌株CCTCC NO :M 208246先进行种子培养)，20 30°C，培养3 5天。所述的发酵培养基为pH5. 0 8. 0 的能提供碳源、碳源、无机盐及微量元素的液体培养基。
本发明所用的培养基优选配方如下
种子培养基葡萄糖，20 60g/L ；酵母膏，0. 55g/L ；KH2P04,110g/L ；NaCl, 1040g/L ；MgS04 7H20，220g/L ；KC1，022g/L ；FeS04，0. 0010. 01g/L。
固体培养基葡萄糖，20 60g/L ；酵母膏，0. 55g/L ；KH2P04,110g/L ；NaCl, 1040g/L ；MgS04.7H20，220g/L ；KC1，0. 22g/L ；FeS04，0. 0010. 01g/L ；琼脂，20 40g/L。
发酵培养基葡萄糖，15 50g/L ；酵母膏，0. 55g/L ；KH2P04,110gL ；NaCl, 1040g/L ；MgS04.7H20，220g/L ；KC1，0. 22g/L ；CaCl2，0. 020. 5g/L ；NaHC03，0. 1 2g/L ；FeS04,0 . 0010. 01g/L ；谷氨酸钠，550g/L。
有益效果本发明筛选出的一株DHA高产菌隐甲藻Crypthecdodinium cohnii HX-308 (CCTCC NO :M 208246)，该菌株生长活力旺盛、耗糖速率快、产油率高、DHA含量高达 出发菌株的1.53倍、生理生化稳定、具有稳定的遗传性能，同时本发明的菌种经液体培养 发酵可生产不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸含量达到20. 4g/L，其中DHA的含量达到8. 16g/L， 是生产天然DHA的优良藻株，具备优异的工业化生产前景。本发明还提供了一种全新的诱 变筛选方法，是从代谢途径分析出发的，通过这种筛选方法，可以实现菌种筛选的高通量， 节约筛选成本，提高工作效率，目的性明确。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求
书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的培养基配方如下
种子培养基葡萄糖，40g/L;酵母膏，2g/L;KH2P04，4g/L;NaCl，25g/L; MgS04 7H20,10g/L ；KC1, lg/L ；FeS04，0. 003g/L。
固体培养基葡萄糖，40g/L;酵母 ,2g/L ；KH2P04,4g/L ；NaCl,25g/L ； MgS04 7H20，10g/L ；KC1, lg/L ；FeS04,0 . 00 3g/L ；琼脂，20g/L。
发酵培养基葡萄糖，40g/L；酵母膏，4g/L ；KH2P04，4g/L ；NaCl, 12. 5g/L ； MgS04 7H20，5g/L ；KC1，0. 5g/L ；CaCl2，0. lg/L ；NaHC03，0. 5g/L ；FeS04，0. 003g/L ；谷氨酸 钠，40g/L。
实施例1 种子的培养。
将具有二十二碳六烯酸产生能力的隐甲藻(ATCC 30772)接种于种子培养基中， 接种量为(v/v)，25°C条件下培养三代，取培养40h的第三代菌液。
实施例2 种子液的预处理。
将实施例1得到的菌液lmL，用9mL浓度为30g/L的无菌人工海水稀释，接于已经灭菌处理过的平铺有玻璃珠的三角瓶中，室温下振荡处理5min，使藻体细胞分散，用灭过菌 的6层纱布过滤，梯度稀释，计数，至细胞浓度为1. 5 X 104个/mL。
实施例3 紫外诱变
将实施例2得到的菌液涂布在无菌平板上，保证菌液厚度约2 3mm，距30W紫外 灯30cm处分别进行诱变l、3、5、9、15min，得到5株待筛选菌株。
实施例4 化学诱变
将实施例2得到的菌液0.9mL以体积比91的比例与化学诱变剂NTG母液混 合处理，其中NTG母液的配置方法为分别取0.01g、0.015g、0. 02gNTG溶于0. lmL丙酮以 及0.9mL 30g/L的无菌人工海水中，无菌滤膜过滤。每个NTG梯度的处理样品处理20min、 30min、40min，通过3次重悬和离心终止诱变反应，得到9株待筛选菌株。
实施例5 紫外化学复合诱变。
将实施例4得到的经化学诱变的菌株，分别涂布在无菌平板上，再在距30W紫外灯 30cm处分别进行诱变l、3、5、9、15min，得到45株待筛选菌株。
实施例6 筛选。
a，将实施例3得到的菌株，黑暗条件下用30g/L的无菌人工盐水梯度稀释，涂布在 添加了 1%。(v/v)TCC的固体培养基中，培养2天后，挑取50株长势较好且被TCC染色较深 的菌株，以待复筛。
b，将通过初筛的50株菌株转至添加有0.02g/L的碘乙酸的固体培养基中。25°C 条件下平板培养2天，观察平板，挑选25株较早长出且菌落比较大的菌株，分别转接至种子 培养液中，以留备用。
c，将平板筛选获得菌株分别接种至发酵培养基中，发酵3天，待糖耗尽，分别测定 细胞干重、脂肪酸含量以及DHA含量，各指标比较，获得5株DHA产量较高的菌株，分别命名 为 HX-1、HX-2、HX-3、HX-4、HX-5。
采用本实施例的上述a、b、c三步方法处理实施例4得到的菌株，最终获得5株DHA 产量较高的菌株，分别命名为HX-6、HX-7、HX-8、HX_9、HX-10。
采用本实施例的上述a、b、c三步方法处理实施例5得到的菌株，最终获得5株DHA 产量较高的菌株，分别命名为HX-302、HX-304、HX-306、HX-308、HX-310。
实施例7 菌株遗传稳定性考察。
实施例6所获得的15株DHA产量较高的菌株进行遗传稳定性考察。将每个菌株 连续传10代，每代均接入发酵培养基发酵，发酵培养条件20 30°C、150 170rpm培养 3天，残糖降至5g/L左右时结束发酵，菌株显示稳定的发酵性能。其中产量较高、稳定性最 好的菌株为HX-308。初糖浓度为120g/L条件下，生物量可稳定在35g/L左右，油脂总含量 在20. 4g/L左右，DHA占总油脂的35 40%，DHA的含量在8. 16g/L左右。
实施例8 菌株改造前后发酵性能比较。
将菌株HX-308进行实验室250mL摇瓶培养。初始糖浓度120g/L，发酵3天。对比 诱变前后发酵结果，见表1
表1菌株诱变前后发酵结果对比
权利要求
一种二十二碳六烯酸生产菌株，其分类命名为隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NOM 208246。
2.权利要求
1所述的二十二碳六烯酸生产菌株在发酵生产二十二碳六烯酸中的应用。
3.根据权利要求
2所述的应用，其特征在于将菌株CCTCCNO :M 208246按5 30% (v/v)的接种量接种于发酵培养基中，20 30°C，培养3 5天。
4.根据权利要求
3所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基为pH5.0 8. 0的能提 供碳源、无机盐及微量元素的液体培养基，发酵培养基包含如下组分葡萄糖，15 50g/L ； 酵母膏，0. 55g/L ；KH2P04,110g/L ；NaCl, 1040g/L ；MgS04 7H20，220g/L ；KC1, 0. 22g/L ；CaCl2，0. 020. 5g/L ；NaHC03，0. 12g/L ；FeS04，0. 0010. 01g/L ；谷氨酸 钠，550g/L。
专利摘要
本发明公开了一种二十二碳六烯酸产生菌及其诱变筛选的方法和其应用。该诱变筛选方法是基于代谢途径分析的菌种理性选育技术。该菌株分类命名为隐甲藻Crypthecodinium cohnii HX-308，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M208246。该菌株是通过紫外化学诱变筛选获得的DHA高产菌。该菌株DHA含量高达出发菌株的1.53倍、生理生化稳定、具有稳定的遗传性能，同时本发明的菌种经液体培养发酵可生产多不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸含量达到20.4g/L，其中DHA的含量达到8.16g/L，是生产天然DHA的优良藻株，具备优异的工业化生产前景。
文档编号C12N15/01GKCN101591617 B发布类型授权 专利申请号CN 200910033493
公开日2011年3月23日 申请日期2009年6月15日
发明者任路静, 朱婧瑶, 练敏, 肖爱华, 金立晶, 黄和 申请人:南京工业大学专利引用 (3), 非专利引用 (1),