制备l-甲硫氨酸前体的微生物和使用该微生物制备l-甲硫氨酸前体的方法

专利名称:制备l-甲硫氨酸前体的微生物和使用该微生物制备l-甲硫氨酸前体的方法
技术领域：
本发明涉及制备L-甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，以及使用该微生物制备L-甲硫氨酸前体的方法。发明背景
甲硫氨酸是人体必需氨基酸之一，广泛用作饲料和食品添加剂，还用作医疗解决方案和医疗用具的合成原料。甲硫氨酸是如胆碱(卵磷脂)和肌酸这类化合物的前体，同时用作半胱氨酸和牛磺酸的合成原料。甲硫氨酸还能提供硫。S-腺甲硫氨酸来源于L-甲硫氨酸且在在人体中提供甲基基团方面起一定作用，并且还参与大脑中多种神经递质的合成。甲硫氨酸和/或S-腺-L-甲硫氨酸(SAM)抑制肝和动脉中的脂肪积聚并且能减轻抑郁、炎症、肝病和肌肉疼痛等等。
到目前为止已知甲硫氨酸和/或S-腺-L-甲硫氨酸在体内的功能如下。
I)它抑制肝和动脉中的脂肪积聚促进脂类代谢，且改善大脑、心脏和肾脏中的血液循环(J Hepatol. Jeon BR 等人，2001 Mar ；34(3) :395-401)。
2)它促进消化、解毒和毒性物质的排出和重金属例如Pb的排出。
3)它可以以800-1，600mg/天的剂量被服用用作抗抑郁药物(Am J Clin Nutr.Mischoulon D 等人，2002 Nov ；76(5) :1158S_61S)。
4)它增强肝功能(FASEB J. Mato JM.，2002 Jan ；16(1) :15-26)并特别对酒精引起的肝脏疾病有效(Cochrane Database Syst Rev. , Rambaldi A. ,2001 ； (4) :CD002235)。
5)它对骨与关节疾病具有抗炎作用且促进关节恢复(ACP J Club. Sander O.,2003Jan-Feb ；138(1) :21，J Fam Pract.，Soeken KL 等人，2002 May ；51 (5) :425-30)。
6)它是头发的必需营养成分。它给头发提供营养从而阻止脱发(AudiolNeurootol. , Lockwood DS 等人，2000Sep_0ct，5(5) :263-266)。
甲硫氨酸可以通过化学或生物学方法合成以应用于饲料、食品和药物中。
在化学合成中，甲硫氨酸主要通过5-(β_甲基巯基乙基)_乙内酰脲的水解来制备。化学合成的甲硫氨酸具有只能制备得到L-型和D-型混合形式的缺点。
在生物学合成中，甲硫氨酸通过使用甲硫氨酸合成中涉及的蛋白质的方法来制备。L-甲硫氨酸是通过在埃希杆菌属中由基因例如metA、metB、metC、metE和metH表达的酶的作用从高丝氨酸中生物合成的。特别是，metA是编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的基因，而高丝氨酸O-琥珀酰转移酶是甲硫氨酸生物合成中所需要的第一个酶，而且它将高丝氨酸转化为O-琥珀酰L-高丝氨酸。O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶或metB基因编码的胱硫醚Y合酶将O-琥珀酰L-高丝氨酸转化为胱硫醚。metC基因编码的胱硫醚β裂解酶将胱硫醚转化为L-高半胱氨酸。MetE编码不依赖钴胺素的甲硫氨酸合酶，且metH编码依赖钴胺素的甲硫氨酸合酶，它们两者都将L-高半胱氨酸转化为L-甲硫氨酸。这时，metF编码的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶和glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶共同作用以合成N (5)-甲基四氢叶酸，提供L-甲硫氨酸合成必需的甲基基团。[0014]L-甲硫氨酸通过上述酶的一连串有机反应来合成。以上蛋白质或影响以上蛋白质的其它蛋白质的遗传修饰可能导致L-甲硫氨酸合成的增加。例如，日本专利特许公开号2000/139471描述了一种使用基因组上缺失thrBC和metj基因，而metBL过表达以及metK被泄漏突变体取代的埃希杆菌属制备L-甲硫氨酸的方法。此外，美国专利公开号US2003/0092026A1描述了一种使用metD(L-甲硫氨酸合成抑制剂)敲除的属于棒状杆菌属的微生物的方法。美国专利公开号US2002/0049305描述了一种通过增加5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达来增加L-甲硫氨酸产生的方法。
生物学方法制备的甲硫氨酸是L-类型的，这是它的优点但是产量非常小。这是因为甲硫氨酸生物合成途径具有非常紧密的反馈调节系统。一旦甲硫氨酸合成至一定水平，最终产物甲硫氨酸就会抑制metA基因的转录，metA基因编码甲硫氨酸生物合成起始的主要蛋白质。metA基因本身的过表达不能增加甲硫氨酸的产生，这是因为metA基因被转录期的甲硫氨酸所抑制然后在翻译期被细胞内蛋白酶降解(Dvora Biran, Eyal Gur, LeoraGollan 和 Eliora Z. Ron ControI of methionine biosynthesis in Escherichia colibyproteolysis Molecular Microbiology (2000) 37 (6)，1436-1443)。因此，许多以前的专利集中在如何使metA基因从其反馈调节系统中解放出来(W0 2005/108561、W01403813)。·
美国专利公开号US2005/0054060A1描述了一种通过改良的胱硫醚合酶(0_琥珀酰高丝氨酸裂解酶)合成高半胱氨酸或甲硫氨酸的方法，这种胱硫醚合酶直接使用甲硫醇(CH3SH)或硫化氢(H2S)而不是半胱氨酸作为硫源。但是，本领域技术人员众所周知胱硫醚合酶在细胞中可以结合多种甲硫氨酸前体，因此产生很高水平的副产物。例如，有报道胱硫醚合酶通过O-琥珀酰高丝氨酸和高半胱氨酸的副反应积聚了高水平的高羊毛硫氨酸(homolanthionin) (J. Bacteriol (2006) vol 188 :p609_618)。所以，胱硫醚合酶的过表达由于其副反应的增加可以降低细胞内反应的效率。此外，此方法具有许多缺点。此方法使用具有副反应和反馈调节系统的细胞内代谢途径。此方法还使用对细胞具有剧烈细胞毒性的H2S或CH3SH。因此甲硫氨酸产量比较小。
为了解决这些问题，本发明者开发了两步法，包含通过大肠杆菌发酵制备L-甲硫氨酸前体的第一步；和通过酶反应(PCT/KR2007/003650)转化L-甲硫氨酸前体为L-甲硫氨酸的第二步。这个两步法可以解决以上问题，例如硫化物的细胞毒性、甲硫氨酸和SAMe的反馈调节、细胞内酶(例如胱硫醚Y合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶)的分解中间产物。此外，与产生D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸混合形式的化学甲硫氨酸合成方法不同的是，此两步法在仅选择性生产L-甲硫氨酸上非常有效。
在此两步法中，甲硫氨酸前体的产量是甲硫氨酸产量增加的关键因素之一。为了增加甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸的合成产量，强天冬氨酸激酶、高丝氨酸转移酶和抗反馈的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的良好组合是十分重要的。在上述背景中，本发明者制备了一种具有以下特征的生产O-琥珀酰高丝氨酸的微生物1)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是引入和增强的，其中高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是抗甲硫氨酸反馈的；和2)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)是增强的。这个菌株能够生产高浓度L-甲硫氨酸前体而与培养基中的甲硫氨酸浓度无关，且L-甲硫氨酸前体的生产可以显著增加。
发明内容
本发明提供了一种制备L-甲硫氨酸前体的微生物和一种使用此微生物制备L-甲硫氨酸前体的方法。
更特别的是，本发明提供了一种能够生产O-琥珀酰高丝氨酸具有以下特征的微生物和使用此菌株生产L-甲硫氨酸前体的方法，所述的特征为1)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是引入和增强的，其中高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是抗甲硫氨酸反馈的；和2)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2. 7. 2. 4或I. I. I. 3)是增强的。


参考附图可以更好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中
图I是甲硫氨酸前体生产菌株的基因操作说明图。
图2是生产甲硫氨酸的2步法的化学结构说明图。
图3是抗反馈metA基因表达的pMetA_C的示意图。
具体实施方案
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种能够生产L-甲硫氨酸前体的具有下列特征的微生物1)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是引入和增强的，其中高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性是抗甲硫氨酸反馈的；和2)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2. 7. 2. 4 或 I. I. I. 3)是增强的。
术语“L-甲硫氨酸前体”定义为甲硫氨酸特异性代谢途径中一部分的代谢产物或可以衍生出这些代谢产物。特别是，如本文所用的L-甲硫氨酸前体是指O-琥珀酰高丝氨酸。
如本文所用的术语“L-甲硫氨酸前体生产菌株”是指能够通过本发明的操作积聚L-甲硫氨酸前体的原核或真核微生物菌株。例如，此菌株可选自由埃希杆菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属、假单胞杆菌属、钩端螺旋体属、沙门氏菌属、短杆菌属、Hypomononas sp.、色素杆菌属和诺卡氏菌属微生物组成的组或真菌或酵母。优选地，微生物埃希杆菌属、棒状杆菌属、钩端螺旋体属和酵母可以用来生产O-琥珀酰高丝氨酸。更优选地，可以使用埃希杆菌属微生物，且最优选地使用大肠杆菌(在下文中指“E. coli”)。
在各种实施方案中，本发明提供了一种L-甲硫氨酸前体生产菌株，其中参与天然O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸分解的基因被删除或弱化而替代地引入和增强O-琥珀酰高丝氨酸合成中涉及的抗反馈的基因。本发明还选择性提供了一种苏氨酸生物合成途径被阻断或弱化以增强O-琥珀酰高丝氨酸生产的菌株。本发明还提供了一种天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶过表达或活性增强的菌株。本发明还提供了一种菌株，所述菌株中引入了能过表达且活性增强的与反馈调节系统无关的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶并且天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶能过表达或活性增强。
更特别的是，本发明通过删除参与L-甲硫氨酸前体分解的metB基因、参与苏氨酸生物合成途径中的thrB基因和调节L-甲硫氨酸前体生产基因转录的metj基因提供了一种L-甲硫氨酸前体生产菌株。本发明还通过敲除参与甲硫氨酸前体合成的天然metA或metX基因和引入抗反馈的metA提供了一种L-甲硫氨酸前体生产菌株。本发明还通过增强thrA基因编码的蛋白质的活性提供了一种L-甲硫氨酸前体生产菌株。
更优选地，本发明还通过敲除天然的metA或metX基因、引入抗反馈metA基因和通过thrA基因的增强提供了一种L-甲硫氨酸前体生产菌株。在以前的专利(PCT/KR2007/003650)中引入和证实了 metA基因是抗反馈的。
在本发明中，如本文所用的“失活”涉及该基因的缺失或弱化。该基因的缺失是通过切掉该基因的区域或在染色体上引入一个特异性基因序列来修饰蛋白质序列来完成的。在这方面术语“弱化”或“衰减”描述了微生物中相应DNA编码的一个或多个酶(蛋白质)细胞内活性的降低或消失，例如通过修饰该基因的启动子区和5’ -UTR核苷酸序列或通过在该靶基因的ORF区上引入突变来降低该蛋白质活性。通过弱化措施，该相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质的活性或浓度或在起始微生物中该蛋白质活性或浓度 的 0-75%,0-50%,0-25%,0-10%^； 0-5%。
为了达到弱化，例如该基因的表达或该酶蛋白质的催化性质可以被降低或消除。这两个措施可以任选组合。
基因表达的降低可以通过合适的培养、基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)或还可通过反义RNA技术来进行。基因表达的信号结构是，例如阻遏物基因、激活剂基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。专家可以寻找到这方面的信息，特别是例如在 Jensen 和 Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191195(1998))、在 Carrier 和 Keasling(Biotechnology Progress 15:5864(1999))、Franch 和 Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3 :159164 (2000))中和在已知遗传学和分子生物学教科书中，例如Knippers的教科书(“Molecular Genetics”,第6版，1995)或 Winnacker 的教科书(“Genes and Clones”，1990)。
导致酶蛋白质的催化性质变化或降低的突变从现有技术中可以知道。可以提到的实例是 Qiu 和 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272 :86118617 (1997))、Yano等人(Proceedings ofthe National Academy ofSciences, USA 95 :55115515 (1998))、和Wente 和 Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266:20833 20839 (1991))的著作。综述可以在遗传学和分子生物学的公知教科书，例如Hagemann的教科书(“GeneralGenetics”，1986)中找到。
可能的突变是指转变、易位、插入和缺失。根据氨基酸交换对酶活性的作用，涉及“错义突变”或无义突变。基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致“移码突变”，“移码突变”导致加入错误的氨基酸或过早中止翻译。如果作为突变的结果在编码区形成一个终止密码子，这还导致翻译的过早终止。多个密码子的缺失通常导致该酶活性的完全丧失。关于这些突变产生的指导是现有技术并且可以在公知的遗传学和分子生物学教科书例如Knippers 的教科书(“Molecular Genetics”，第 6 版，1995) >ffinnacker 的教科书(“Genesand Clones”，1990)或 Hagemann 的教科书(“General Genetics”，1986)中找到。
基因中适合的突变，例如缺失突变，可以通过基因或等位基因置换整合至适合的菌株中。
在本发明中，术语“增强”描述了相应DNA编码的酶的细胞内活性的增加。酶的细胞内活性的增强可以通过该基因的过表达来实现。靶基因的过表达可以通过修饰该基因的启动子区或5’ -UTR区的核苷酸序列来实现。靶基因的过表达还可通过在染色体上引入该靶基因的额外拷贝、通过用含有带有启动子的该靶基因的载体转化宿主菌株、或通过引入可以增加该靶基因表达的突变来实现。酶的细胞内活性的增强还可通过引入该靶基因ORF区的突变来实现。通过增强措施，相应蛋白质活性或浓度一般增加了至少75%、100%、150%、200%、300%、400%或 500%，最多至 1000%或 2000%，以野生型蛋白质或起始微生物中该蛋白质的活性或浓度为基准。
在本发明的一个优选实施方案中，制备L-甲硫氨酸前体生产菌株的方法如下
在步骤I中，编码例如胱硫 醚Y合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的蛋白质的基因在菌株中被删除或弱化以累积L-甲硫氨酸前体例如O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸。
编码胱硫醚Y合酶的基因表示为metB，编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因表示为metZ，和编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因表示为metY。编码具有上述活性蛋白质的基因通过大肠杆菌中的metB举例说明。该基因的基因组序列可以从以前报告(Blattner等人，Science 277:1453-1462(1997))中报导的大肠杆菌基因组序列(登记号AAC75876)中获得。以上基因组序列还可从NCBI (国家生物技术信息中心)和DDBJ(日本DNA数据银行)获得。具有相同活性的其它基因通过来源于棒状杆菌的metB和metY和来源于假单胞杆菌的metZ举例说明。
胱硫醚Y合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶具有如下反应式所示的将O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸转化为胱硫醚或高半胱氨酸的活性。因此，当具有该活性的基因被删除或弱化时，O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸在培养溶液中大量累积。
L-半胱氨酸+0-琥珀酰-L-高丝氨酸〈= > 琥珀酸+胱硫醚
L-半胱氨酸+0-乙酰-L-高丝氨酸〈= > 乙酸+胱硫醚
HS_+0-琥珀酰-L-高丝氨酸〈= > 琥珀酸+高半胱氨酸
HS_+0-乙酰-L-高丝氨酸〈= > 乙酸+高半胱氨酸
在步骤2中，步骤I中制备的菌株中编码高丝氨酸激酶的thrB基因被删除或弱化。thrB基因参与由高丝氨酸合成O-磷酸高丝氨酸，O-磷酸高丝氨酸随后被thrC基因转化为苏氨酸。thrB基因缺失或弱化以使用细胞内所有高丝氨酸来合成甲硫氨酸前体。
在步骤3中，删除甲硫氨酸合成途径中的一个转录调节子或使其弱化。参与甲硫氨酸合成的metA、metB、metC、metE和metF基因被反馈调节系统抑制。metj基因是大肠杆菌中的典型转录子调节子基因。为了使metA或metX基因过表达以合成甲硫氨酸前体，metj需要被消除。因此，如果metj基因在大肠杆菌中被消除，metA或metX基因表达通常是增加的，从而导致L-甲硫氨酸前体的大量产生。
以上步骤2和3可根据前体生产菌株被改进或删除。但是，为了增强埃希杆菌属微生物中的前体生产途径更优选进行这些步骤。
在步骤4中，引入抗反馈高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，它介导甲硫氨酸生物合成途径第一个步。metA是编码具有高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性的蛋白质的基因的通用名称。抗反馈高丝氨酸O-琥珀酰活性是突变抗反馈metA基因的结果。PCT/US2007/009146公开了制备抗反馈metA基因的方法。上述国际专利中含有的一般信息可以通过权利要求
包括在本发明的范围内。在本发明中，抗反馈metA 10基因编码的氨基酸序列表示为SEQ ID NO14、metA 11基因编码的蛋白质表示为SEQ ID NO :16、metA 32基因编码的表示为SEQ IDNO 18,metA 37基因编码的表示为SEQ ID NO :20、metA 41基因编码的表示为SEQ ID NO 22(PCT/US2007/009146)。此外，本发明包含GenBank登记号AP 004514的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶肽，其在氨基酸位点 24、29、79、114、140、163、222、275、290、291、295、297、304、305或它们的组合上具有突变。
metA基因的引入或增强通过引入该基因或通过修饰该基因的启动子区和5’ -UTR的核苷酸序列或通过在该靶基因的ORF区引入突变来进行。与反馈调节系统无关的突变metA基因的引入导致L-甲硫氨酸前体合成的增加而与培养基中甲硫氨酸的浓度无关。
此外，O-琥珀酰高丝氨酸生产可以通过在染色体上删除天然metA基因然后在其上引入突变metA基因来进一步增加。通过删除met J基因而增强metA启动子使抗反馈metA 基因可以产生更多O-琥珀酰高丝氨酸。
在步骤5中，天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶是活性增强的以增加O-琥珀酰高丝氨酸前体，高丝氨酸的合成。thrA是编码具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性的肽的通用名称。thrA活性的增强通过引入thrA基因上的突变或通过染色体上thrA基因的多种整合或通过引入含有thrA基因的质粒来进行。
优选地，天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶由来自于Unipix)数据库编号AP000666 (大肠杆菌thrA)的基因编码。更优选地，thrA基因编码的氨基酸序列表示为具有氨基酸位点345突变的SEQ ID NO :29。thrA的修饰和增强通过引入thrA基因上的突变或还通过弓I入染色体上的靶基因或还通过弓I入处理的质粒来进行。
L-甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸可以通过使用以上步骤I至步骤5的部分或全部方法在菌株中积聚。
产L-甲硫氨酸前体的菌株可以从产L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的菌株中制备。优选地，可以通过使用产L-苏氨酸的菌株制备。使用此菌株，高丝氨酸的合成更为容易并且使得甲硫氨酸前体的产量增加。所以，甲硫氨酸前体可以通过删除或弱化参与苏氨酸生物合成途径的基因然后metA或metY或metZ基因使用产L-苏氨酸的菌株来积聚。更优选首先删除或弱化thrB基因然后metB、metY或metZ来合成甲硫氨酸前体。
本发明的术语“产L-苏氨酸的菌株”是指能够在体内生产L-苏氨酸的原核或真核的微生物菌株。例如，该菌株可以包括属于埃希杆菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的产L-苏氨酸的微生物菌株。其中，优选埃希杆菌属微生物，更优选大肠杆菌。
在本发明的一个优选实施方案中，使用CJM002，它是从TF4076(KFCC 10718，韩国专利号92-8365)即产L-苏氨酸的大肠杆菌突变菌株转化的产L-苏氨酸和不依赖L-甲硫氨酸的菌株。TF4076具有甲硫氨酸需求，且对甲硫氨酸类似物(例如α-氨基羟基戊酸，AHV)、赖氨酸类似物(例如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸，AEC)和异亮氨酸类似物(例如α-氨基丁酸)有抗性。TF4076不能在体内合成甲硫氨酸因为其是具有甲硫氨酸需求的菌株。为了使用这种菌株作为本发明的无甲硫氨酸需求的甲硫氨酸前体生产菌株，本发明者通过使用NTG人工突变制备了无甲硫氨酸需求的产L-苏氨酸的菌株大肠杆菌CJM002。大肠杆菌CJM002命名为大肠杆菌MF001且于2004年4月9日保存于KCCM(韩国微生物培养中心，Eulim Buld. Hongje-l-Dong, Seodaemun-ku, Seoul, 361-221, Korea)(登记号KCCM-10568)。在本发明中，删除了大肠杆菌CJM002中的metB、thrB、metJ和metA基因，然后引入抗反馈metA基因。使用大肠杆菌CJM002构建获得的产L-甲硫氨酸前体的菌株命名为CJM-AlI。CJM-AlI菌株用thrA表达载体转化，命名为CJM-AlI (pthrA (M) -CL)。通过以上方法制备的大肠杆菌CJM-All即产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株于2008年I月23日保存，登记号为KCCM10922P。
在本发明的另一个优选实施方案中，使用公开于PCT/KR2005/00344的产L-苏氨酸的菌株FTR2533。FTR2533来源于大肠杆菌TFR7624，大肠杆菌TFR7624来源于大肠杆菌登记号KCCM10236。大肠杆菌登记号KCCM 10236来源于大肠杆菌TF4076。大肠杆菌登记号KCCM 10236能够表达较高水平的催化从PEP形成草酰乙酸盐的ppc基因和从天冬氨酸生物合成苏氨酸必需的酶例如thrA :天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶、thrB :高丝氨酸激酶、thrC :苏氨酸合酶，从而促使L-苏氨酸产量的增加。大肠杆菌FTR7624(KCCM10538)具有失活的tyrR基因，它能阻遏L-苏氨酸生物合成必需的tyrB基因的表达。大肠杆菌FTR2538 (KCCM10541)是具有失活的galR基因的产L-苏氨酸的菌株，它是产L-苏氨酸大肠杆菌突变菌株。
在本发明中，大肠杆菌FTR2533的metB、thrB、metj和metA基因被删除，然后引入抗反馈metA基因。使用大肠杆菌FTR2533构建获得的产L-甲硫氨酸前体的菌株命名为CJM2-A11。CJM2-A11 菌株用 thrA 表达载体转化，命名为 CJM2-A11 (pthrA (M) -CL)。
大肠杆菌CJM2-All(pthrA(M)-CL)于 2008 年 2 月 12 日保存，登记号 KCCM10924P。
另一方面，本发明涉及一种生产L-甲硫氨酸前体的方法，此方法包含a)发酵以上所述的微生物山)富集培养基中或微生物中L-甲硫氨酸前体；和c)分离L-甲硫氨酸前体。
以上制备的产L-甲硫氨酸前体的菌株的培养可以通过本领域技术人员公知的适合的培养基和条件来进行。本领域技术人员众所周知培养方法可以根据所选择的菌株容易地调整使用。例如，培养方法包括但是不限于分批、连续培养和补料分批培养。大量培养方法描述于以下参考文献J_es Μ· Lee的“Biochemical Engineering”，Prentice-HallInternational Editions, pp 138-176。
对于具体的菌株培养基必须满足培养条件。大量微生物培养基描述于以下参考文献American Society for Bacteriology 的“Manual of Methods for GeneralBacteriology, Washington D. C. ,USA, 1981。这些培养基包括多种碳源、氮源和微量元素。碳源的实例为碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；脂肪例如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸例如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类例如丙三醇和乙醇；和有机酸例如乙酸。这些化合物之一或它们的混合物可以用作碳源。氮源的实例为有机氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和大豆粉以及无机氮源例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些化合物之一或它们的混合物可以用作氮源。本文的培养基可以额外包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应含钠盐作为磷酸盐源。培养基还可包括金属盐例如硫酸镁或硫酸亚铁。此外，氨基酸、维生素和适合的前体也可加入。培养基或前体可分批或连续加入至培养基中。
培养基的pH可在培养期间以适当方式加入化合物例如氢氧化胺、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。在培养期间使用防泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可抑制气泡的产生。为了维持培养液的好气条件，可注入氧气或含氧气体(例如空气)至培养液中。培养液的温度通常为20-45°C，优选25-40°C。培养周期可持续至L-甲硫氨酸前体的生产达到预想水平，优选培养时间为10-160小时。
实施例
本发明的实践和目前优选实施方案如以下实施例所示，它们用于说明但是不解释为本发明的限制。需要理解本领域技术人员考虑本 说明书时可在本发明的精神和范围内进行改良和提闻。
实施例I :甲硫氨酸前体生产菌株的构建
<l~l>metB某闵的缺失
为了在大肠杆菌中删除编码胱硫醚合酶的metB基因，进行FRT- —步PCR删除(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)。SEQ ID NO 1 和 NO 2 的引物用于 PCR 使用 pKD3 载体(PNAS(2000) vol 97 p6640-6645)作为模板，获得缺失基因盒的构建。PCR如下进行30圈的94°C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分钟。
PCR产物进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳，随后纯化I. 2kbp条带获得的DNA。将回收的DNA片段电穿孔至用pKD46载体(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)转化的大肠杆菌(K12)W3110中。在电穿孔前，用pKD46转化的W3110在30°C含有100μ g/L氨苄西林和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中培养至0D_达到O. 6。然后培养的菌株用无菌蒸馏水洗两遍并用10%甘油再洗一遍。电穿孔法在2500V进行。回收的菌涂于含有25 μ g/L氯霉素的LB平板培养基上，随后37°C培养过夜。然后，选择显示氯霉素抗性的菌株。
使用所选择的菌株作为模板用引物No I和2在同样条件下进行PCR。metB基因的缺失通过在I. O %琼脂糖凝胶上确认I. 2kb大小基因来证实。然后用PCP20载体(PNAS(2000) vol 97 p6640-6645)转化菌株，并在LB培养基中培养以除去氯霉素标记基因。最终构建metB敲除菌株，其中通过相同条件下PCR metB基因大小在I. 0%琼脂糖凝胶上降至150bp。构建的菌株命名为W3-B。
<l-2>thrB基因的缺失
本发明者试图通过删除编码高丝氨酸激酶的thrB基因从高丝氨酸中增加O-琥珀酰高丝氨酸合成。尤其是，当苏氨酸生产菌株用作生产O-琥珀酰高丝氨酸的宿主时，thrB基因的删除是必需的，这是因为通过此基因将高丝氨酸至O-磷酰高丝氨酸的转化十分强烈。为了在以上构建的W3-B菌株中删除thrB基因，以如上所述删除metB基因的同样方法进行FRT —步PCR删除。
为了构建 thrB 缺失基因盒，使用 pKD4 载体(PNAS (2000) vol 97 p6640-6645)作为模板使用引物SEQ ID NO 3和NO 4如下进行PCR 30圈的94°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸I分钟。PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上电泳，随后纯化从I. 6kbp条带获得的DNA。回收的DNA片段电穿孔转至使用pKD46载体转化的W3-B菌株中。回收的菌株涂于含有50 μ g/L卡那霉素的LB平板培养基上，随后37 °C培养过夜。然后，选择显示抗性的菌株。
使用所选择的菌株作为模板用引物SEQ ID NO 3和NO 4在与上面相同的条件下进行PCR。ThrB基因的缺失通过在I. 0%琼脂糖凝胶上选择大小为I. 6kb的菌株来确认。然后用pCP20载体转化菌株且在LB培养基中培养。最终构建thrB敲除菌株，其中通过相同条件下PCR thB基因大小在1.0%琼脂糖凝胶上降至150kb。确认除去了卡那霉素标记。构建的菌株命名为W3-BT。
<l-3>metT某闵的缺失
为了删除与甲硫氨酸前体合成相关的metA基因的调节子基因metj基因，以用来删除metB基因的相同方法进行FRT —步PCR删除。
为了构建metj缺失基因盒，使用引物SEQ ID NO :5和NO :6如下进行PCR :30圈的94°C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分钟。
PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上电泳，随后纯化从I. 2kbp条带获得的DNA。回收的DNA片段电穿孔至使用pKD46载体转化的W3-BT菌株中。回收的菌株涂于含有氯霉素的LB平板培养基上，随后37°C培养过夜。然后，选择显示抗性的菌株。
使用所选择的菌株作为模板用引物SEQ ID NO 7和NO 8在与上面相同的条件下·进行PCR。metj基因的缺失通过在I. O %琼脂糖凝胶上确认I. 6kb大小的基因来证实。然后用pCP20载体转化菌株且在LB培养基中培养。最终构建metj敲除菌株，其中通过相同条件下PCR metj基因大小在1.0%琼脂糖凝胶上降至600kb并且确认除去了菌株的氯霉素标记。构建的菌株命名为W3-BTJ。
<l-4>metA某闵的缺失
为了在染色体上引入抗反馈metA基因，删除W3-BTJ菌株中的真实染色体metA基因。为了删除metA基因，进行FRT—步PCR删除。
为了构建metA缺失基因盒，使用引物SEQ ID NO :9和NO : 10如下进行PCR :30圈的94°C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸I分钟。
PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上电泳，随后纯化从I. 2kbp条带获得的DNA。回收的DNA片段电穿孔至使用pKD46载体转化的大肠杆菌W3-BTJ菌株中。回收的菌株涂于含有氯霉素的LB平板培养基上，随后37 °C培养过夜。然后，选择显示抗性的菌株。
使用所选择的菌株作为模板用引物SEQ ID NO :9和NO :10在与上面相同的条件下进行PCR。metA基因的缺失通过在I. O %琼脂糖凝胶上确认I. Ikb大小的基因来证实。然后用pCP20载体转化菌株且在LB培养基中培养。最终构建metA敲除菌株，其中通过相同条件下PCRmetA基因大小在I. 0%琼脂糖凝胶上降至lOOkb。确认除去了氯霉素标记。构建的菌株命名为W3-BTJA。
<1~5>引入抗反馈metA基因
为了增加L-甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸的生产，进行编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的抗反馈metA基因的过表达。PCT/US2007/009146公开了制备抗反馈metA基因的方法和其活性。
抗反馈metA 10基因的序列表示为SEQ ID NO 13和该基因编码的氨基酸序列表不为SEQ ID NO 14o metA 11基因的序列表不为SEQ ID NO : 15和该基因编码的氣基酸序列表不为SEQ ID NO16o metA 32基因的序列表不为SEQ ID NO17和该基因编码的氣基酸序列表不为SEQ ID NO18o metA 37基因的序列表不为SEQ ID NO :19和该基因编码的氣基Ife序列表不为SEQ ID NO :20。metA41基因的序列表不为SEQ ID N0:21和该基因编码的氨基酸序列表示为 SEQ ID NO :22(PCT/US2007/009146)。
使用以上基因作为模板使用引物SEQ ID N0:11和N0:12如下进行PCR:25圈的94°C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸2分钟。[0091]PCR产物在I. 0%琼脂糖凝胶上电泳，随后纯化从I. 2kbp条带获得的DNA。分离DNA片段后，用限制性内切酶SmaI断裂载体pCL1920且连接至被分离的DNA片段上。大肠杆菌用载体转化且在含有50 μ g/L壮观霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。构建的载体如图3中所示。
载体电穿孔至W3-BTJA菌株中并且该菌株的生产能力使用锥形瓶培养按照实施例2-1所描述的进行检测，基于野生型菌株的O-琥珀酰高丝氨酸的生产率为100 %，检测改良菌株的O-琥珀酰高丝氨酸的生产率。作为结果，所有改良菌株的O-琥珀酰高丝氨酸的生产率比野生型菌株显著增加了，特别是metA ll、metA 10和metA 32显示最高效的生产率。
表I. IOOmM甲硫氨酸存在下突变metA的反馈抗性
权利要求
1.一种能制备O-琥珀酰高丝氨酸的由埃希杆菌属产生的微生物，所述微生物的特征为1)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶EC2. 3. I. 46活性被引入并增强，其中所述高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性对甲硫氨酸具有抗反馈抑制性，并且所述高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的肽是SEQ ID NO 14、16、18、20或22;2)天冬氨酸激酶EC2.7.2.4或高丝氨酸脱氢酶ECl. I. I. 3活性被增强；以及3)胱硫醚Y合酶或O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶被弱化或失活。
2.根据权利要求
I所述的微生物，其中所述天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶是SEQIDNO 29。
3.根据权利要求
I所述的微生物，其中该微生物由产L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-赖氨酸的菌株产生。
4.根据权利要求
I所述的微生物，其中该微生物是大肠杆菌。
5.根据权利要求
I所述的微生物，其中高丝氨酸激酶被弱化或失活。
6.根据权利要求
I所述的微生物，其中甲硫氨酸合成途径中的转录调节子被弱化或失活。
7.根据权利要求
I所述的微生物，其中天然高丝氨酸O-乙酰转移酶活性或天然高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性被弱化或失活。
8.根据权利要求
I所述的微生物，其中编码胱硫醚Y合酶的metB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因、和metA基因的转录调节子metj基因被弱化或失活。
9.根据权利要求
I所述的微生物，其中所述微生物由产苏氨酸的菌株大肠杆菌MFOOl产生，所述大肠杆菌MF001的登记号为KCCM 10568，所述的大肠杆菌MF001不依赖甲硫氨酸。
10.根据权利要求
I所述的微生物，其中所述微生物由产苏氨酸的菌株大肠杆菌FTR2533产生，所述大肠杆菌FTR2533的登记号为KCCM 10541。
11.根据权利要求
I所述的微生物，其中所述微生物是产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株大肠杆菌CJM-AlI，所述大肠杆菌CJM-AlI的登记号为KCCM 10922P。
12.根据权利要求
I所述的微生物，其中所述微生物是产O-琥珀酰高丝氨酸的菌株大肠杆菌CJM2-A11，所述大肠杆菌CJM2-A11的登记号为KCCM 10924P。
13.一种制备O-琥珀酰高丝氨酸的方法，该方法包括a)发酵根据权利要求
I至12中的任意一项权利要求
所述的微生物；b)在培养基中或微生物体内富集O-琥珀酰高丝氨酸；和c)分离O-琥珀酰高丝氨酸。
专利摘要
本发明涉及制备L-甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，所述微生物的特征为1)高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性(EC2.3.1.46)被引入并增强，其中所述高丝氨酸O-琥珀酰转移酶活性对甲硫氨酸具有抗反馈抑制性；和2)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2.7.2.4或1.1.1.3)被增强，以及使用该微生物制备L-甲硫氨酸前体的方法。
文档编号C12N1/21GKCN101555464 B发布类型授权 专利申请号CN 200910131576
公开日2012年10月17日 申请日期2009年4月7日
发明者严惠媛, 张真淑, 徐昌一, 李汉珍, 申容旭, 罗光镐, 许仁庚, 赵英郁, 金喆河, 金素影 申请人:Cj第一制糖株式会社专利引用 (4),