生物催化剂在颗粒硅藻土上的固定的制作方法

专利名称:生物催化剂在颗粒硅藻土上的固定的制作方法
本发明涉及一种共轭固相酶和制备这种共轭物的方法。更详细地涉及到在颗粒硅藻土的支持物上固定酶。
调节生命有机体中许多化学反应的酶，在性质上是属于蛋白质，通常是水溶性的，起生物催化剂的作用。酶也可以被分离而作为分析、医学和工业上的用途。例如用于制备食物，如乳酪和面包，以及酒精饮料的制备。
因为酶通常是水溶性的，且一般是不稳定的，所以易发生减活化作用。它们可在溶液中应用，但难以从溶液中取出来再重复使用，这些困难导致在工业规模生产中增加了酶的使用费用，因为它们需要频繁地更换。为了减少更换酶的高额费用，在它们使用以前已发明了固定(有时称为不溶性)酶的各种方法。这种酶的固定法可以酶重复使用允许再生，同时却在其它方面经受减活化作用或消耗于利用酶的反应溶剂中。这些固相酶系可以应用在各种反应器系统中，例如填料塔和搅拌槽反应器，采用哪种反应器取决于被生物催化反应的底物的性质。
实现酶的固定的几种一般的方法以及许多由此改进方法已有过介绍，例如，英国专利1，444，539号公开了具有固定酶或者固定含有酶细胞用途的一些资料。最好用水混溶剂(例如丙酮)处理酶或细胞经干燥后用聚乙烯亚胺和戊二醛处理，使形成水不溶性结构的物体。
美国专利3，796，634号更详细地公开了一种固定方法。该方法包括把聚胺吸收到筛分的胶体微粒表面，聚胺与一般的胺反应交联剂(如戊二醛)交联。用氢硼酸钠(NaBH4)处理最终反应产物，以减少醛基并由此避免醛基与酶的氨基之间的共价键。然后酶在某pH值时被吸收到已处理的颗粒表面上，以致于在胶体吸收剂上带有与酶分子上相反的净电荷，结果使离子键帮助其它非共价键力。上述专利介绍的吸收剂颗粒大小约为50至20，000埃，最佳直径约为100至200埃，吸收剂材料是活性炭、羟基磷灰石、γ-氧化铝支持物和膨润土。这个系统取决于把酶结合到已处理颗粒的电荷间相互作用。这类键的形式不如共价键形式，因为离子相互作用对环境条件敏感，对这类键来说，如对PH值、离子强度及温度。
刘等人在《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng.)17卷1695～1696页、1975年，公开了一种对于乳糖酶在颗粒碳上的固定方法，该方法包括把对氨基苯酚或1-苯酚-2-氨基-4-磺酸吸收到碳上。这些被吸收的化合物提供氨基，与戊二醛起反应又与酶结合。含有所述化合物的氨基是单体，这些单体具有的化学和物理性质有别于聚胺，例如聚乙烯亚胺。
另外一些工作者(赵等人在《生物技术和生物工程》20卷1651～1665页、1978年，发表了活性炭上酶的固定固相葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶和葡糖酸内脂酶的性质)还通过共价固定，在颗粒碳上固定酶。在这种工艺过程中，碳由碳化亚胺活化，碳化亚胺可以被酶置换形成一种酶-碳复合物。
美国专利4，141，857号公开了一种固定酶的方法，该方法包括处利一种无机的多孔支持材料，例如γ-氧化铝，其孔径约100至55，000埃，每克带有水溶性聚胺溶液的表面积约100至500米2，并且将已处理的支持材料与双功能单体材料(如戊二醛)溶液相接触。这个处理方法留下已处理的支持材料适合于与酶的反应，以便形成酶和侧醛基之间的共价键。在本专利的实施例Ⅱ中叙述了通过按顺序用聚乙烯亚胺、戊二醛和葡糖淀粉酶的溶液处理多孔氧化铝球，制备固相酶共轭物。
美国专利No4，438，196公开了一种酶被固定在颗粒活性炭上的工艺方法，该方法包括用具有侧氨基的聚胺化合物处理碳，以引起聚胺粘附于碳，留下侧氨基能够进一步自由反应。游离氨基用具有氨反应性部分的双功能化合物，通过处理被衍生，以致酶的游离氨基可以通过氨反应的化合物被共价地结合到聚胺。
本发明提供一种制备共轭固相酶的方法，该方法包括步骤有(a)多孔颗粒硅藻土与具有侧氨基聚胺化合物的溶液接触，导致聚胺附着在硅藻土上;(b)从与硅藻土接触中排除出溶剂和分散其中任何未附着的聚胺，这样，已处理的硅藻土与氨反应性物料溶液接触，该溶液是种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酐、一种多功能偶氮化合物、一种多功能异硫氰酸盐或是一种多功能异氰酸盐，上述接触导致其中一种反应基与侧氨基起反应，并留下侧氨反应性部分可以得到进一步的反应;以及(c)从与硅藻土支持物接触中除去溶剂和任何溶解其中而又未反应的氨反应性物料，硅藻土至少与一种固定酶的溶液接触，以引起酶的氨基与未反应的氨反应性部分反应，由此在它们之间通过共价键的形式固定酶(类)。在本发明范围内还包括共轭固相酶，它包括具有被依附的多孔颗粒硅藻土，此外，具有侧氨基的聚氨化合物的反应产物和反应性物料。该物料是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酐、一种多功能偶氮化合物、一种多功能异硫氰酸盐或者是一种多功能异氰酸盐，它的未反应的氨反应基已与酶或酶类的自由氨基反应，并把它联接到那里。
任一种颗粒硅藻土可以用于本发明。一种很合适的颗粒硅藻土的颗粒大小最好约从-16至+48目(美国分级筛)，孔的大小最好以半径从约35埃至1000埃的范围，表面积最好从约20～60米2/克的范围。
用下列实施例的多孔颗粒硅藻土(由EaglePitcherInd.，Inc供应)是相当廉价的，并有良好的机械强度及有能经受热和酸或碱溶液的稳定性。它的物理和化学性质如下物理性质(典型的)颗粒大小-16至+48目堆积密度38磅/(英尺)3(575公斤/米3)形状基本上球形抗压强度约250磅/(英寸)2(17.6至18.6公斤/厘米2)每磅的颗粒(24/48目)1300万每磅的颗粒(16/24目)100万颜色浅褐色平均表面积40米2/克平均孔体积0.16毫升/克平均孔径155埃化学性质(近似的)二氧化硅(SiO2)90%氧化铝(Al2O3)6.5%氧化铁(Fe2O3)2.3%石灰(CaO)0.2%氧化镁(MgO)0.3%其它氧化物0.3%灼烧损失(105℃时除去水分)0.4%溶液pH值6.5～7.0含水量少于1.0%结构主要是无定形的硅藻土。
这种多孔颗粒硅藻土由于化学上稳定，物理上刚性和低成本，颗粒硅藻土因而它可以成为一种用于塔反应器的极好的支持物。
适用于本发明特殊实施例的聚胺，包括聚乙烯二胺、一种聚乙烯亚胺例如聚二亚乙基三胺、聚三亚乙基四胺、聚五乙基烯六胺或者聚六亚甲二胺。此外，还可用(Betz 1180
，这是一种表卤代醇和聚胺的水溶性共聚物，由宾夕法尼亚特列伏斯(Trevose)贝茨(Betz)实验有限公司销售。其它合适的聚胺是聚亚甲基二环己基胺、聚二苯氨基甲烷、聚四亚乙基五胺和聚亚苯基二胺。当聚胺的分子量认为不是指临界时，聚合物分子量的范围最佳为500至100，000。应用到颗粒硅藻土的那些聚胺是水溶性的，来自它们的水溶液，而所用的非水溶性聚合物来自有机溶剂。适宜的溶剂包括如下(但不局限于这些)甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、特丁醇、丙酮、甲醚、乙醚、丙醚、异丙醚、甲苯、苯、二甲苯、己烷、环戊烷和环己烷。
确切的机理并不知道，但人们相信，颗粒硅藻土与聚胺溶液接触，通常是聚胺溶液浓缩到每升溶剂约为1～100克聚胺，致使聚胺依附到表面，并可能进入颗粒硅藻土颗粒的孔中。这样，当一部分聚合物预计应吸附到颗粒硅藻土颗粒表面，另一部分应该吸引入多孔支持物的孔隙，以致大分子从小孔射出，留下官能团(氨基)可进一步起反应。本方法与前面提到的美国专利号3，796，634记载的现有方法对照，在美国专利号3，796，634中碳粉用聚乙烯亚胺溶液处理，以改变其表面电荷而可以吸收酶到改进的载体。这个已有方法取决于电荷相互作用，这种作用比本发明工艺方法形成的共价键所要求的少得多。已处理的颗粒硅藻土从与聚胺溶液接触中排除出去，如通过倾析法或过滤法，最好用上节上述的溶剂洗涤，例如用去离子水来除去未附着的聚合物。
经聚胺处理的颗粒硅藻土，接着用多功能氨反应性物料处理，例如戊二醛、双偶氮联苯胺-2，2′-二磺酸，4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯砜;联苯-4，4′-二硫代氰酸盐-2，2′-二磺酸、3-甲氧基二苯甲烷-4，4′-二异氰酸盐、甲苯-2-异氰酸盐-4-异硫氰酸盐、甲苯-2，-4-二异硫氰酸盐、重氮基联苯胺、重氮基联苯胺-3，3′-联茴香胺、N，N′-环己烷双碘乙酰胺、1，6-己二异氰酸酯、氰尿酰氯和1，5-二氟-2，4-二硝基苯，通过与最好含有每升约1至100克氨反应性物料的溶液接触。那些水溶性氨反应性物料从它们的水溶液中应用到颗粒硅藻土，而非水溶性聚合物从有机溶剂中应用颗粒硅藻土。适宜的溶剂包括如下(但并不局限这些)甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、特丁醇、丙酮、甲醚、乙醚、丙醚、异丙醚、甲苯、苯、二甲苯、己烷、环戊烷和环己烷。使反应可以继续进行一些时间以后，足以允许氨反应性物料从聚胺衍生游离氨基，已处理的颗粒硅藻土从氨反应性物料溶液中排除，最好用去离子水洗涤几次。用于此处的术语“衍生”是用来表示聚胺分子结合到颗粒硅藻土的氨官能团和氨反应性物料的侧氨反应性部分之间反应产物的生成。
任何含有能与侧氨反应性部分反应的氨基的酶，都可通过这种方法使酶固定。另外，两种或多种酶也可以共同被固定。这些酶包括如胰蛋白酶、木瓜酶、己糖激酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、乳酸脱氢酶、乳糖酶、葡萄糖异构酶、葡糖淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、链酶蛋白酶、酰基转移酶、转化酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、转葡糖苷酶、葡糖氧化酶、胃蛋白酶、凝乳酶和真菌蛋白酶。衍生颗粒硅藻土与酶溶液混合以完成酶的固定。酶可以处于水溶液中和/或与酶共存的溶剂中。酶的固定可以分批的或工业规模进行，可以在柱状反应器中实现。从酶溶液中除去颗粒硅藻土，最好用连续水洗涤，提供适于用在生物催化剂转化的颗粒硅藻土固相酶。
本发明酶固定方法的意想不到的观察结果之一就是，一般说来颗粒硅藻土固相酶在显示它们较长的寿命意义上，以及比根据美国专利号4，438，196制备的碳固相酶的热稳定性更佳等方面是优越的，就下述实施例所说明的多相生物催化剂来说，这种性质很重要。
这种固定工艺方法的另一吸引入的优点是以前已用过的颗粒硅藻土支持物可以用包括碱-酸洗涤的简单过程再生后，为固定酶重复使用。常用的是将用过的支持物被混合在(1)水，(2)0.5当量氢氧化钠，(3)水，(4)0.5当量盐酸和(5)水中再生。该工艺方法的一种特性是有意义的，因为它为用户消除废物问题，还提供经济上可能的节省。
其它合乎需要的特性是在实施例中含有一种以上的酶共同固定，如在以下实施例Ⅴ和Ⅵ中所阐明的。
在实践本发明中，最好用水洗涤硅藻土颗粒直至干净，然后真空排气。聚胺，最好是把水溶液中的聚乙烯亚胺(分子量500～100，000)加到已洗涤的颗粒硅藻土，颗粒硅藻土与聚乙烯亚胺水溶液比值最好近似为10毫升与50毫升之比。聚乙烯亚胺水溶液约0.1%～0.5%(重量容积百分比)之间的浓度已被成功地应用，最佳为PEI(分子量40，000-60，000)水溶液约0.15～0.20%(pH值在9.0～9.9)被加到颗粒硅藻土上。在大约20～30℃、轻度搅动下，有效反应时间约在0.5～8小时之间，最好在室温下约2～5小时。过量的PEI溶液可通过用水倾析和洗涤胺处理过的颗粒硅藻土来排除，当戊二醛用作交联试剂时，它一般地以接近与聚乙烯亚胺相同的容积比值加于聚乙烯亚胺处理过的颗粒硅藻土。在这个固定工艺方法中，戊二醛浓度约0.1%～1.0%是有效的，最好是用浓度约为0.25～0.7%(重量容积百分比)含有0.05克分子碳酸氢钠的戊二醛水溶液，所要求的pH值约为7.9～8.3。一般戊二醛-碳酸氢盐溶液测得的pH值为8.2。交联反应在约20～30℃时进行大约0.5～20小时，最好在室温下轻度搅动，反应时间为2小时。任意过量的戊二醛溶液可用水倾析和洗涤处理过的颗粒硅藻土来排除。在温度大约4℃至30℃之间，适宜于固定特殊酶的pH值下，经轻度搅拌約1至10小时，能实现酶的固定最佳条件是在室温下搅拌4小时。这样得到的固相酶可以贮存在水中或适宜的缓冲溶液中，最好冷藏在冰箱内，以1℃～10℃较佳，最佳为4℃贮存，直至应用。
已知本发明的催化剂支持物一般说来是很适于酶的固定。根据本发明固定的酶基本上比溶解或者根据美国专利号4，438，196固定的酶更对于热稳定。如此，最重要地，本发明特别适用于那些对热不稳定的酶。
每毫升支持物的固相酶的活度可以由支持物的颗粒大小以及酶的荷度改变和控制。
固定方法产生酶和吸收到颗粒硅藻土的聚合物之间的键是非常稳定的。已发现当未经加工的玉米淀粉浆液通过固相酶床时，硅藻土颗粒不为蛋白质或其它物质所覆盖及污染。
用下列实施例进一步说明本发明。在实施例中，所有网目大小是基于美国标准分级筛。该实施例是用来说明最佳实施例并不由此限制本发明。
除非在实施例中另有说明外，固相酶(类)或可溶酶(类)的活性，都是按下述定的。从谷物加工公司(GrainProcessingCompany)(衣阿华州马斯喀特)得到50毫升Maltrin-150(右旋糖克当量10-12)玉米淀粉10%(重量容积百分比)在50℃下用作底物，在0.05克分子乙酸盐的缓冲液(pH值4.2)中进行分析。为了进行该项分析，底物和酶放在震荡长颈瓶里，保温30分钟，由Glucostrate方法(普通诊断法)估计形成的葡萄糖量，因而从回归分析测定每分钟形成葡萄糖的初始速率(也称作初始速度)。一单位酶活度表示在每个酶测定的条件下，一分钟内产生1微克分子葡萄糖(或葡萄糖当量)的酶的数量，并以单位/毫升(每毫升支持物的活度单位)记录。
在实施例中，由Ghuysen等人在《酶学方法》第8卷685页，纽约学术出版社(1966年)中所述的Ferricyanamide方法测定所生成的糖数量，其中葡萄糖用作为参考。
实施例Ⅰ在颗粒硅藻土用来固定以前，按如下所述进行洗涤1.100毫升-20至+24目(美国筛)多孔颗粒硅藻土(EaglePitcher实业股份有限公司)与去离子水混合，用足够的水完全浸没硅藻土。
2.硅藻土沉淀以后，轻轻倒出清液层。
3.然后，硅藻土被真空排气，去除残留的水。
在室温下用下列生产方法固定葡糖淀粉酶(AG)1.将pH9.8重量容积比为0.2%的500毫升聚乙烯亚胺600毫升水溶液(科尔多瓦化学公司，密执安州Muskegon，聚乙烯亚胺分子量范围在40，000-60，000)加于100毫升已洗涤过的硅藻土样品上，在一升锥形烧瓶中缓慢地震荡4小时。
2.然后将多余的硅藻土溶液轻轻倒出，用大量的水洗涤已处理的硅藻土。
3.附着在硅藻土的聚合物侧氨基用戊二醛衍生，这通过添加500毫升在0.05，克分子碳酸氢钠中形成的0.5%(重量容积百分比)戊二醛溶液，以致pH值为8.2。长颈瓶在室温下轻度搅动2小时。
4.轻轻倒出戊二醛溶液，用去离子水洗涤已处理过的硅藻土，除去未起反应的戊二醛，得到包含硅藻土、聚乙烯亚胺和戊二醛的支持物。
5.500毫升含有12，000单位葡糖淀粉酶的溶液(印第安纳Elkhart，迈尔斯实验有限公司的品种DiazymeL-200)，用0.02克分子磷酸盐缓冲液调整到pH值7，然后加到衍生支持物，在室温下轻轻搅动4小时。
6.轻轻倒出液体，并用去离子水洗涤固相酶。
已知固相葡糖淀粉酶在每毫升支持物中含有110单位活度。
上述制备的50毫升固相葡糖淀粉酶样品，装进直径2.5厘米、高100厘米的套层玻璃柱，用5毫克分子乙酸盐缓冲的30%淀粉浆液的酶(40克当量右旋糖)(23.63%葡萄糖、10.99%麦牙糖、0%异麦牙糖、聚合程度DP313.10%、DP47.10%，大于DP445.18%)pH值4.2，在各种流速下连续加到柱内，柱的温度保持在50℃。用高压液相色谱法和气相色谱法分析这些产品，得出的结果见下表。
表Ⅰ碳水化合物组成(%)流率＊(毫升/小时) 葡萄糖麦牙糖异麦牙糖 DP3DP4＞DP425.494.31.10.80.403.513.395.71.31.50.401.211.096.61.11.80.300.29.194.11.43.80.70少量＊麦牙糖组分含有少量性质未辨别出的DP2糖。葡萄糖最大含量可高达96.6%，证实右旋糖含量类似于所得到的可溶葡糖淀粉酶的糖化作用。在30%干固体时右旋糖的高含量表明酶是在或很接近颗粒的表面，以致于内部扩散不是影响反应的主要因素。另外，高糖馏分(＞DP3)能够容易地被固相酶水解，进一步表明几乎没有空间位阻或底物易于进入酶活动的场所。
实施例Ⅱ热稳定性可溶葡糖淀粉酶、根据美国专利号4，438，196实施例Ⅰ的碳固相葡糖淀粉酶、以及如上述实施例Ⅰ制备的颗粒硅藻土固相葡糖淀粉酶的热稳定性试验，在60℃、pH值4.2(0.1克分子乙酸盐缓冲液)及没有底物的情况下进行，其结果示于表Ⅱ-A。
表Ⅱ-A(在60℃及pH值6.0保温规家时间后，剩余的葡糖淀粉酶的百分活度)。
剩余活度(%)时间(分)3060120180可溶的82.673.266.454.7碳固定的87.072.454.751.4颗粒硅藻土固定的91.678.772.664.2如表所示，在多孔硅藻土上固定葡萄糖淀粉酶，导致酶热稳定性的改进。
稳定性和得率取1升如上述实施例Ⅰ制备的固相葡糖淀粉酶，装入套层玻璃柱(5×100厘米)，该柱在50℃下连续操作，加入底物30%干固体二元酶玉米淀粉浆液(35克当量右旋糖，用2.5毫克分子乙酸盐且含有250ppm二氧化硫缓冲，pH值为4.2。另外，底物在5℃冷藏，然后通过装填普通颗粒，硅藻土的70℃小柱子，在进入酶柱之前，该小柱起检查过滤作用。产品中葡萄糖含量在94%至96%之间。柱子的半衰期约125天，具有生产率每毫升固相葡糖淀粉酶约153克干固体。
为了对照，根据美国专利号4，438，196实施例Ⅰ制备的碳固相葡糖淀粉酶，在如上节所述的同样的柱子内试验(除干固体为25%之外)。尽管较低的干固体有助于可获得淀粉的更完全转化，因此产量应该更高，产品中葡萄糖含量在92%至93%之间的范围。柱子的半衰期约67天，生产每毫升固相葡糖淀粉酶约107克干固体。
在不同流速通过每个柱子的碳水化合物分布结果概括在表Ⅱ-B。
表Ⅱ-B葡糖淀粉酶结合到颗粒硅藻土流速碳水化合物分布(%)(床体积/小时) DP1麦芽糖和DP2异麦牙糖 DP3＞DP3底物21.88.7011.558.01.589.61.30.50.48.21.092.61.50.80.44.70.894.41.31.00.33.00.695.21.41.30.31.80.595.11.41.60.31.60.495.91.42.00.30.40.395.11.52.50.30.60.293.61.63.60.80.41.65.9012.180.42.084.21.60.20.713.31.685.61.30.30.612.21.088.51.30.50.49.30.892.51.40.70.45.00.591.71.31.00.25.80.392.71.51.60.14.10.293.91.62.40.12.00.192.71.94.30.40.70.0592.61.94.80.30.4＊床体积/小时是流速值，它与反应时间成反比关系。
从表Ⅱ-B可以确定与颗粒硅藻土结合的葡糖淀粉酶与颗粒碳结合的葡糖淀粉酶能够更完全地水解淀粉的。通过葡糖淀粉酶结合到颗粒硅藻土可达到最大右旋糖含量约96%，而葡糖淀粉酶结合到碳，右旋糖含量约95%，增加的右旋糖产量表明葡糖淀粉酶结合到颗粒硅藻土的空间位阻较少或者更多的是结合在颗粒表面上，以致底物受到较小的扩散阻力。葡糖淀粉酶结合到颗粒硅藻土的较小扩散阻力的另一表示，在各自右旋糖含量下形成较低的异麦牙糖含量。
实施例Ⅲ用不同颗粒大小的颗粒硅藻土和已固定的葡糖淀粉酶的不同酶的数量，如实施例Ⅰ同样地重复葡糖淀粉酶的固定，对葡糖淀粉酶的活性与葡糖淀粉酶的量进行对照。
在下面表中记录的数据表明，颗粒大小与酶载荷量对用葡糖淀粉酶作为典型体系的酶支持物混合体的活性的影响。
表Ⅲ颗粒硅藻土在支持物上葡糖葡糖淀粉酶支持固相酶的再生淀粉酶的载荷量物组分的活度(网目大小)(单位/毫升支持物)(单位/毫升支持物)(%)-16至+2470.051.673.7-16至+24140.0116.383.1-16至+24200.0178.889.4-16至+24400.0196.549.1-16至+24800.0189.623.7-16至+241200.0191.115.9-24至+4870.069.699.4-24至+48140.0135.596.8-24至+48260.0234.390.1-24至+48400.0294.573.6-24至+48800.0295.236.9-24至+481200.0299.925.0
从表Ⅲ可以确定，增加载荷量，对-16至+24目颗粒尺寸，载荷量达到约200单位/毫升，对-24至+48目颗粒尺寸，载荷量为300单位/毫升。然后，活性达到平衡。
实施例Ⅳ100毫升聚乙烯亚胺-戊二醛衍生颗粒硅藻土如实施例Ⅰ那样(但用-24至+48目颗粒硅藻土制成)，用于固定大豆β-淀粉酶(Hi-S，HankyuKyoeiBussanCo.，L.，日本大阪)。用于处理衍生颗粒硅藻土的酶溶液是1克(40，000单位/克大豆β-淀粉酶于pH在7时，500毫升0.02克分子磷酸缓冲液中。按实施例Ⅰ的方法进行固定酶的操作。由此得到的固相β-淀粉酶测得(pH值为5.5)每毫升支持物为134单位。
50毫升各种30%DSMaltrin-150(谷物加工公司)样品在0.05克分子乙酸盐溶液中(pH值5.0)，与不同数量的固相β-淀粉酶一起在震荡长颈瓶中，50℃下经过24小时被溶解，这样制备是为了生产高麦牙糖浆。用高压液相色谱法分析产品的碳水化合物组分，结果列于下表。
表Ⅳ-A固相β-淀粉酶碳水化合物组分(%)(毫升)DPDPDP＞DP01.23.52.892.50.21.237.011.250.60.41.242.412.743.70.91.147.212.838.91.81.151.812.734.33.51.253.812.732.47.01.155.212.431.3
从表Ⅳ-A可以确定，右旋糖含量的最大值可达约55%。
可溶性β-淀粉酶、根据美国专利号4，438，196的实施例Ⅳ制备的固相β-淀粉酶、以及本发明制备的结合到颗粒硅藻土的β-淀粉酶的热稳定性试验，在60℃乙酸盐缓冲液(0.1克分子，pH5.5)中，并没有底物的情况下进行，结果示于表Ⅳ-B。
表Ⅳ-B(在60%和pH6.0保温后，剩余的β-淀粉酶的百分活度)。
剩余活度(%)时间(分)3060120180可溶的87.217.24.71.4碳固定的84.258.646.043.2颗粒硅藻土固定的10010091.586.6结合到颗粒硅藻土的β-淀粉酶的热稳定性显著地增加。一小时以后，可以看出对于颗粒硅藻土固相酶基本上没有损失活度，碳固相酶剩余活度少于6.0%，可溶的酶剩余活度少于20%，甚至60℃下，3小时后，颗粒硅藻土固相β-淀粉酶超过85%，与少于45%的碳固相酶以及与少于5%的可溶酶相比，仍然是有效的。
实施例Ⅴ取100毫升衍生颗粒硅藻土如实施例Ⅰ(但用-24至+48目制成)那样用来固定。衍生颗粒硅藻土用含有12，000单位葡糖淀粉酶(DiazymeL-200，迈尔斯实验有限公司)和12，000单位支链淀粉酶(Promozyme(R)200L，新星实业有限公司)的500毫升pH6.0缓冲溶液(0.1克分子乙酸盐)处理，通过按实施例Ⅰ所述的方法将这些酶共同固定在多孔颗粒硅藻土支持物上。这样得到的共固相葡糖淀粉酶一支链淀粉酶混合物，用1%(重量容积百分比)支链淀粉作为底物测得葡糖淀粉酶活度为54.5单位/毫升，支链淀粉酶活度为12.3单位/毫升。
50毫升30%DS玉米淀粉浆液酶(40克当量右旋糖)样品在0.05克分子乙酸盐中pH4.2，与不同数量的已制备的固相葡糖淀粉酶一支链淀粉酶混合物一起在震荡长颈瓶中，50℃下经24小时被溶解而制备高右旋糖浆。下表给出碳水化合物分布。
表Ⅴ固相葡糖淀粉酶碳水化合物组分＊(%)一支链淀粉酶(毫升)DP麦牙糖＊＊异麦牙糖DP＞DP底物18.212.7023.445.71.768.720.70.12.38.23.595.12.30.21.90.55.296.91.50.41.31.16.996.61.30.40.61.18.797.31.30.50.50.5＊组分测定用高压液相色谱法和气相色详法两种方法＊＊麦牙糖组分含有少量组分未明的DP2糖。
如此得到的糖浆与在实施例Ⅰ中得到的相比，葡萄糖含量较高，异麦牙糖含量较低。葡糖淀粉酶/支链淀粉酶的结合不同于葡糖淀粉酶单独的水解分布。理论上归因于葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的结合作用。
实施例Ⅵ100毫升衍生多孔颗粒硅藻土如实施例Ⅰ那样(但用-24至+48目颗粒硅藻土制成)用作固定。用1克β-淀粉酶(Hi-Maltosin S)与20毫升支链淀粉酶(Pulluzym
750L，ABM Chemicals Limited of woodley stockport英国柴郡)，在0.005克分子乙酸盐缓冲液中pH为5.5混合物制备的溶液，然后，β-淀粉酶和支链淀粉酶通过实施例Ⅰ给出的方法共同固定在多孔颗粒硅藻土上。
50毫升30%DSMaltin-150样品在0.05克分子乙酸中pH为5.5，与不同数量的已制备好的固相β-淀粉酶/支链淀粉酶一起在震荡长颈瓶中，50℃24小时水解而制备高麦牙糖浆。在下述表中给出产品的高压液相色谱糖分布。
表Ⅵ共相β-淀粉酶/高压液相色谱糖分布(%)支链淀粉酶(毫升) DP1DP2DP3＞DP301.23.52.892.50.42.846.915.235.10.92.853.113.330.81.82.857.913.425.93.52.962.614.120.57.03.067.313.316.4结果表明由共固相β-淀粉酶/支链淀粉酶制备的高麦牙糖组分比由单独的固相β-淀粉酶制成的那些要好，即麦牙糖含量较高，较高分子量的糖类含量较低。如实施例Ⅴ，理论上认为是β-淀粉酶和支链淀粉酶的结合作用所造成的。
实施例Ⅶ100毫升聚乙烯亚胺-戊二醛衍生颗粒硅藻土如实施例Ⅰ(但用-24至+48网目颗粒硅藻土制成)用来固定支链淀粉酶(Pulluzyme750L)。500毫升0.05克分子乙酸盐，pH为5.5，含有24毫升酶，被用来处理衍生物颗粒硅藻土，如实施例Ⅰ那样进行固定酶的操作。测定这样得到的固相支链淀粉酶(pH值6.0)每毫升支持物32单位。
可溶支链淀粉酶以及由此制备的结合到颗粒硅藻土的支链淀粉酶的热稳定性试验，是在60℃pH值6.0(0.1克分子乙酸盐)并没有底物的情况下进行的，结果示于表Ⅶ。
表Ⅶ(在60℃及pH值6.0保温规定时间后，剩余的支链淀粉酶的百分活度)。
剩余活度(%)时间(分)3060120180可溶的19.76.000颗粒硅藻土固定的51.442.242.238.4显然在表Ⅶ中，固相支链淀粉酶比可溶酶有较大的热稳定性。半小时后，颗粒硅藻土固相支链淀粉酶活度仍保持在50%以上，而可溶支链淀粉酶活度已低于20%。经过2小时，颗粒硅藻土固相支链淀粉酶活度仍保留约42%，但可溶支链淀粉酶活度已下降到0%。
实施例Ⅷ100毫升聚乙烯亚胺-戊二醛衍生颗粒硅藻土如实施例Ⅰ那样(但用-24至+35网目制成)用于固定乳糖酶。取自A.Oryzae的1克乳糖酶(20，000单位)溶解在500毫升0.02克分子磷酸钠缓冲溶液(pH值7.0)，以及用与实施例Ⅰ给出的相同方法固定到颗粒硅藻土。在50℃pH值4.5下用5%(重量容积百分比)乳糖酶作底物来测定乳糖酶活度。由葡糖淀粉方法测定分离出的葡萄糖。一单位乳糖酶活度被定义为在50℃pH值4.5情况下，每分钟产生1微克分子葡萄糖的酶量。测定这样得到的固相乳糖酶每毫升支持物为106.7单位。
50毫升15%(重量容积百分比)乳糖(0.05克分子乙酸钠，pH值4.5)样品与结合到颗粒硅藻土的固相乳糖酶在震荡长颈瓶中，50℃下进行24小时水解。在下表中给出水解产品的高压液相色谱糖分布。
表Ⅷ-A固相乳糖酶高压液相色谱糖分布(%)(毫升) 葡萄糖半乳糖乳糖 DP3DP40--100.0--0.934.425.431.27.31.71.842.637.116.63.30.43.547.245.05.21.6-5.248.647.72.90.8-7.048.848.32.40.5-10.448.948.52.6--乳糖水解程度超过97%，表明固相乳糖酶结合到颗粒硅藻土是具有相当活性的。
可溶乳糖酶以及已制备的结合到多孔颗粒硅藻土上的乳糖酶的热稳定性试验，在60℃、pH值4.5(0.1克分子乙酸钠)及没有底物情况下进行的，结果示于表Ⅷ-B。
表Ⅷ-B(在60℃及pH值4.5保温规定时间后，剩余的乳糖酶的百分活度。)剩余活度(%)时间(分)3060120180可溶的52.432.416.810.0颗粒硅藻土固定的76.072.661.653.4实施例Ⅸ100毫升聚乙烯亚胺-戊二醛衍生颗粒硅藻土如实施例Ⅰ那样(但用-24至+48网目制成)用于固定转葡糖苷酶。应用500毫升0.05克分子乙酸盐pH为5.5，含有500单位精制的热稳定性的转葡糖苷酶，取自Talaromycesduponti。用实施例Ⅰ给出的相同方法进行酶的固定。测定这样得到的固相转葡糖苷酶，每毫升支持物为2.6单位。根据液相色谱法定量测量转葡糖苷酶产品的方法来测定转葡糖苷酶活度。即是在pH值4.5及60℃下酶和麦牙糖保温混合物中的4-α-葡糖基麦牙糖。一单位转葡糖苷酶活度被定义为，每小时从20%麦牙糖溶液pH值4.5及60℃下产生一微克分子4-α-葡糖基麦牙糖的酶的数量。
50毫升30%DS麦牙糖溶液(pH值4.5，0.05克分子乙酸盐)与已制备的固相转葡糖苷酶一起在震荡长颈瓶里，在60℃下经过5天溶解，产生不可发酵的糖类(主要是4-α-葡糖基麦牙糖和异麦牙糖)。产品的GC法分析表明下列糖的分布;28.3葡萄糖、34.8%麦牙糖、7.4%异麦牙糖、22.1%4-α-葡糖基麦牙糖和7.5%高糖类，这个实施例中产生的不可发酵糖(α1-6键)的总量约37%。
权利要求
1.一种制备共轭固相酶的方法，该方法包括以下步骤a)使多孔颗粒硅藻土与具有侧氨基的聚胺化合物溶液相接触，使聚胺化合物附着于硅藻土；b)从与硅藻土接触中排除去溶剂和任何分散其中而又未附着的聚胺，这样，已处理的硅藻土与氨反应性物料的溶液接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酐、一种多功能偶氮化合物、一种多功能异硫氰酸盐或是一种多功能异氰酸盐，上述接触导致其中一种反应基与侧氨基起反应，并留下侧氨反应性部分可以得到进一步的反应；c)从与硅藻土支持物接触中排除出溶剂和任何溶解其中而未被反应的氨反应性物料，硅藻土至少与一种固定酶的溶液接触，以引起酶或酶类的氨基与未反应的氨反应性部分反应，在它们之间通过共价键的形式固定酶。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中聚胺选自聚乙烯二胺、聚乙烯亚胺、聚六亚甲二胺、聚亚甲基二环己基胺、聚二苯氨基甲烷、聚四亚乙基五胺、聚亚苯基二胺，以及表卤代醇和聚胺的共聚物。
3.根据权利要求
2所述的方法，其中聚乙烯亚胺是聚二亚乙基三胺、聚三亚乙基四胺、聚五乙基烯六胺或者聚六亚甲二胺。
4.根据权利要求
1所述的方法，其中聚胺分子量为500至100000。
5.根据权利要求
1所述的方法，其中氨反应性的物料是双偶氮联苯胺-2，2′-二磺酸、4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯砜、联苯-4，4′-二硫代氰酸盐-2，2′-二磺酸、3-甲氧基二苯甲烷-4，4′-二异硫氰酸盐、甲苯-2-异氰酸盐-4-异硫氰酸盐、甲苯-2，-4-二异硫氰酸盐、重氮基联苯胺、重氮基联苯胺-3，3′联茴香胺、N，N′环己烷双碘乙酰胺、1，6-己二异氰酸脂、氰尿酰氯、1，5-二氟-2，4-二硝基苯或者戊二醛。
6.根据权利要求
2所述的方法，其中氨反应性物料是戊二醛。
7.根据权利要求
1所述的方法，其中酶是葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、转葡糖苷酶、乳糖酶、胰蛋白酶、己糖激酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖异构酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、酰基转移酶、转化酶、α淀粉酶、葡糖氧化酶、胃蛋白酶、凝乳酶、真菌蛋白酶或其混合物。
8.根据权利要求
7所述的方法，其中硅藻土颗粒大小从约-16至+48目(美国分级筛)，孔半径大小从约35埃至1000埃，表面积大小从约20至60米2/克。
9.共轭固相酶包括具有被附着的多孔颗粒硅藻土，此外，具有侧氨基的聚合化合物的反应产物和氨反应性物料，该物料是一种多功能醛、一种多功能有机卤化物、一种多功能酐、一种多功能偶氮化合物、一种多功能异硫氰酸盐或者是一种多功能异氰酸盐，它的未被反应的氨反应基已与酶或酶类的游离氨基反应，并把它联接到那里。
10.根据权利要求
9所述的共轭物，其中硅藻土颗粒大小从约-16至+48目(美国分级筛)，孔半径约从35埃至1000埃，表面积大约从20至60米2/克，聚胺可以从下列存在的组中选择聚乙烯二胺、聚乙烯亚胺、聚六亚甲二胺、聚亚甲基二环己基胺、聚二苯氨基甲烷、聚四亚乙基五胺、聚亚苯基二胺，以及表卤代醇和聚胺的共聚物。
11.根据权利要求
10所述的共轭物，其中聚乙烯亚胺是聚二亚乙基三胺、聚三亚乙基四胺、聚五乙基烯六胺、聚六亚甲二胺或表卤代醇和聚胺的共聚物。
12.根据权利要求
9所述的共轭物，其中聚胺分子量从500至100000。
13.根据权利要求
9所述的共轭物，其中氨反应性物料是双偶氮联苯胺-2，2′-二磺酸、4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯砜、联苯-4，4′-二硫代氰酸盐-2，2′-二磺酸、3-甲氧基二苯甲烷-4，4′-二异氰酸盐、甲苯-2-异氰酸盐-4-异硫氰酸盐、甲苯-2，-4-二异硫氰酸盐、重氮基联苯胺、重氮基联苯胺-3，3′-联茴香胺、N，N′环己烷双碘乙酰胺、1，6-己二异氰酸酯、氰尿酰氯、1，5-二氟-2，4-二硝基苯或者戊二醛。
14.根据权利要求
10所述的共轭物，其中氨反应性物料是戊二醛。
15.根据权利要求
9所述的共轭物，其中酶是葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、转移葡萄糖苷酶、乳糖酶、胰蛋白酶、番木瓜酶、己糖激酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、乳酸脱氢酶、葡萄糖异构酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、酰基转移酶、转化酶、α淀粉酶、葡糖氧化酶、胃蛋白酶、凝乳酶、真菌蛋白酶或其混合物。
16.一种制备共轭固相酶及糖化淀粉的方法，该方法包括以下步骤a)使多孔颗粒硅藻土与具有侧氨基的聚胺化合物相接触，使聚胺化合物附着于硅藻土;b)从与硅藻土接触中排除出溶剂和任何分散其中而又未附着的聚胺，与氨反应性物料的溶液接触，该溶液是一种多功能醛、一种多功能有机囟化物、一种多功能酐、一种多功能偶氮化合物、一种多功能异硫氰酸盐或是一种多功能异氰酸盐，上述接触导致其中一种氨反应性基团与侧氨基起反应，并留下侧氨反应性部分可以得到进一步的反应;c)从与硅藻土支持物接触中排除出溶剂和任何溶解其中而又未反应的氨反应性物料，硅藻土与固定酶或酶类的溶液接触，为此引起氨基与未反应的氨反应性部分反应，在它们之间通过共价键的形式固定酶或酶类;d)使固相酶或固相酶类与液态淀粉接触，以完成淀粉的糖化作用。
17.根据权利要求
16所述的方法，其中酶是葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、α淀粉酶或其混合物。
18.根据权利要求
17所述的方法，其中硅藻土平均孔体积约0.16毫升/克，平均孔径约155埃，平均表面积约40米2/克。
19.根据权利要求
18所述的方法，其中足够的淀粉被糖化到全部或部分不起作用后，酶或酶类被水、稀氢氧化钠、稀盐酸或其混合物洗涤固相酶或固相酶类的床或柱，从而再生颗粒活性硅藻土支持物并可以重复使用。
专利摘要
本文揭示了一种酶被固定在颗粒硅藻土上的工艺方法，该工艺方法涉及用带有侧氨基的聚胺化合物处理硅藻土，以使聚胺附着到硅藻土上，留下侧氨基能够进一步自由起反应。经过用带有氨反应性部分的双功能化合物处理而衍生游离氨基，以致酶或酶类的游离氨基可以通过氨反应性化合物共价结合到聚胺。
文档编号C12N11/14GK86106561SQ86106561
公开日1987年3月18日 申请日期1986年9月20日
发明者约翰·蒋柏春, 小奥雷斯蒂·约翰兰特罗 申请人:迈尔斯实验室公司