专利名称：:亚麻微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种亚麻微卫星DNA标记，适用于亚麻品种分类、遗传关系鉴定和辅助育种。技术背景微卫星(Microsatellite)，又称为简单序歹隨复(simplesequencer印eat，SSR)或短串联重复(shorttandemr印eat，STR)，是以少数几个核苷酸(1一6个)为重复单位的串联重复DNA序列。由于微卫星具有高水平的杂合性和突变率、双亲遗传模式等优势，加之便于检测，费用低廉，因此广泛用于遗传图谱构建、基因定位、标记辅助育种、家系分析、品种鉴定以及进化分析等研究。如用微卫星标记研究樱桃品种间的亲缘关系(艾呈祥等，2007，果树学报，24(4):460465)、用微卫星DNA标记进行猪品种分类的专利申请"适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记"(公开号CN1370834A)。亚麻(LinumusitatissmumL.)是亚麻禾斗(Linaceae)亚麻属(Linum)的一年生草本纤维植物，已经有六七千年的栽培历史。亚麻既是世界第3大纤维作物，又是5大油料作物之一。作为一种重要的经济作物，亚麻在微卫星分子标记方面的研究远远滞后于其他作物，大豆、棉花、水稻、葡萄、花生的SSR标记已有许多研究，并公开发表了大量可以直接利用引物序列，而现有亚麻的微卫星标记数量非常有限，仅有法国科学家Roose-Amsaleg等分离的28个微卫星标记(Roose-AmsalegC等，2006，MolecularEcologyNotes,6(3):796本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立亚麻的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行品种分类，遗传关系分析和辅助育种。实现上述发明目的的技术方案包括亚麻(CT)和(GT)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到17个含有(CT)和8个含有(GT)的微卫星克隆，确定了25个多态性丰富的微卫星标记LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LUIO、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、L脂、LU19、LU20、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25;LU1为214个核苷酸、LU2为265个核苷酸、LU3为328个核苷酸、LU4为250个核苷酸、LU5为173个核苷酸、LU6为202个核苷酸、LU7为363个核苷酸、LU8为199个核苷酸、LU9为206个核苷酸、LU10为270个核苷酸、LU11为511个核苷酸、LU12为196个核苷酸、LU13为302个核苷酸、LU14为196个核苷酸、LU15为393个核苷酸、LU16为314个核苷酸、LU17为369个核苷酸、LU18为394个核苷酸、LU19为356个核苷酸、LU20为305个核苷酸、LU21为462个核苷酸、LU22为249个核苷酸、LU23为308个核苷酸、LU24为258个核苷酸、LU25为616个核苷酸。图1是用LU1位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图2是用LU2位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图3是用LU3位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图4是用LU4位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图5是用LU5位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图6是用LU6位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图7是用LU7位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图8是用LU8位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图9是用LU9位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图10是用LU10位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图11是用LU11位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图12是用LU12位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图13是用LU13位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图14是用LU14位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图15是用LU15位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图16是用LU16位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图17是用LU17位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图18是用LU18位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图19是用LU19位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图20是用LU20位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图21是用LU21位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图22是用LU22位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图23是用LU23位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图24是用LU24位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。图25是用LU25位点的特异性引物扩增8个亚麻品种DNA的PAGE电泳图。具体实施方式1、亚麻微卫星富集文库的构建。(l)以亚麻品种白花幼苗为材料，采用改进的CTAB法(参见邓欣等，2007，中国麻业科学，29(4):184188)提取亚麻基因组DNA。用限制性内切酶JfeeI酶切10"g亚麻基因组DNA，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收300-1500bp的DNA片段。(2)将碱基互补的寡核苷酸primerA(5'-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3')和primerB(5'-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3')等摩尔混合，95。C变性5min，6(TC退火1h，形成具有粘性末端的接头。(3)将酶切产物和接头用LDNA连接酶连接。连接产物用酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)抽提一次，离心收集上清液在上清液中加0.3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰乙醇纯化沉淀DNA，加入15UL去离子水溶解。(4)接头连接片段的PCR扩增连接产物以primerA为引物进行PCR扩增。用普通DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN)纯化PCR产物，并将其浓縮至15uL。(5)用生物素标记的探针(CT)15和(GT),5分别与纯化的接头连接DNA片段杂交。具体操作为建立50uL杂交混合液反应体系含5"L探针(IOumolL0,5liLprimerA，15uL20XSSC，10%SDS0.5uL及12.5uLddH20，68'C预热。将15uL连接产物DNA片段于95"C变性5min，再加预热的杂交混合液，于68"C杂交1h。(6)将杂交混合液加入100uL链霉亲和素包被的磁珠(DynalM-280)中，于25。C温育20min。(7)用磁力架吸附磁珠，弃上清。依次用200UL洗液I、洗液I1(3XSSC，0.1%SDS)、洗液III(6XSSC)洗涤磁珠，去除不含微卫星的序列。方法是用洗液I在室温洗2次，每次静置8min;洗液II在68'C洗2次，每次静置15min;洗液III在室温快速洗2次。(8)用O.1XTE200PL在室温快速洗2次，加入O.1XTE50uL，95°C变性10min，小心吸取上清，上清液即含有微卫星序列的单链DNA，以primerA为引物，以单链DNA为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。(9)将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体(大连宝生物)上，然后将连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞(TIANGEN)，转化液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选，得到微卫星基因组文库。2、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计。(1)挑取白色单菌落接种到lmLLB培养液中，于37'C培养过夜。(2)以菌洲为模板，采取PIMA方法(参见Lunt等，MolecularEcology,8:891-894)筛选含有(CT)n和(GT)n微卫星序列的阳性克隆。(3)将阳性克隆测序，分析是否含有(CT)。或(GT)重复序列。(4)根据微卫星重复序列两侧的保守序列设计引物。(5)测序结果采用SSRHunter1.3软件分析序列，并用BioeditSequenceAlignmentEditor软件对所有序列进行比对分析、归类，再用PremierPrimer5.0软件进行引物设计。对高度相似的一类微卫星序列设计特异引物，对进一步筛选的阳性克隆进行第二次PCR扩增，以提高筛选效率。3、利用亚麻微卫星DNA标记分析亚麻品种间的遗传差异。将上述微卫星标记用于8个亚麻品种的分类，确定了25个多态性丰富、适用于亚麻品种分类的微卫星标记LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LU10、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、LU18、LU19、L腦、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25(表l)。具体操作过程如下(1)按邓欣等的方法(参见邓欣等，2007，中国麻业科学，29(4):184188)提取各个亚麻品种的DNA作为模板，进行PCR。(2)分别用LU1、LU2、LU3、LU4、LU5、LU6、LU7、LU8、LU9、LUIO、LUll、LU12、LU13、LU14、LU15、LU16、LU17、LU18、LU19、LU20、LU21、LU22、LU23、LU24、LU25。25个位点的25对引物(引物序列见表l)扩增这8个亚麻品种的醒o(3)将PCR产物在8%的丙烯酰胺凝胶上电泳，让后进行银染并拍照，得到图1-25。(4)结果分析每个一篇的扩增条带按有或无记录，扩增条带存在时赋值为1，否则赋值为1。采用SPSS10.1forwindows统计分析软件中的系统聚类分析程序，距离测量选用相关系数距离法，用类间平均连锁法(Between-groupslinkage)进行聚类分析并建立系统树。由附图1-25可看出，本发明的25个微卫星位点的序列长度在供试的8个品种中都出现多态性，由此可见，本发明的这25个微卫星标记能用于亚麻品种分类和遗传关系分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1中F表示5'端引物，R表示3'端引物。本发明提供了25个亚麻微卫星位点的DNA序列及扩增上述25个亚麻微卫星位点的引物序列和扩增方法，25个亚麻微卫星位点用于亚麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。SEQUENCELISTING<110>中国农业科学院麻类研究所<120>亚麻的DNA分子遗传标记<130>亚麻的DNA分子遗传标记<160>25<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>214<220><221>重复<222>(107)..(165)<400>13C3cttccctclatctctctctattcctctccccctcttcatctctctccccccctctccctcgctcttttcttctctctccccctctctccctcgctctcttctcctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctttctctctctctgcaaccatttgtgtaattagggagaagtcctaatagctcccccttact<210>2<211>265<212>DNA<213>亚麻<220><221>重复<222>(54)..(97)<400>2atgttggcctgtttggttaggttggaattcgctcggtctctctcctt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