专利名称:用解脂亚罗威阿酵母转化株表达和分泌异源蛋白质的制作方法
本发明涉及酵母蛋白的分泌技术，尤其涉及重组解脂亚罗威阿酵母(Yarrowia lipolytica)克隆载体，包括为哺乳动物蛋白质(例如凝乳酶原)和其他多肽的表达和分泌的异源DNA编码;涉及表达载体，包括解脂亚罗威阿酵母基因启动子(例如XPR2或LEU2)、碱性蛋白酶信号(或前顺序、前区域、XPR2终止密码子区域，以及由于遗传密码简并性或使用其它解脂亚罗威阿酵母基因成分产生的变异体及其功能相同者。此外，本发明还涉及携带所述表达载体和分泌载体的酵母转化株，他们被用于产生天然功能状态的异源蛋白质;以及完成上述的各项方法。
稳定而又充分地提供对工业(例如凝乳酶原、牛生长激素)或医用(例如尿抑胃激素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、人体过敏毒素C5a)有着重要价值的各种蛋白质或多肽，特别是提供可以作为易于获得的有作用的优质产品的原料，这种经济上的诱惑力，导致许多发明者把DNA重组体技术应用于作为生产异源蛋白质“工厂”的微生物。
由于从重组体宿主细胞的胞内积累中特别是从大肠杆菌中重新获得具有生物活性的外源的或异源的(外来的)蛋白质存在着有可能解决困难的方法，所以进一步的研究集中在蛋白质的分泌上。在大肠杆菌中，异源蛋白质往往是以可折射光的包涵体的状态在细胞内产生的。该蛋白质通常水溶性很低，而且很少有或者没有生物活性。从可折射光的包涵体中提取该蛋白质通常包括苛刻的化学处理，这种处理可能花费昂贵而重新获得所需的天然的有生物活性的蛋白质都是微乎其微或者一无所获。此外，该蛋白质带有由大肠杆菌产生的不希望要的物质，为了释放可折射光的包涵体，需要破坏细胞，因而污染的可能性也随之剧烈增加。除了大肠杆菌外，其它微生物也能产生不溶性胞内状态的异源蛋白质，例如1982年7月28日公布的英国专利2，091，271号，公开了用DNA重组体技术表达牛犊凝乳酶的啤酒酵母(S.cerevisiae)的遗传修饰，凝乳酶的两个英文术语rennin和Chmosin可以交换使用。鉴于这些困难，从宿主微生物分泌该种蛋白质已转向力图产生具有天然活性构型的蛋白质。
一种特殊的蛋白质，包括异源蛋白质或多肽是否可由特定的微生物分泌，看来似乎决定于蛋白质。在大多数真核细胞中，有的蛋白质合成装置是与内质网膜和在初生多肽链的氨基端附近的氨基酸顺序(称为“信号顺序”)有关，该链的作用是操纵蛋白穿过内质网膜。接着在提供具有活性的成熟的蛋白质的分泌过程中，用水解蛋白质切开信号顺序。已经做出的某些尝试，目的是为了包括枯草杆菌、啤酒酵母和培养中的哺乳动物细胞，用微生物中的信号顺序，发展分泌异源蛋白质的方法。然而所述的这些微生物尚未证明是合乎理想的。
枯草杆菌的固有特性，例如分泌许多蛋白质，包括趋于会分解已被分泌的异源蛋白质的许多蛋白酶;已被转化的菌株由于失去异源DNA而造成不稳定性也阻碍了它的产生。
从遗传学角度已经成功地完成了哺乳动物细胞表达和分离异源蛋白质，但是，这些系统都有技术上的要求，并且费用很高，要把大多数蛋白质作为产品进行商业生产仍然是不切实际的。
虽然啤酒酵母作为蛋白质分泌系统有其某些固有的局限性，但另一方面，蛋白质分泌研究在啤酒酵母上取得的成功都超过枯草杆菌。1984年10月31日公布的欧州专利申请0123544号，介绍了啤酒酵母α因子基因的分离，并且将启动子和/或其信号肽部分与编码异源蛋白质的DNA相结合，应用到酵母的质粒上，使酵母细胞在细胞培养基上能够产生成熟的单一蛋白质。1983年9月14日公布的欧洲专利申请0088632号，介绍了表达和分泌啤酒酵母异源蛋白质的方法。可是啤酒酵母以这些或另一些分泌系统进行有效分泌的这些蛋白质的大小看来似乎限于20，000道尔顿左右。克服啤酒酵母作为分泌微生物的这种普遍性的低效率正如Smith等所介绍的，要求多重突变体(Science 229;1219～1224(1985))。对这种趋向的一个例外就是研究大于20000道尔顿的曲霉属(Aspergillus)酶类，看来这类酶可以用啤酒酵母分泌，但是被其强烈糖基化，这可能影响分泌的效率。
特殊的兴趣是对解脂亚罗威阿酵母，一种用来产生柠檬酸和单细胞蛋白质的工业上重要的酵母菌种，也可用于产生赤鲜糖醇、甘露糖醇和异丙基苹果酸与啤酒酵母相反，解脂亚罗威阿酵母由于能够有效地把高分子量蛋白质(碱性蛋白酶，酸性蛋白酶和核糖核酸酶)分泌到生长培养基中，由此有可能回收天然状态的异源蛋白质而无需破坏产生的细胞，所以特别令人感到兴趣并具有特殊的意义。此外，解脂亚罗威阿酵母还能分泌很少量的几种蛋白质，因而有可能在生长培养基中产生所需要的占优势的蛋白质种类的异源蛋白质，并且简化回收所述的异源蛋白质产物。
解脂亚罗威阿酵母产生高水平的胞外蛋白酶，这是由解脂亚罗威阿酵母分泌的占优势的蛋白质。特殊的蛋白酶(碱性的酸性的或中性的)取决于所用的解脂亚罗威阿酵母菌株(Ogrydziak等，J.Gen.Micro-biol.(1982)128，1225～1234)。碱性胞外蛋白酶的N-末端氨基酸顺序的部分顺序分析Ogrydziak等人已作了报导(loc.cit)。
1984年7月25日提交的共同未决定专利申请634，505号，介绍了通过突变互补作用转化解脂亚罗威阿酵母和克隆解脂亚罗威阿酵母基因的方法，公开了通过解脂亚罗威阿酵母的XPr2突变的互补作用，克隆被分泌碱性蛋白酶编码的XPR2基因。该方法包括通过载体PLD40用BglⅡ部分消化解脂亚罗威阿酵母基因库来转化解脂亚罗威阿酵母的宿主菌株，已在1985年4月24日分布的欧洲专利申请0138508号即类似于上述已被鉴定的美国专利申请中作了介绍。
本发明提供制备载体的方法，这类载体在被引入解脂亚罗威阿酵母宿主时，使宿主能够把产生分泌由异源DNA编码的特殊蛋白质于培养基中，这类异源DNA可以来自任何来源，但特别是来自真核生物的DNA和人工合成DNA;提供重组体解脂亚罗威阿酵母克隆载体，包括编码表达哺乳动物蛋白质和其他多肽的异源DNA，其中也有适合解脂亚罗威阿酵母宿主转化的质粒;特别提供整合表达载体，包括LEU2基因启动子，XPR2基因启动子，碱性蛋白酶早期前区域和XPR2终止密码子;表达具有异源编码顺序的质粒，这种密码顺序带有LEU2启动子的XPR2分泌信号下游该信号能表达和分泌以转化的解脂亚罗威阿酵母中的异源蛋白质。
本发明用图解说明成熟异源蛋白质的表达和分泌，特别是从遗传学上已经改变的解脂亚罗威阿酵母细胞培养的凝乳酶原和人体过敏毒素C5a的表达和分泌。精确鉴定解脂亚罗威阿酵母细胞外碱性蛋白酶氨基酸顺序和DNA顺序的发现就有可能确定，异源蛋白质可以通过重组DNA技术来表达和分泌，以供细胞培养生产。就凝乳酶原而言，可以用成熟的酶原(凝乳酶的前体)来表达和分泌。
现在已经发现解脂亚罗威阿酵母通过重组DNA技术可以从遗传上进行改变，使产生的转化株能够表达和分泌天然状态的异源蛋白质。这种改变可通过构建携带XPR2基因信号或信号和第一顺序(prol)或两个顺序(pro1+pro2)的载体来完成，XPR2基因是与需要分泌的异源蛋白质的结构基因顺序相连接的。
通过在DNA载体的XPR2位点上的整合产生的转化株，包括失去调节的XPR2基因或不再产生碱性蛋白酶的基因两端的结构成分的片段，和不仅为异源蛋白质的分泌所希望要的而且也能用于筛选假定存在的转化株的特征。
此外，携带XPR2启动子和碱性蛋白酶分泌信号顺序的顺序的载体能够在已经转化的解脂亚罗威阿酵母细胞中实现分泌成熟的异源蛋白质。这种类型的有些重组DNA载体能够实现表达/分泌，而与酵母基因组的整合部位无关。一般说来，含有足够的5′和3′两侧的DNA的载体能够表达与整合部位无关的产物。
此外还令人惊奇和出乎意料地发现，将pBR322衍生质粒整合到解脂亚罗威阿酵母染色体DNA提供了能够进一步促进目标部位整合转化的同系区，因此pBR322的整合样板可以作为进入转化的DNA的“连接台”(“docking platform”)将pBR322的驻留样板整合到解脂亚罗威阿酵母染色体DNA，尽管pBR322不是天然的解脂亚罗威阿酵母DNA，然而为整合提供了一个已知的靶。解脂亚罗威阿酵母转化的受体包括这样一个部位，它在两个主要方面能够超过不含这样部位的受体，即存在一个具有已知顺序和已知限制图可作为目标部位整合的靶区;如果插入的质粒含有完整的功能单位或者含有仅与希望得到的基因部分相反的基因，则需要具有用pBR322作为整合靶进行测定的条件。例如，仅含有XPR2基因的一个3′的片段就能转化XPR2-1002受体，如果它含有野生型密码子并在XPR2位点上整合的话。然而，如果XPR2-1002宿主被整合到pBR322，同一个质粒也许不能把它转化为蛋白酶完全的表现型，因为它缺少完整的功能单位。
因此，在解脂亚罗威阿酵母转化株中包括一个与DNA异源载体相一致的同系区，所述同系区包括该解脂亚罗威阿酵母整合转化期间作为受体部位的外源DNA。除了pBR322及其衍生物外，还有Cosmids、像M13和入一类的噬菌体、人工合成的衍生DNA和像pUC13一类的普通质粒都可用于产生具有“连接台”的解脂亚罗威阿酵母转化株。
“LEU2”启动子顺序指的是ATG未被翻译区上游，ATG含有表达所要求的大多数即使不是全部)的特征。
“XPR2”启动子顺序指的是在表达所需要的信号顺序(或前顺序)前面的未被翻译区的上游。此外，有或没有启动顺序的XPR2基因的信号，在表达操纵解脂亚罗威阿酵母启动子而不是XPR2基因操纵的条件下，都可用于分泌蛋白质。因此，携带LEU2启动子和碱性蛋白酶分泌信号顺序的载体，在已经转化的解脂亚罗威阿酵母细胞中能成功地分离成熟的异源蛋白质。
人体过敏毒素C5a也是一种已知的补体蛋白质C5a(人体C5a)，它是体内作为补体激活作用的结果产生的具有生物的多肽片段。它在调节体液免疫反应和细胞免疫反应的某些方面起着免疫调节剂的作用，其一级结构和其它过敏毒素的一级结构都已清楚。它的生物学和理化特征在由H.J.Muller-Eberhard和P.A.Miescher合编的《补体》(Complement)一书中，已由Hugli作了概述(纽约Springer出版社出版，1985年73～99页)。
熟悉本领域的人都会理解，在本发明中可以准用实际上任何已知的氨基酸顺序进行异源DNA编码。这里所公开的方法也可以准用来产生和分泌任何已知的异源蛋白质，其中有代表性的介绍在1985年7月30日公布的美国专利4，532，207号中已一一列举。此外，任何其他解脂亚罗威阿酵母分泌蛋白质基因，如核糖核酸酶和酸性蛋白酶这两种基因可以用来代替XPR2基因，也可以用来代替由所述的2个或更多的基因相连的片段所组成的杂种基因，例如XPR2基因的信号顺序和核糖核酸酶基因的启动子顺序。
包括在本发明范围内的还有功能相当于这里所述的DNA顺序或核苷酸顺序的等同物。遗传密码的简并性容许由其他的密码子代替某些密码子，前者是针对特定相同的氨基酸，因此产生相同的蛋白质。事实上，由于DNA或核苷酸顺序在很大程度上是可以改变的，除了蛋氨酸和色氨酸外，已知的各种氨基酸可以由一个以上的密码子进行编码。因此，部分或全部XPR2基因都可以人工合成，给出与图3的DNA顺序具有明显差别的DNA顺序。因此，其编码的氨基酸顺序可以保持。给定的DNA或核苷酸顺序这种功能上的更替提供的条件，可以加速用被融合的外来DNA顺序分泌和/或处理被编码的异源蛋白质。因此凡是可用遗传密码的XPR2基因和片段的核苷酸顺序的所有变化都包括在本发明内。此外，也可能除去一些密码子或由除了简并密码子外的密码子取代一个或更多的密码子，以产生结构上改变的多肽，但与由未改变的DNA分子产生的多肽相比，在实用性和活性方面基本上是相同的。所述这两种多肽的功能都是相同的，如同两种DNA分子产生两种多肽，尽管所述的两种DNA分子之间差别与遗传密码的简并性无关。其最简单的例子就是凝乳酶原A和凝乳酶原B，凝乳酶原的两种等位基因的形状，其区别仅在于，天冬氨酸残基是在凝乳酶原A的286位置上，而在凝乳酶原B的那个位置上都是甘氨酸残基。
利用这个方法，通过用表达和分泌解脂亚罗威阿酵母XPR2和/或LEU2中的两种基因的信号，表达和分泌哺乳动物的异源蛋白质凝乳酶原和人体过敏毒素C5a已经在解脂亚罗威阿酵母中取得成功。凝乳酶原和人体过敏毒素C5a的DNA顺序通过合成寡核苷酸与在假设的部位上的XPR2基因顺序相连接，以此为碱性蛋白酶信号肽或蛋白酶前体加工部位进行编码(此处称为pro1和pro2)，并用来产生基因结构，然后通过整合转化将基因结构插入解脂亚罗威阿酵母。重组体培养物被表达并被输出到生长培养基中的具有凝乳酶原和人体过敏毒素C5a的分子量和免疫反应活性的异源蛋白质。如此产生的凝乳酶原可以认为是包含在天然的构型中，由于紧接着除去前肽，它具有完全的酶的活性。
此处所用的“重组体DNA材料”一语包括含有至少下列材料之一的任何材料解脂亚罗威阿酵母的XPR2基因、信号(或前信号)、por1-和pro2-(共有一个启动区)，启动子或其终止顺序LEU2启动子;以及由于遗传密码的简并性，功能尽管可能与上述顺序相同的顺序。所述重组体DNA材料中具有代表性的材料为DNA片段、质粒或载体，或含有上述顺序中任一个或者全部顺序的转化株。
材料New England Biolabs供给的限制性核酸内切酶和T4连接酶，Beth esda Research Laboratories供给的细菌碱性磷酸酶，PL-Biochemi-cals供给的T4多核苷酸激酶，和New England Nuclear供给的〔r-P〕三磷酸腺苷。所有的酶都是在提供者所推荐的条件下使用的。
培养基GPP培养基-(甘油/
-蛋白胨培养基)，(每升)含有6.7克甘油，1.6克Difco
-蛋白胨，1.7克不含氨基酸和硫酸铵的Difco酵母含氮碱基化合物，30毫克尿嘧啶，和0.5毫升/升克分子量为2000(Polysciences)的聚丙二醇溶于40毫克分子浓度的磷酸缓冲液(pH6.8)。(聚丙二醇在作生长培养时省略不用，在进行凝乳酶分析时使用)。在磷酸缓冲液中，
-蛋白胨单独进行高压灭菌。YEPD(酵母提取物/蛋白胨/右旋糖)培养基，(每升)含有5克酵母提取物，10克蛋白胨和20克右旋糖。
大肠杆菌生长在37℃的LB培养基中。LB培养基(每升)含有10克细菌胰蛋白酶水解产生的胨(Bactotryptone)，10克细菌酵母提取物，10克氯化钠;用氢氧化钠将pH调至7.5。
DNA顺序分析这里所描述的各种质粒的DNA片段都是在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离并用Maxam等人的方法(Methods in Enzymology，65，499(1980)排列顺序。
连接方法DNA片段，包括被切割的载体质粒，都是用T4DNA连接酶通过混合所需要的组分进行连接(带有适合构建末端的DNA片段以提供正确的配对)。将微克量的载体和插入片段需加约10单位的连接酶。最后得到连接反应被转化到大肠杆菌K12菌珠MM294(ATCC-33625)或HB101(ATCC-33694)的反应潜能细胞中。
化学合成DNA的制备为构建用于表达和分泌凝乳酶的杂种基因，用改进的Phosphoramidite方法(Sinha等，Tetrahedron Letters24，5843(1983)ona Genetic Design 6500(Watertown，WA)和DNA自动合成器合成8个寡核苷酸，并且从6M尿素-20%聚丙烯酰胺凝胶中进行纯化。将互补寡核苷酸的整分部分在4℃条件下互相混合和退火，在TE(10个毫克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂一盐酸，pH8.0，1毫克分子浓度的NaEDTA)中过夜。双股寡核苷核的整分部分(约2微克)在37℃条件下用T4多核苷酸激酶在反应混合物中进行磷酸化，该反应混合物含有70毫克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(pH7.6)，10毫克分子浓度氯化镁，5毫克分子浓度二硫苏糖醇，5毫克分子浓度三磷酸腺苷。
DNA质粒制备DNA质粒的大量制备采用Holmes等人的方法(Anal Biochem.，114，195～197(1981))，然后用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓-氯化铯浮力密度梯度离心。质粒DNA的小量制备采用Birnboim等人的碱性SDS方法(NAR1，1513(1979))。
凝乳酶原的表达载体和分泌载体的构建进行一系列不同的构建是为了获得末端表达载体。所有各个步骤都在附图中予以说明。一般说来，DNA片段是用凝胶电泳分离并与另一些片段连接，或者切割DNA质粒，溶于4℃的20微升50毫克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂一盐酸(pH7.5).10毫克分子浓度氯化镁，20毫克分子浓度二硫苏糖醇，1毫克分子浓度三磷酸腺苷，和200单位的T4连接酶。如果需要用限制性核酸内切酶进行DNA的部分消化，则需要通过实验确定最佳的切割时间。
培养液中凝乳酶原的鉴定含有表达载体的酵母转化株在GPP培养基(配方同上)中生长过夜。离心后去除酵母细胞，将1毫升的50%TCA加到5毫升为一个整分部分的培养液，在4℃条件下保持60分钟。用离心得到小片，再用2毫升冷冻丙酮洗两次。将沉淀的蛋白质溶于100微升的SDS样品缓冲液，整分部分在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(Laemmli，U.K.，(1970)Nature227，680)。凝胶溶解蛋白质通过电泳转化为硝化纤维(Schleicher和Schuell，0.22微米)，用胶块凝胶免疫斑渍(immuno-blot)分析法(Hawkes，R.等，(1982)Anal.Bioo-hem.119，142)进行鉴别。滤纸涂上家兔抗凝乳酶原抗体，然后用结合山羊抗兔免疫球蛋白G抗体的过氧化酶保温(Cappel，Malvern，Pa)。结合抗体用4-氯-1-萘酚和过氧化氢染色测定。
培养液中凝乳酶原的凝乳活性各种解脂亚罗威阿酵母转化株的培养液按照Ernstrom的改进方法(J.Dairy Sci.41，1664(1958))测定凝乳活性。简言之，测定包括测量凝乳酶活化培养液的上清液凝结缓冲过的脱脂乳所需的时间长度以及有关纯化凝乳酶标准的这些数值。酵母培养物(25毫升)在GPP培养基中生长过夜。离心后去除细胞，将5毫升培养上清液的整分部分在真空条件下冷冻干燥。把每份经冷冻干燥的上清液再悬浮于300微升蒸馏水中。还要制备一组纯化的牛犊凝乳酶原稀释液作为对照参考标准。在适中浓缩和控制条件下的凝乳酶原的活化是通过加入大约5～10微升的浓盐酸，使pH值达到大约2左右，在22℃下保温1小时。脱脂乳的制备是将60克干燥的脱脂奶粉(DifCo)加到500毫升的41.5毫克分子浓度醋酸钠(pH6.3)和13.6毫克分子浓度氯化钙中，在4℃条件下搅拌20分钟。制备后即将底物进行测定。将每个制备的酶以60微升为一等分(相等于1毫升的培养上清液)在37℃条件下，加到1毫升等分的脱脂乳中，记录凝结时间。
用于C5a基因的合成寡核苷酸的制备用于C5a结构基因合成的寡脱氧核苷酸的化学制备是采用改进的Phosphoramidite方法(Sinha等，loc.cit)和在一个DNA自动合成器的遗传装置6500(Watertown，MA)上的可控制多孔玻璃载体。用3%(重量/体积)二氯乙酸的二氯甲烷溶液进行脱三苯甲基作用，用饱和四唑的乙腈溶液加以Phosphoramidites线性激活，以di-ethoxyphosphine tetrazolide封端，用含水碘/四氢叶酸氧化(Matteucci等，1981，J.Amer.Chem.Soc.105，3183)。每个加成周期的总的时间是14分钟。得到图9中的10个47-聚体A-J片段，每个步骤的平均得率为98.8%(用三苯甲基分析)，用Matteucci等人(loc.cit.)的方法解封，从0.3克分子浓度的醋酸钠中折出乙醇并在退火前先在10%聚丙烯酰胺-尿素变性凝胶上用预制的凝胶电泳进行分离。
人体C5a基因的测定、克隆和顺序排列图9表示期望得到的蛋白质的氨基酸顺序和编码人体C5a蛋白质基因所需的人工合成寡核苷酸的排列。除A和F外的所有低聚物，都是在他们的5′末端用T4多核苷酸激酶进行磷酸化。基因的测定包括退火和连接两个主要反应，两个反应含有低聚物A、B、I和J，以及低聚物C、D、E、F、G和H。最终得到的94碱基对和141碱基对双股DNA片段都是在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳后进行分离，相互共同连接，他们的235碱基对产物用凝胶电泳分离。含有编码C5a结构基因的235碱基对DNA片段插在pBR322DNA载体的EcoRⅠ和HindⅢ两个部位之间并转化为大肠杆菌K-12菌珠HB101的反应潜能细胞。从6个转化株分离得到的DNA质粒的有限性分析表明6个克隆中有5个含有大小合适的EcoRⅠ/HindⅢ片段。这些质粒中每个质粒的C5a基因区的核苷酸顺序都用Maxam等人的方法(Methods Enzymol.65，499(1980))测定。
用于大肠杆菌的C5a表达质粒的构件和特性鉴定DNA片段分离的方法和连接反应的条件采用1982年Maniatis等发展的方法(Molecular/CloningA Laboratory Manual，CoLd Spring Harbor)。大肠杆菌trp启动子-操纵基因，开始是从ptrpL1得到的(Edman等，(1981)Nature291，503)含有用于C5a表达质粒(pC5a-48)的trp启动子-操纵基因顺序的360碱基对EcoRI片段是由凝乳酶原表达质粒pPFZ-R2中分离得到的，关于这一点在1985年7月3日分布的欧洲专利申请0147178号中已作了介绍。
解脂亚罗威阿酵母培养液中C5a的鉴定除了山羊抗C5a和家兔抗山羊免疫球蛋白G(Cappel)用于免疫斑点外，采用如上介绍的鉴定凝乳酶原方法。山羊抗人体C5a抗体的制备采用Manderino等人的方法(J.Immunol.Methods53，41-50(1982))。
载体pLD40，已在1985年4月24日公布的欧洲专利申请0138508号中作了介绍。
微生物名称ATCC 20774 解脂亚罗威阿酵母 PC30869ATCC 20781 解脂亚罗威阿酵母 DL112-PC-30869，带XPR2的转化株//ATCC 20776 解脂亚罗威阿酵母 DL-148。
解脂亚罗威阿酵母 ATCC20688的转化株，带由SnaBⅠ消化的pLS-3ATCC 20775 解脂亚罗威阿酵母 DL-144解脂亚罗威阿酵母 ATCC 20688的转化株，带未切割的pLS-3ATCC 20777 解脂亚罗威阿酵母PC-30869的转化株带由SnaBI切割的pC5aX-3ATCC 20778 解脂亚罗威阿酵母PC-30869的转化株，带由SnaBI的pXX-11ATCC 20779 解脂亚罗威阿酵母PC-30869的转化株，带由SnaBI切割的pXX-22ATCC 20780 解脂亚罗威阿酵母PC-30869的转化株，带由
SnaBI切割的pXX-33ATCC 20794 解脂亚罗威阿酵母PC-30869的转化株，带pLD56ATCC 20795 解脂亚罗威阿酵母ATCC 20794的转化株，带由NruI切割的pLX-34上述载体根据布达佩斯协定的规定都保藏在美国马里兰州洛克维尔美国典型培养物保藏中心，这是一个公认的承担永久性保存样品的保藏机构。如果本申请被授予专利，该中心将随时准备接待公众。在本申请未决期间，这些样品可以提供给美国专利和商标局授权去那里的官员进行测定，项目编号为37CFR1.14和35USC122;根据外国专利法，在向这些国家提交过本申请副本或其成果的，也可以使用这些样品。由于授于了专利，对于公众利用所保藏的微生物的全部限制措施将不可避免地予以撤消。
解脂亚罗威阿酵母ATCC20774(Pfizer公司培养物保藏所鉴定编号为PC30869)的分类学研究是由J.R.DeZeeuw博士负责的，他提供了下述说明。所用的方法是由J.L.Eodder在《酵母菌》(第二版)(N.HollandPublishingCo，Amsterdam，1970)一书中推荐的那些方法。
CBS599是解脂假丝酵母(Candida lipolytica)典型培养菌(《酵母菌》)，第二版，N.HollandPublishingCo.，Amstedam，1970)，CBS6124在《酵母菌》(第三版)一书中是解脂复膜孢子酵母(Sacchaomcop-sislypolytica)的典型培养菌，对两者进行了比较。较早还可参考解脂抑内孢毒(Endomycopsislypolytica)。其完整的状态是解脂假丝酵母。确定这个种在分类学上的位置的是van der walt和vonArx，Antonie van Leeuwenhoek，46，517～521(1980)。现时较佳的名称为解脂亚罗威阿酵母。
菌株PC-30869的培养，形态和生理特征与由Kreger-van Rij编号的《酵母菌》(第三版，第406～408页，Elsevier Science Publi-shersB.V.，Amsterdam，1984)一书中所列的解脂复膜孢子酵母的规范介绍是一致的。
表1解脂亚罗威阿酵母菌珠的比较Pfizer公司 资料来源 基因型登记号PC-30265 NRRL YB-423(即CBS 6124)， 野生型，二倍体《酵母菌》(第三版)中的典型培养菌PC-30286 CBS 599，《酵母菌》 MATA野生型，单倍(第二版)中的典型 体，培养菌PC-30869 参阅下面的介绍 MATB bio-6，leu2-40，xpr2-1002PC-30869是由遗传上适于重组的解脂亚罗威阿酵母PC-22208的突变体构建的，解脂亚罗威阿酵母PC-22208是由Pfizer公司从土壤中分离的解脂亚罗威阿酵母PC-30026则是NRRL Y-1094的次代培养菌。PC-30869在表型上与其野生型亲代的差异在于①不产生具有活性的胞外碱性蛋白酶;②生长所需的生物素;和③要求L-亮氨酸作为营养来源。
PC-30869在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YEPD)培养基中的对数期生长期间，芽细胞呈卵圆形，平均大小为2.6×5.5微米。在YEPD琼脂上，真假菌丝体都突起，有胚泡孢子，两侧大多数为单个的。没有明显的类胡萝卜素色素。该培养菌是作为“B”交配型单倍体与测定微生物种的有权碱性的测交品系进行杂交(表5)。典型的子囊孢子的形成是V8琼脂上进行观察的。碳同化的模式见附表2。没有进行发酵试验。铵离子和尿素(无硝酸盐)是可以被利用的唯一氮源(表3)。菌珠PC-30869要求维生素B1和D-生物素(表4)。只有维生素B1是该培养菌的野生型亲本所需要的。在37℃条件下未看到生长。
表2碳同化作用＊碳源 参考表列介绍＊＊ 培养菌30265 30286 308691.L阿拉伯糖 - - - -1.纤维素二糖 - - - -3.赤鲜醇 + +++ +++ +++4.D半乳糖 - - - -5.D葡萄糖 + +++ +++ +++6.肌醇 - - - -7.乳糖 - - - -8.麦芽糖 - - - -9.D甘露糖醇 + +++ +++ +++10.棉子糖 - - - -11.核糖醇 - - - -12.D核糖 -(+) - - ++13.L鼠李糖 - - - -14.可溶性淀粉 - - - -15.蔗糖 - - - -16.海藻糖 - - - -17.D木糖 - - - -18.琥珀酸 + +++ +++ +++19.柠檬酸 + +++ +++ +++＊基础培养基是细菌酵母氮基质补加10微克/升的D生物素和149毫克/升的L亮氨酸乙酯.盐酸，以提供100毫克/升的L亮氨酸。
＊＊Kreger-vanRij.(loc.cit.)。
表3氮同化作用＊氮源 参考列表介绍＊＊ 培养菌30265 30286 308691.(NH4)2SO4+ +++ +++ +++2.KNO3- - - -3.尿素 + +++ +++ +++＊基础培养基是细菌酵母、碳基质补加116毫克/升的酮异己酸钠，以提供对应的100毫克/升的L亮氨酸，再补加10微克/升的D生物素。
＊＊Kreger-vanRij.(Loc.cit.)。
表4需要的维生素＊补加内容＊＊＊ 参考结论＊＊ 培养菌30265 30286 308691.缺 - 极微 极微 -2.维生素Bl.Hcl + +++ +++ -3.Ds生物素 - 极微 极微 极微4.维生素Bl + +++ +++ ++++生物素＊基础培养基是无细菌维生素、酵母、基质加149毫克/升的L亮氨酸乙酯、盐酸，以提供100毫克/升的L亮氨酸。
＊＊Kreger van Rij.(loc.cit.)。
＊＊＊如所述基础培养基再补加200微克/升维生素Bl，Hcl和/或10微克/升的D生物素。
表5子囊孢子的形成测交品系 交配培养菌
30265 30286 30869缺号自交配培养菌) ++ - -30264(A交配型) ++ - +++30267(B交配型) ++ +++ -①培养菌30264和30267是由L.J.WICKERHAM博士特意提供的异性交配型单倍体菌株，已在Science(167，141(1970))上作了正式介绍。
②30264是Wickerham的解脂亚罗威阿酵母YB-421③30267是Wickerham的解脂亚罗威阿酵母YB-423-12表6其他特征参考数据＊ 培养菌30265 30286 30869细胞形状 卵圆形 卵圆形 卵圆形 卵圆形细胞的平均体积(微米)(2～4.5)×(4～22) 3.3×9.1 3.0×8.2 2.6×5.5营养繁殖 芽殖 芽殖 芽殖 芽殖发酵 缺 缺 缺 缺37℃时生长 不长 不长 不长 不长菌落生长 三个培养菌生长相似并与文献介绍一致。真假菌丝体都突起，有胚孢子，两侧大多数是单个的。没有明显的类胡萝卜素色素。
＊Kreger van Rij.(loc.cit.)。
PC-30689不同于专利文献所介绍的解脂亚罗威阿酵母的其他品系，而与他们的表型相比则是明显的(表7和8)。
ATCC20228(Nubel等，美国专利4，155，811)的特征在于具有像这个种的典型品系CBS599和CBS6124的野生型营养。尤其是它不需要尿嘧啶、亮氨酸或为生长用的生物素，以及使明胶液化。
ATCC 20628(Dezeeuw)等，美国专利4，407，953)不像ATCC20228需要补加生长用的亮氨酸。像ATCC20228一样，它也不需要尿嘧啶或生物素。它也液化明胶。
ATCC20688(欧洲专利申请0138508)即使培养基中补加了尿嘧啶和亮氨酸，也只是仅仅能够生长。这种对尿嘧啶的需要就使ATCC20688跟ATCC20228和ATCC20628得以区别。ATCC20688不需要生物素，而能使明胶液化。
培养菌PC-30689不同于上述所有菌株，它需要生物素和亮氨酸，但不需要生长用的尿嘧啶，它也不能使明胶液化。
表7营养要求(略去所列培养基中的营养物)培养菌 缺 亮氨酸 尿嘧啶 生物素CBS599 +++ +++ +++ +++CBS6124 +++ +++ +++ +++ATCC20228 +++ +++ +++ +++ATCC20628 +++ - +++ +++ATCC20688 +++ - - +++PC-30869 +++ - +++ -完全的培养基含有16.7克/升的无细菌维生素、酵母基质加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L亮氨酸、10微克/升的D生物素，和200微克/升的维生素Bl.盐酸。
表8对明胶的液化作用培养菌 液化作用CBS599 +CBS6124 +ATCC20228 +ATCC20628 +
ATCC20688 +PC-30869 -培养基含有120克/升的明胶、16.7克/升的无细菌维生素、酵母基质加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L亮氨酸、10微克/升的D生物素和200微克/升的维生素Bl.盐酸。
附图简介图1由解脂亚罗威阿酵母菌株DL112分离得到的重叠质粒pLD57、pLD58和pLD62的部分线性限制图＊。
图2为XPR2基因合成的寡核苷酸探针。从已经公布的成熟蛋白酶的前25个氨基酸残基中大多数残基的顺序(Ogsydziak等，loc.cit)，标有Ⅰ和Ⅱ的两个区为构建带32倍或很少产生简并的14-聚体寡核苷酸试样提供了可能性。两个区分别开始在氨基酸7和18的位置上。为每个区制备了4个不同的8倍的简并混合探针并分配给图中所示的170～186之间。在所示核苷酸中，“X”表示4个碱基，U表示2个嘌呤，Y表示2个嘧啶。
图3XPR2基因的核苷酸顺序启动子，pre(-157～-136)，pro1(-135～-98)，pro2(-97～-1)，碱性细胞外蛋白酶和终止密码子顺序。
图4构建终止密码子载体pterm4的顺序。
图5构建质粒pLS-3的顺序和限制性图。
图6构建质粒PXX-33的顺序和限制性图。
图7构建质粒PXX-22的顺序和限制性图。
图8构建质粒PXX-11的顺序和限制性图。
图9人体过敏毒素C5a氨基酸顺序。
图10质粒pC5a-48的限制性图。
图11构建质粒pC5aX-3的顺序和限制性图。
图12a-图12cLEU2基因的核苷酸顺序。
图13构建质粒pLX-34的顺序和限制图。
XPR2基因的顺序分析无性系XPR2基因的DNA顺序分析是用化学降解法(Maxam等，1980，methods Enzymol.65，499)在由质粒pLD57、pLD58，pLD62(图1)和pLD84、pLD86(参阅下面所述)制备的重叠限制性片段上完成的。结果表明无性系酵母基因组的DNA实际上含有胞外碱性蛋白酶的基因。XPR2基因的核苷酸顺序和带有由核苷顺序得到的信号顺序的碱性蛋白酶前体的氨基酸顺序在图3中给出。大部分胞外蛋白酶的氨基酸顺序过去都是未知的(OGRYDZIAK等，loc.cit.)这里是第一次提出。此外，需要表达和分泌的胞外蛋白酶的顺序这里也是第一次予以介绍。编码碱性蛋白酶、它的前体和信号顺序的DNA顺序由1362碱基对组成(图3)。这些多肽链的初级结构是由核苷酸顺序推断得到的，共有454个氨基酸残基。碱性蛋白酶是以前体的形状在细胞内合成的，这种前体形状经过蛋白水解形成被分泌的状态或成熟状态。分析由核苷酸顺序推断得到的氨基末端氨基酸顺序表明假定的信号肽存在于前体分子中。所述信号肽含有22个氨基酸残基，其结构特点类似于较高级的真核生物和原核生物信号肽的结构(Perlman等，1983，J.Mol.Biol.167，391)。通常与已知的25个成熟碱性蛋白酶(Ogrydziak等，1982，J.Gen.Microbiol.128，1225)的氨基末端氨基酸相一致的预示氨基酸顺序中的一个区之前是含有信号肽和2个胰蛋白酸型的切割部位(LYS-Arg)的157个氨基酸残基。所述切割部位是把pro区分为pro1(-135～-98)和pro2(-97～-1)。参见图3。成熟碱性蛋白酶有由核苷酸相似推断出的297个氨基酸。预示来自核苷酸顺序的各种蛋白酶形状的氨基酸顺序是与纯化的酶的形状的大小排列次序一致的。除了碱性蛋白酶前体结构顺序外，还测定了5′端顺序片段大约700碱基对和3′端顺序的600碱基对。这些区的分析，说明他们含有类似于其他真核生物的启动子和终止密码子的顺序，而且对碱性蛋白酶的表达来说多半是不可缺少的。
如上所述，通过突变的互补作用，转化解脂亚罗威阿酵母和克隆解脂亚罗威阿酵母基因，包括通过XPr2突变的互补作用克隆到分泌碱性蛋白酶编码的XPR2基因，已在欧洲专利0138508中作了报导。该报导中所述方法包括通过载体pLD40用解脂亚罗威阿酵母基因库的BglⅡ的部分消化转化解脂亚罗威阿酵母宿主菌株，所述载体的特征是它聚藏着含有解脂亚罗威阿酵母的LEU2区分的很小片段和3EcoRⅠ、4EcoRV、6AvaⅠ、1BglⅡ、1NcoⅠ、1ApaⅠ、2XhoⅠ和1BstXⅠ核酸内切酶的限制性部位。解脂亚罗威阿酵母XPR2转化株中的一个转化株用来回收解脂亚罗威阿酵母NRRLY-1049中的野生型基因(pLD84和pLD86)，解脂亚罗威阿酵母NRRLY-1094如实施例-所述的供表达/分泌载体构建时用。
LEU2基因的顺序分析pLD25(欧洲专利0138508)中无性繁殖LEU2基因的DNA顺序分析是在重叠限制性片段上用化学降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)测定的。为了确定β-异丙基苹果酸(ⅠPM)脱氢酶密码区和正确的译读码，利用预示氨基酸顺序为啤酒酵母的LEU2基因进行预先测定(Andreadis等，1984，J.Biol.Chem.259，8059)。鉴别解脂亚罗威阿酵母基因组顺序区，该基因组顺序编码同源于啤酒酵母蛋白质顺序区的氨基酸顺序。2.8仟碱基LEU2基因的核苷酸顺序和由该核苷酸顺序推断得到的β-ⅠPM脱氢酶氨基酸顺序在图12中给出。此外，需要表达解脂亚罗威阿酵母β-ⅠPM脱氢酶的顺序这里是第一次予以介绍。编码这405个氨基酸蛋白质的DNA顺序是由1215碱基对组成的(图12)。除了β-ⅠPM脱氢酶密码顺序外，大约测定了5′端顺序的798碱基对和3′端顺序的797碱基对(包括TAA转译终止密码子)。这些区的分析表明他们所包括的顺序类似于其他真核生物的启动子和终止密码子，而且是表达时必不可少的。
解脂亚罗威阿酵母LEU2基因的5′上游区在转译开始前含有TATATATA顺序78碱基对和在mRNA准备开始前的30碱基对。对于真核生物中转录开始具有重要意义的第2顺序是CAAT部分，在LEU2基因中，这部分在假定的转录开始部位前确定为74碱基对，假定的转录开始部位自ATG为-48碱基对(图12)。
Zaret等(Cell 28，563(1982)认为在啤酒酵母中作为重要的转录终止是，3′下游区在对应于5′-TAG…TA(T)GT…TTT-3′顺序的终止密码子后面，在72至120核苷酸上有一个顺序。
实施例一所用宿主菌种是ATCC 20774(MATB leu2-40 bio-6 Xpr 2-1002)。XPR2转化株-解脂亚罗威阿酵母ATCC 0781是在脱脂乳指示平板上形成区带的一个菌落，然后从缺亮氨酸平板上进行平板影印培养。用欧洲专利申请0138508中的方法从转化株中制备染色体DNA并用来回收被分泌的蛋白酶的基因。染色体DNA用BglⅡ酶进行部分消化，并把含有大肠杆菌复制子和来自载体的抗氨苄菁霉素基因的片段连接成圆形，用以转化大肠杆菌。染色体DNA也用SalⅠ酸酶消化并用于指示转化株正常LEU2区未曾受到干扰的南部1实验中。(520碱基对SalⅠ对着LEU2区的EcoRⅠ片段正好是5′对着pLD40中所含LEU2片段被用作探针)。为此，由于把质粒库整合到解脂亚罗威阿酵母必须是同源的，所以XPR2区必须是整合部位。三个重叠但不同的质粒pLD57、pLD58和plD62开始是从解脂亚罗威阿酵母ATCC 20781回收的。他们在图1中给出。把据成熟的被分泌的蛋白酶蛋白(图2和3)的前25个氨基酸残基的已知顺序，与用于XPR2基因的人工合成寡核苷酸探针杂交表明被分泌的蛋白酶的基因已被无性繁殖。为了测定无论是代表野生型样板的回收的基因还是突变样板，用PLD58转化感受体解脂亚罗威阿酵母菌株。由于没有从任何依赖于亮氨酸的转化株产生蛋白酶阳性转化株，所以结论是pLD58含有该基因的突变等位基因。
存在于野生型菌株NRRL Y-1094中的XPR2基因的形状是通过大肠杆菌菌落的杂交试验得到的。探针用的是2仟碱基PVUⅠ对应于由含有完整构基因的数据的排列顺序所预示的EcoRⅠ片段。正如欧洲专利申请0138508所介绍的，从pLD40中NRRL Y-1094 DNA的Sau 3A部分消化的片段的原始库中，获得与本探针杂交的一些菌落。其中两个菌落含有非常相似于被pLD84和pLD86消化过的质粒，他们被用来提高表达载体。两种质粒含有相同的XPR2密码子的5′末端和Sau3A部位(被结合重新产生载体的BamHⅠ部位)，图3中的顺序就是从此开始的。每个都含有蛋白酶的全部结构基因和假定的转录终止密码子，并且包括来自NRRL Y-1094菌株的XPR2密码子大约4至5仟碱基的整个插入物。在pLD86中的插入物含有3′端以外的几百碱基对。由于为了构建表达载体，我们用的3′扩展到BglⅡ部位(碱基对2655)，所以两个质粒供应了相同的DNA，其作用是与图3的顺序相等的。
表达载体和分泌载体的构建为了实现表达和分泌解脂亚罗威阿酵母中的凝乳酶原而设计的一个计划采用在整合无性繁殖载体中各种杂交基因的构建。这样一个途径创造出参与DNA共同顺序的广泛密码子段的质粒。事实上，模式结构图是用于把带有插入3′的凝乳酶原基因的载体集中到预示XPR2信号肽处理部位(假定的pro1-处理部位)和已知能产生成熟碱性蛋白酶的切断部位。一般说来对异源基因而言，理想的是插在酵母启动子和表达的终止顺序之间。考虑到杂交基因顺序的氨基末端顺序部分随着不同的质粒构建而变化，但是凝乳酶原结构基因顺序、XPR2终止密码子顺序和往返运动的载体DNA在各个表达质粒结构中则是相同的。于是计划把相同的凝乳酶原结构基因片段和终止密码子/载体质粒用于如下所述的各个表达质粒构建中。在下游附近的密码子段里，不同的凝乳酶原表达/分离质粒的构建在先于凝乳酶原基因顺序的氨基末端碱性蛋白酶前体的顺序的长度方面不同于XPR2基因启动子顺序。为此，在XPR2凝乳酶原接合密码子内，把各个表达质粒的启动子片段的组分设计成可变的顺序。所有表达/分离载体都用类似于含有三个组成片段的连接反应集中在一起。
用于构建终止密码子载体pterm4的实现步骤见图4所示。首先将人工合成连接子与含有xpr2基因的的3′末端的片段连接，包括转录终止和聚腺苷酸信号。简单地说，用核酸内切酶KpnⅠ切割质粒pLD84，再用人工合成的连接子DNA双股链连接(图4)。用核酸内切酶HindⅢ和BglⅡ切割连接产物并将一个760碱基对片段插入与相同的两个核酸内切酶形成直线的质粒pLD41中，得到pterm4。质粒pterm4用它的限制性图来鉴定。对用EcoRV、EcoRⅠ、KpnⅠ、BglⅡ-HindⅢ和BglⅡ-BclⅠ-系列限制性核酸内切酶消化的结果进行分析。消化提供了有用的片段，如欧洲专利0138508所述，证明存在着人工合成连接子和在往返运动的质粒pLD41中XPR2基因的“完整”的3′末端。图4给出了这个7.3仟碱基终止密码子载体的部分图。
表达/分离质粒pLS-3的构建图5概述了用于分泌解脂亚罗威阿酵母中凝乳酶原的起始质粒的构建。其限制性图在图5中给出。凝乳酶原分泌质粒的构建是从制备含有大多数凝乳酶原结构基因顺序的片段着手的。从大肠杆菌凝乳酶原表达质粒pPFZ-84A中分离出含有6至365个凝乳酶原的残基密码顺序的1080碱基对BclⅠ-BamHⅠ(部分)DNA片段。(质粒pPFZ-84A是凝乳酶原表达质粒pPFZ-R2的衍生物，它的构建在1985年7月3日公布的欧洲专利申请0147178号中已作了介绍，并且已通过用限制性片段置换人工合成定向致突变的寡核苷酸方法制成。特别是pPFZ-84A不同于在凝乳酶原氨基酸残基214(天冬酰胺→天冬氨酸)和286(天冬氨酸→甘氨酸)只有两个碱基对的pPFZ-R2，可以为所谓的凝乳酶原A等位基因编译密码，所以质粒含有凝乳酶原的理想顺序并且在这个实施例中作用是相等的)。XPR2启动子组成片段含有1至157碱性蛋白酶前体和1至5凝乳酶原的密码顺序，按下述方法制备。从+PR2亚克隆质粒pLD90分离出含有启动子密码子和碱性蛋白酶基因5′末端的870碱基对HindⅢ-AvaⅠ DNA片段，它与具有下述结构的人工合成片段连接5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTG5′译读方向→这个顺序含有AvaⅠ粘性末端，然后对碱性蛋白酶前肽的最后9个密码子进行顺序编码，拉着对凝乳酶原的前4个氨基酸进行顺序编码，最后在Bam HⅠ部位终止。启动子组成片段是用HindⅢ和BamHⅠ切割后，用人工合成片段和带T4连接酶的870碱基对HindⅢ-AvaⅠ片段，通过标准连接反应获得的。最后得到的连接顺序通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，选出适用的916碱基对HindⅢ-BamHⅠ DNA片段。如上所述，杂交基因的3′末端是由终止密码子/载体质粒pterm4得到的。质粒pterm4用HindⅢ-和BClⅠ消化，并从琼脂糖凝胶中分离出大约7.3仟碱基HindⅢ-BclⅠ终止密码子/载体DNA片段，该片段含有XPR2终止密码子、LEU2可选择标记物和pBR322。
凝乳酶原表达/分泌质粒pLD-3通过对3个组成DNA片段含有(用HindⅢ-BclⅠ切割的Pterm4质粒、以及916碱基对HindⅢ BamHⅠ启动子和1080碱基对BamHⅠ-BclⅠ凝乳酶原基因的片段)的保温而结合在一起，构建如上所述有连接酶T4参加(见图5)。连接的混合物采用Dagert等人(Gene6，23-28(1979)氯化钙方法转化大肠杆菌K12菌株MM294。从抗氨苄菁霉素选出的转化株中分离质粒，质粒pLS-3用其限制性图进行鉴定(图6A)。这个质粒的XPR2-凝乳酶区经顺序排列，肯定为人工合成DNA的适合顺序和理想片段的恰当的结合。
pLD90的制备。这种质粒含有源自pLD84亚克隆。将与终止密码子的EcoRⅠ部位对应的XPR2启动子区的PVUⅠ部位中的DNA区按如下所述亚无性繁殖到pBR322的HindⅢ部位。用上述命名的两个限制性酶可以消化几微克pLD84。然后，被消化的DNA分子的“粘性”末端充满了DNA聚合酶Ⅰ的克列诺夫(Klenow)片段。将被激酶致活的HindⅢ连接子(由New England Biolabs供应的CAAGCTTG)加到带T4 DNA连接酶的末端。去除多余的连接子，用HindⅢ酶进行连续消化，形成HindⅢ粘性末端。将DNA分子的混合物置于事先准备的琼脂糖凝胶上，切下所需的2仟碱基带，进行纯化，与经HindⅢ消化过的并经细菌碱性磷酸酶处理过的载体pBR322一起加到连接反应中。连接混合物用于转化反应潜能大肠杆菌。靠近pBR322的EcoRⅠ部位，XPR2终止密码子的EcoRⅠ部位方向取名为pLD90，相反方向的则取名为pLD91。
包括在pLS-3中的XPR2启动子区的5′末端是PVUI部位，大约是从图3所列顺序区开始起的280碱基对。发现含有野生型蛋白酶基因在这样大量启动子控制下，当被整合到在远离固有的XPr2位点上的基因组时，是不能使转化株产生大量的蛋白酶的(在脱脂乳平板上的透明区作出的鉴定)。
我们注意到，如果pLS-3含有缩短的因而是“有缺陷”的启动子，然后从质粒与固有的野生型XPR2基因重组的整合结果，产生完整的启动子，它控制凝乳酶原并合产物的表达;但有缺陷的启动子则是控制蛋白酶的表达。类似基因破碎型的试验是用Shortle等人(Science217∶371～373，1982)的啤酒酵母活性基因来完成的。与我们的预料相一致的是，有些带有pLS-3不依赖亮氨酸的转化株，现在知道实际上就是有缺陷的蛋白酶。有缺陷的蛋白酶转化株与不希望要的副产品如在leu2上的基因转化株相比，更可能是所需要的在XPR2位点上的整合株。关于感受体菌株ATCC20688，我们发现未切割的pLS-3产生的6.5%缺乏蛋白酶的转化株，反之，用SnaBⅠ切割的质粒所产生的缺乏蛋白酶的转化株约为70%。就这种转化而言，基因破碎都可回避为了从所有转化株中发现合适的整合株而需要进行大量的南部斑渍试验。
含有野生型蛋白酶结构基因的质粒，在XPR2启动子控制下(位于图3所列顺序的起始处)，当其被整合到除XPr2位点外的一个部位上的解脂亚罗威阿酵母细胞时，可以表达大量的蛋白酶。可是，从这类整合株中有效地表达异源基因都要求进一步改进这个控制区DNA。
凝乳酶原的分泌用未切割pLS-3DNA和用SnaBⅠ消化的pLS-3DNA转化解脂亚罗威阿酵母菌株ATCC20688，可分别获得xpr-leu+转化株ATCC20775(DL144)和ATCC20776(DL148)。将这些转化菌株接种到含有YEPD培养基的试管中。
细胞在28℃条件下生长过夜。将这些培养菌的整分(250微升)以1∶100稀释到每份为25毫升的GPP培养基中。在28℃条件下细胞在摇瓶中生长16～18小时，通过离心得到的吸光率是在5.0～7.0的600毫微米处，通过浓缩上清液并浓缩到SDS-PAGE，测定所得到的培养液或上清液中的凝乳酶原。通过电泳把板状凝胶转化为硝化纤维纸，参加转化反应的有20毫摩尔的Tris碱基、150毫摩尔的甘氨酸、20%的甲醇，500毫安，4℃，2小时。去除板状凝胶中的蛋白质是用Coomassie等染色来鉴定的。
硝化纤维纸在37℃下干燥，在65℃烘烤1小时，然后在TBS(200毫摩尔Na Cl，50毫摩尔Tris-HCl，pH7.5)中洗脱。将硝化纤维纸置于含有10%马血清(Gibco，Chagrin Falls，俄亥俄)的TBS中，在室温条件下保温30分钟，然后在含有10%马血清的TBS中保温，并在室温条件下适当稀释凝乳酶原抗体16小时。再将硝化纤维纸放在TBS中洗脱三次，10分钟，接着在含有10%马血清的TBS中保温，然后在含有10%马血清的TBS中保温2小时，并且适当稀释结合到马萝卜过氧化酶的山羊抗兔免疫球蛋白G抗体。再将硝化纤维纸在TBS中洗脱3次，10分钟，在4-氯-1-萘酚(3毫克/毫升的甲醇溶液)中显色，然后加到浓度为0.5毫克/毫升含有0.01%过氧化氢的TBS中。测定两个上清液中存在分子量为40，000的凝乳酶原。
在酸活化浓缩培养液的上清液(见上)后，在从含有pLS-3转化培养菌ATCC20775和20776制备的样品中存在着明显的凝乳活性。作为例外的是，在感受体解脂亚罗威阿酵母ATCC20688的对照培养液的上清液中没有得到凝乳活性。
表达/分泌质粒pXX-33的构建为了把pLS-3转化为改进表达质粒pXX-33所作出的改进已在图6中作了概述。这种改进增加了XPR2启动区280碱基对，就pLS-3而言，表达质粒pXX-33含有一个完整的碱性蛋白酶的预前肽(157个氨基酸残基)的杂交基因密码，碱性蛋白酶被连接到整个凝乳酶原的结构基因顺序。
以280碱基对构建凝乳酶原表达/分泌质粒前，这种可能性与其说是在pLS-3中，不如说是在XPR2启动子顺序中，这就需要将含有整个碱性蛋白酶基因的限制性片段无性繁殖到HindⅢ部位。这种亚无性繁殖是通过把人工合成的连接子和加到由XPR2基因组库无性繁殖系的pLD86分离得到的限制性片段。构建这种带有上游区HindⅢ部位的XPR2亚无性繁殖系是从制备含有所有碱性蛋白酶基因的DNA片段着手的。XPR2无性系pLD-86的基因组区中的2.4仟碱基EcoRⅠ-BamHⅠ(部分)片段是通过琼脂凝胶电泳进行纯化的，用人工合成的片段进行连接，其顺序为5′GATCGAAGCTTG3′3′TTCGAACTTAA5′这种连接子顺序含有一个BamHⅠ粘性末端(但不再重新产生BamHⅠ部位)，然后先后为HindⅢ部位和EcoRⅠ粘性末端。连接产物用HindⅢ消化，然后插入到pBR322的HindⅢ部位。质粒pXHP-24通过它的限制性图予以鉴定，成为用于未来表达构建的XPR2启动子片段的来源。
在质粒pXHP-24中，亚无性系的XPR2基因含有大约280碱基对，在pLS-3中所含的是5′XPR2启动子顺序多于XPR2启动子顺序。首先，启动子组成片段是通过标准连接反应，用人工合成的DNA片段(如上面所述的pLS-3)和在用HindⅢ及BamHⅠ切割以后带有T4连接酶的pXHP-24中的1150碱基对HindⅢ-AvaⅠ片段得到的。将所得到的连接顺序通过凝胶电泳纯化，选出大约1196碱基对HindⅢ-BamHⅠ片段。第二个片段含有编码6～151个凝乳酶原氨基酸残基的顺序，是从经BamHⅠ和XmaⅠ切割的pLS-3以及凝胶纯化所得到的440碱基对BamHⅠ-XmaⅠDNA片段进行制备的。第三个含有凝乳酶原基因的残余、XPR2终止密码子和载体顺序的片段是由用HindⅢ和XmaⅠ切割的pLS-3，以及凝胶纯化大约8.0仟碱基HindⅢ-XmaⅠ载体片段进行制备的。然后将三个片段用上述标准方法进行连接。将连接反应用于转化大肠杆菌K12菌株MM294。从在抗氨苄青霉素的基础上选出的转化株中分离出质粒，质粒pXX-33用它的限制性图进行鉴定(图6)。这种质粒的蛋白酶一凝乳酶原区所排列的顺序，确定为所需片段的适当结合。
然后用经SnaBⅠ切割的pXX-33转化解脂亚罗威阿酵母ATCC20774，以便通过如上面所述的pLS-3的情况测定被转化的培养菌，提供解脂亚罗威阿酵母ATCC20780和在培养基中被分泌的凝乳酶原。确定在培养液的上清液中存在凝乳酶原。
在酸活化浓缩的培养液上清液之后(见上)，在由已转化的培养菌解脂亚罗威阿酵母ATCC20780中制备得到的样品中观察到明显的凝乳活性。
表达/分泌质粒pXX-22的构建构建表达/分泌质粒pXX-22的实验步骤已在图7中给出。表达载体在两个方面不同于pLS-3。如同pXX-33一样，它含有附加的280碱基对片段的XPR2启动子顺序。其次，它含有碱性蛋白酶信号肽的顺序密码和仅仅38个前肽(pro1)的氨基酸残基。
构建pXX-22的计划与pXX-33相似。首先，启动子组成片段是通过标准的连接反应，用pXHP-24中的890碱基对HindⅢ-BglⅡ片段以及在用HindⅢ和BamHⅠ消化之后人工合成的带有T4连接酶顺序片段，其顺序为5′GATCTTGCTGAGATCACTAG3′3′AACGACTCTAGTGATCCTAG5′得到的连接顺序通过凝胶电泳分离920碱基对HindⅢ-BamHⅠDNA片段进行纯化。另一个编码6～151个凝乳酶原残基的片段，是由经BamHⅠ和XmaⅠ切割的pLS-3中分离以及凝胶纯化所得到的440碱基对BamHⅠ-XmaⅠDNA片段。第三个含有凝乳酶原基因的残余、XPR2终止区和载体顺序的片段是通过用HindⅢ和XmaⅠ切割pLS-3以及凝胶纯化大约8.0仟碱基载体片段进行制备的。然后将3个DNA片段用上述标准方法进行连接。将连接反应用来转化大肠杆菌K12菌株MM294。从所选择的转化株中分离出质粒，质粒pXX-22是用它的限制性图进行鉴别的(图7)。
然后用经SnaBⅠ切割的pXX-22转化解脂亚罗威阿酵母ATCC20774，以便通过如上面所述的pLS-3的情况测定被转化的培养菌，提供解脂亚罗威阿酵母ATCC20779和在培养基被分离的凝乳酶原。按照上述方法确定在培养液的上清液中存在着凝乳酶原。在酸活化浓缩的培养液的上清液后(见上)，在由被转化的培养菌解脂亚罗威阿酵母ATCC20779中制备的样品中观察到显著的凝乳活性。
表达/分泌质粒pXX-11的构建构建凝乳酶原表达/分离质粒pXX-11的实验步骤在图8中作了概述。这种质粒含有XPR2启动子顺序和连接编码凝乳酶原顺序的22个氨基酸残基信号肽。用于pXX-11的构建计划与用于pXX-22和pXX-33的构建计划相类似。简单说来，启动子组成片段是通过标准的连接反应，用pXHP-24中大约750碱基对HindⅢ-BglⅡDNA片段和在用HindⅢ和BamHⅠ切割后带有T4连接酶顺序的人工合成片段，该顺序为5′TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG5′→所得连接顺序通过凝胶电泳纯化，选出790碱基对HindⅢ-BamHⅠDNA片段。编码凝乳酶原残基b～151的另一个片段则是经BamHⅠ和XmaⅠ切割从pLS-3中分离出来并经凝胶纯化所得到的440碱基对BamHⅠ-XmaⅠDNA片段。第3个含有凝乳酶原结构基因的残余、XPR2终止密码子和往返运动的载体顺序的片段则是通过用HindⅢ和XmaⅠ切割pLS-3并经凝胶纯化的大约8.0仟碱基载体片段进行制备的。然后将3个DNA片段用上述标准方法进行连接。连接反应用于转化大肠杆菌K12菌株MM294。从所选择的转化株中分离出质粒，质粒pXX-11用它的限制性图进行鉴定(图8)。从质粒的XPR2-凝乳酶原部分编排的顺序确定人工合成DNA和所需片段的适当连接。
然后用经过SnaBⅠ切割的pXX-11转化的解脂亚罗威阿酵母ATCC20774，通过如上面所述的pLS-3方法测定被转化过的培养液，给出解脂亚罗威阿酵母20778和分泌在培养基中的凝乳酶原。按照上述方法，确定在培养上清液中存在着凝乳酶原。
凝乳测定(见上)表明，在含有pXX-11的转化株ATCC20778的培养上清液中存在着明显的凝乳活性。
实施例二 连接台的构建对应于ATCC20774中的bio-6等位基因的野生型BIO基因按如下方法通过互补进行无性繁殖。构建了部分经Sau3A消化插入pLD40的BamHⅠ部位(这是在EcoRⅠ部位上的pBR322+LEU2)的解脂亚罗威阿酵母染色体DNA的基因库，制备了大量DNA库作为混合培养大肠杆菌质粒的准备(这是与用于无性繁殖XPR2基因相同的DNA库)。用酶ApaⅠ(在LEU2区进行一次切割)能消化几微克的DNA库，通过将转化混合物涂覆在缺亮氨酸的人工合成培养基上，用该DNA转化ATCC20774(leu2 xpr2 bio)。获得几万个不依赖亮氨酸的转化株。为了得到含有包括BIO基因的质粒库的菌落一如有需要-也可以把不依赖亮氨酸的转化株由平板影印培养转到含有生物素选择培养基的琼脂平板培养(per L配方25毫克脱硫生物素，20克葡萄糖，5克硫酸铵，1克KH2PO4，0.5克Mg SO.7H2O，0.1克CaCl2，0.1克NaCl，500微克硼酸，400微克硫胺素HCl，400微克ZnSO47H2O，400微克MnSO4H2O，200微克Na2MoO42H2O，200微克FeCl3·6H2O，100，微克KI和40微克CuSO45H2O)。
一种生长在生物素选择培养基上的解脂亚罗威阿酵母BIO+转化株，取名为DL31。我们着手回收含有解脂亚罗威阿酵母菌株DL31中BIO基因的基因库质粒。从培养菌株DL31中制备染色体DNA。用限制性酶ApaⅠ切割质粒库就能消化几微克这种染色体DNA。将被消化的DNA的整分部份用于连接反应，使未知的质粒库构成圆形。然后将连接混合物用来转化抗氨苄青霉素的大肠杆菌的培养，以回收进入大肠杆菌的含有BIO的未知质粒。获得了少量的抗氨苄青霉素的大肠杆菌转化株。小的质粒的制备也是在大肠杆菌转化株上进行的。这样得到的质粒DNA的限制性消化呈现出含BIO的未知质粒，作为例外的是有等量于pLD40的插入BamHⅠ部位。这种质粒开始一定来自我们的基因库，取名为pLD51。
质粒pLD56是通过去除pLD51中的LEU2基因作为pLD51的亚无性系而产生的，介绍如下。用酶EcoRⅠ消化质粒pLD51的整分部份，以去除LEU区。被消化的DNA用于DNA的连接反应，使质粒再呈圆形。然后完成大肠杆菌的转化，使含有BIO的较小质粒进行无性繁殖。有一种抗氨苄青霉素的大肠杆菌转化株表明含有能期望的较小质粒，取名pLD56。完成了pLD56的一些限制性消化。含有BIO的pLD56片段，在pBR322的BamHⅠ部位存在一个插入物，长约3.6仟碱基。
一张非常粗仿的解脂亚罗威阿酵母DNA的3.6仟碱基插入物插入pBR322的BamHⅠ部位(与pLD56相比较)限制性图将在下面予以介绍，圆括号内的数据表示碱基对从插入开始的近似距离。量值的估计是从少量琼脂糖得出的，量值的误差相当大PvuⅡ(800)，PvuⅡ(1200)，PstⅠ(1800)，MluⅠ(2000)，PstⅠ(2300)，EcoRV(2700)，NcoⅠ(3200)(取向pBR322的SalⅠ部位居于所介绍的各部位之先，HindⅢ在他们之末)。
菌株ATCC20774(MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002)是用完整的pLD56(pBR322+含有BIO基因的解脂亚罗威阿酵母染色体DNA的近似值3.6仟碱基)。对3个不依赖生物素的不同转化株与其亲代菌株作比较，进行NruⅠ切割(以pBR322为目标)pLD40(在pBR322上的LEU2)高频率转化试验，以测定其所含的被整合到BIO区的固有的pBR322。因为pLD40都整合到固有的pBR322中，所以3个转化株都显示出高频率转化。这已由南方斑渍杂交试验所确认。3个原始的解脂亚罗威阿酵母BIO转化株中有一株取名为DL118并进一步用作DNA感受体。上述的限制性图需要确定(1)以什么作为BIO特殊杂交的探针(一个NcoⅠ-PvuⅡ碎片);(2)需要用哪种酶来准确地切割pLD56质粒(MluⅠ);(3)哪个酶只在pBR322部分中进行一次切割(ClaⅠ);和(4)哪种酶完全不能切割质粒(ApaⅠ)。ATCC20774和DL118(已用BIO片段探测)中DNA的ClaⅠ和ApaⅠ消化的南部杂交表明，正如预料的一样，DL118的生物素区(在与ATCC20774的BIO区相比较时)是被附加的近似于pLD56大小的DNA破坏了。DL118DNA的MluⅠ消化(已用pBR322进行探测)进一步表明附加的DNA与完整的pLD56同样大小。
表达/分泌质粒pLX-34的构建构建的表达质粒把带有XPR2分泌信号(157个氨基酸前原顺序)的凝乳酶密码顺序置于LEU2启动子的下游。这种表达质粒显示出除了XPR2启动子外的启动子也可用来成功地分泌异源蛋白质。此外，这种表达载体能够实现解脂亚罗威阿酵母基因组中整合部位的表达/分泌的独立性。成功地地分泌带有除了XPR启动子外的其他启动子的凝乳酶原说明为了鉴定解脂亚罗威阿酵母中另外新的更强的启动子构建表达载体的可能性。此外，这种方法能够用来获得表达培养物，该培养物具有两个分离的杂交凝乳酶原基因，一个由LEU2启动子表达，另一个由XPR2启动子表达，被分别连接在宿主基因组中不同的部位上。
构建表达载体的试验步骤在图13中已作了概述，该载体含有凝乳酶原基因，带有用LEU2启动子顺序表达的碱性蛋白酶分泌信号(157个氨基酸的XPR2前原顺序)。构建这种质粒是从制备LEU2启动子片段着手的，该片段含有上述β-异丙基苯果酸脱氢酶基因的ATG转译起始密码子前的5′未转译的顺序大约300碱基对(图12)。从作往返移动的载体pLD40中分离出为LEU2启动子顺序的270碱基对部分编码的300碱基对HindⅢ-FoKⅠDNA片段。这个片段用T4连接酶与54碱基对连有下列顺序的人工合成连接子连接，-Leu2-FokⅠ5′-ATACAACCACACACATCCACAATG3′-TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC-Xpr2-BglⅠAAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3′TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC-5′然后用HindⅢ进行消化。所得连接顺序再用凝胶电泳分离大约360碱基对的HindⅢ-BglⅠDNA片段进行纯化。编码XPR2前原顺序的残余和凝乳酶原的前152个氨基酸残基的另一个组成片段是从表达质粒pXX-33(图6)经BglⅠ和XamⅠ切割分离出来的，再用凝胶纯化得到887碱基对DNA片段。第三个片段含有凝乳酶原基因的残余、XPR2终止密码子和载体顺序，它是通过HindⅢ和XmaⅠ切割pXX-33，再经切割大约8.0仟碱基载体片段再经凝胶纯化制备得到的。将这三个DNA片段用上述标准方法连接。连接反应用于转化大肠杆菌K12菌株HB101。从在抗氨苄青霉素基础上选出的转化株中分离质粒，质粒pLX-34用它的限制性图(图13)进行鉴定。
用经NruⅠ切割的pLX-34DNA来转化解脂亚罗威阿酵母ATCC20794(DL118)，以提供解脂亚罗威阿酵母ATCC20795(DL251)，并按上述pLS-3测定由不依赖亮氨酸的转化株培养菌分离到培养液中的凝乳酶原。这种转化方法是控制把pLX-34整合所先前已被引入宿主染色体中的bio位点上的pBR322顺序(如上所述)。pLX-34在这个部位上的整合是用南部分折予以确定的。
用DL118作为受体南部杂交试验按下述方法进行从DL118的转化株中的DNA的NruⅠ消化，(例如当参入质粒是凝乳酶原表达质粒时，就与凝乳酶原探针杂交)。精确地切割了参入质粒。几毫微克的NruⅠ消化的转化质粒可以检查杂交带的正确的大小，由这些转化株(已用32P标记的pBR322进行探测)中的DNA的MluⅠ消化(在转化质粒中MluⅠ不切割)也说明DL118固有的pBR322顺序是由于加入了一个或二个以上的转化质粒的分子才被破坏的。这证明整合是在理想的部位上发生的。
将转化株培养菌解脂亚罗威阿酵母ATCC20795(DL251)置于YEPD培养基中生长，22℃，以利于LEU2启动子的表达。在培养物上清液中存在的凝乳酶原是用酸活化培养物上清液的凝乳测定(见上)预以确定的并经免疫斑点分析(见上)鉴定。上述结果说明，这个杂交基因是一个独立的表达单位，当其在除了XPR2或LEU2外的其他部位上被整合时，是能够表达/分泌的。这个性质可以用多重杂交基因构建表达培养菌，它具有实现高水平的细胞外凝乳酶原的潜在能力。
实施例三 用于人体C5a的人工合成基因的顺序设计实现细菌产生人体过敏毒素C5a的计划如在欧洲专利申请0147178号中所述，类似于以前用于合成和表达表皮生长因子(EGF的方法。采用构建一个基因，人工合成活化补体组分C5a的密码顺序。给出已知的人体C5a的氨基酸序列，我们设计一个编码其74种氨基酸信息的DNA片段(图9)。选择人工合成基因顺序以扩大大肠杆菌和啤酒酵母最佳密码子的利用并可使限制性核酸内切酶的有些部位便于利用。这项探索可以通过编码在C5a多肽的第一个氨基酸的三联体之前引入蛋白质合成的ATG起始密码子，在大肠杆菌的过敏毒素内直接表达。为便于在理想的位置上插入质粒pBR322，设计的人工合成C5a基因在其终止区含有EcoRⅠ和HindⅢ限制性核酸内切酶的识别部位。为了获得C5a基因顺序，通过phosporamidite方法合成10个47-聚体并且集中在235碱基对双股DNA片段。将C5a基因片段插入到被适当切割的pBR322中并从随机挑选的转化株中通过DNA质粒的限制性切割分析来鉴定克隆基因。然后采用DNA顺序排列分析若干C5a克隆，鉴别出一个带有适宜顺序的克隆。在被检查的5个克隆中有2个找到了按计划确定的C5a基因区的核苷酸顺序。
人体C5a的细菌表达构建C5a表达质粒是从用限制性核酸内切酶EcoRⅠ切割C5a亚克隆着手的，然后用细菌碱性磷酸酶处理脱磷酸化。用从含有trp启动子一操纵子和核糖体结合部位顺序的pPFZ-R2中的360碱基对EcoRⅠDNA片段，构建C5a表达质粒。用连接反应转化大肠杆菌菌株HB101的补体细胞。对各个转化中的一些抗药性菌落进行纯化并对它们的DNA质粒进行限制性核酸内切酶描图分析，以鉴定在能导致C5a基因转录的位置上带有trp启动子的那些表达质粒。在要求直接表达C5a的构型中，用含有靠近细菌启动子顺序的过敏毒素基因的质粒来鉴定上述连接反应中的多重分离物。C5a表达质粒pC5a-48的限制性图见图10。
人体过敏毒素在解脂亚罗威阿酵母中的表达和分泌编码分泌人体过敏毒素C5a的表达/分泌载体pC5aX-3的制备技术如实施例一有关pXX-33部分。然后将解脂亚罗威阿酵母ATCC20774通过这个分泌载体转化并测定由转化培养菌产生的人体C5a，除了山羊抗C5a和家兔抗山羊免疫球蛋白G用于免疫斑点测定方法，其余如上所述。本实施例所述的质粒，是确定C5a存在于培养基上清液中。
表达和分泌质粒pC5aX-3的构建构建过敏毒素的表达/分泌质粒pC5aX-3的实验步骤在图11中已作了概述。这个质粒含有“完整”的XPR2启动子的顺序、157个氨基酸残基信号以及与为74个C5a氨基酸残基编码的人工合成顺序连接的前肽。pC5aX-3的构建计划类似于pXX-33。首先，用HindⅢ和AvaⅠ切割质粒PXHP-24(或含有所需顺序的另一个质粒)，凝胶纯化含有XPR2启动子的1150碱基对片段。另一个片段含有XPR2肽原的3′端和C5a结构基因顺序，是借助T4连接酶通过标准连接反应，用大肠杆菌表达质粒pC5a-48中的约220碱基对HinfⅠ-HindⅢDNA片段和带有下列顺序的人工合成片段，然后再用AvaⅠ和HindⅢ进行切割得到的。
5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA5′连接顺序通过凝胶电泳纯化，选出大约250碱基HindⅢ-AvaⅠ片段。HindⅢ-AvaⅠ片段含有启动子，AvaⅠ-HindⅢ片段是用于C5a的编码，把2个片段用T4连接酶连接，然后用HindⅢ消化。约1.4仟碱基片段进行凝胶纯化并且用经HindⅢ切割的pterm4(如上所述)连接。连接反应用来转化大肠杆菌K12菌株MM294。从所选的转化株中再分离选出抗氨苄青霉素的质粒，质粒pC5aX-3用其限制图进行鉴定。然后将解脂亚罗威阿酵母菌株PC-30869ATCC20774用由SnaBⅠ切割的pC5aX-3进行转化并按上所述测定由转化的培养菌分泌在培养基中的过敏毒素。用上述的方法确定上清液中存在的C5a。
人们认为由核糖体与内质网结合而合成的许多蛋白质是的糖蛋白形式产生的。实际上，糖基化可影响给定的蛋白质的分泌。真核生物蛋白质的N-链糖基化作用发生在3肽顺序上的天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-丝氨酸，X可以是除了可能的天冬氨酸外的任何一个氨基酸(Hubbard，S.等，1981，Ann.Rev.Biochem.50;555)。凝乳酶原的氨基酸顺序包括这样两个肽顺序，所以对分泌在解脂亚罗威阿酵母培养基中的凝乳酶原进行的凝胶电泳分析证明糖基化作用并不明显。在另一些被分泌的真核生物蛋白质中，也并不是所有的天冬酰胺-X-苏氨酸/丝氨酸部位都被粒基化了。很可能三肽顺序内的某些天冬酰胺并不糖基化，因为他们对糖基化酶难以接近。
关于人体C5a，氨基酸顺序包括单个糖基化部位或3肽顺序(天冬酰胺-异亮氨酸-丝氨酸)，通常处理与天冬酰胺相连的复合低聚糖(Fernandez，H.等，1976，J.Immunol.117，1688)。被分泌到解脂亚罗威阿酵母培养基中的部分C5a分子呈现糖基化，因为抗原活性的宽区是在免疫班点分析的高分子量部分。这种异源蛋白质的电泳迁移率与所观察的其他被分泌的蛋白质的电泳迁移率相类似，可能是由于所加的碳水化合物不同程度所致。在本发明中，某些被分泌的异源蛋白质的明显糖基化启示人们，解脂亚罗威阿酵母的表达和分泌对产生许多正常的糖基化的真核生物的蛋白质将是有用的。
＊从XPR2转化株DL112回收质粒的图解说明(参阅图1)。各个标记区是(从左到右)解脂亚罗威阿酵母未排列成顺序，EcoRⅠ部位与连接解脂亚罗威阿酵母DNA(以前为BamHⅠ部位)之间的小片段pBR322，解脂亚罗威阿酵母LEU2基因，pBR322的大片段，和排列成顺序的XPR2的突变等位基因。“B”是BglⅡ部位，“E”是coRⅠ部位。用线条表示回收的3个质粒，它们在BglⅡ部位的末端连接成环形分子。
权利要求
1.一种通过解脂亚罗威阿酵母培养菌，产生和分泌异源蛋白质的方法，包括①将表达载体引入所述的解脂亚罗威阿酵母中，表达载体包括编码异源于所述解脂亚罗威阿酵母、解脂亚罗威阿酵母基因或解脂亚罗威阿酵母启动子、解脂亚罗威阿酵母基因的信号和转录终止密码子DNA顺序的蛋白质的DNA顺序。②将所产生的①的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养；和③回收异源蛋白质。
2.一种通过解脂亚罗威阿酵母培养菌，产生异源蛋白质的方法，包括①将表达载体引入所述解脂亚罗威阿酵母，表达载体包括与解脂亚罗威阿酵母异源的蛋白质的DNA编码和至少下述之一的表达载体;LEU2基因及其启动子或终止密码子顺序、XPR2基因、启动子、信号、prol-、pro2-或XPR2基因的终止密码子顺序;②将所产生的①的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养;和③回收该异源蛋白质。
3.根据权利要求
2所述方法，其中所述基因是XPR2基因或LEU2基因。
4.根据权利要求
3所述方法，其中所述异源蛋白质DNA顺序是凝乳酶原或人体过敏毒素C5a顺序。
5.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC-20780鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。
6.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20779鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。
7.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20778鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。
8.一种产生异源蛋白质的方法，包括将具有ATCC20777鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株置于适宜的营养培养基中进行培养。
9.根据权利要求
3所述的方法，其中异源蛋白质基因被插在XPR2基因的启动子和终止密码子顺序之间。
10.根据权利要求
7所述的方法，其中异源蛋白质的基因是凝乳酶原或人体过敏毒素C5a基因。
11.一种制造不产生碱性蛋白酶的解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括用XPR表达结构转化解脂亚罗威阿酵母的XPR+菌株。
12.一种检测具有在XPR2基因上整合的载体DNA的解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括①用XPR表达结构转化解脂亚罗威阿酵母的XPR+菌株;②筛选在失去碱性蛋白酶活性①中产生的转化株。
13.根据权利要求
12所述方法，其中XPR+解脂亚罗威阿酵母菌株是用未切割的质粒PLS-3DNA或用Sna BⅠ消化的pls-3DNA转化的。
14.根据权利要求
12所述方法，其中所述解脂亚罗威阿酵母具有解脂亚罗威阿酵母ATCC20688鉴别特征。
15.制备解脂亚罗威阿酵母转化株的方法，包括将表达载体整合到含有与异源载体DNA同系区的解脂亚罗威阿酵母转化株，所述同系区包括在所述解脂亚罗威阿酵母整合转化期间用作信息接受部位的外源DNA。
16.产生异源蛋白质的方法，包括在适宜的营养培养基中培养具有ATCC20795鉴别特征的解脂亚罗威阿酵母转化株。
17.产生异源蛋白质的方法，包括培养含有与异源载体DNA同系区的解脂亚罗威阿酵母转化株，所述同系区包括在所述解脂亚罗威阿酵母整合转化期间用作信息接受部位的外源DNA。
18.根据权利要求
17产生异源蛋白质的方法，其中同系区是由pBR322衍生物的或是它的一个衍生物。
19.制造质粒pXX33的方法，包括用HindⅢ-AvaⅠ切断质粒pXHP-24，以产生1150碱基对片段。分离所述片断。在存在T4连接酶条件下，用合成DNA片段连接在所述片段，5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG5′用HindⅢ-BamHⅠ切断由此产生的连接产物，以产生1196碱基对片段，分离所述的1196碱基对片段，在T4连接酶存在下，用由BamHⅠ-XmaⅠ切断质粒pLS3得到的440碱基对片段和由HindⅢ及XmaⅠ切断质粒pLS3得到的～8.0碱基对片段连接所述的1196碱基对片段，用由此产生的连接产物转化大肠杆菌，挑选抗苄青霉素的转化株和从所述转化株中分离质粒pXX33。
20.制造质粒pXX22的方法，包括用HindⅢ-BglⅡ切断质粒pXHP24，以产生890碱基对片段，分离所述片段，在有T4连接酶存在下，用合成DNA片段连接所述片段，用HindⅢ-BamHⅠ切断此产生的连接产物，以产生920碱基对片段，分离所述920碱基对片段，在有T4连接酶存在下，用由BamHⅠ-XmaⅠ切断质粒pLS3得到的440碱基对片段和由HindⅢ-XmaⅠ切断质粒pLS3得到的～8.0仟碱基片段连接所述的920碱基对片段，用由此产生的连接产物转化大肠杆菌挑选抗氨苄青霉素的转化株，和由所述的转化株分离质粒pXX22。
21.制造质粒pXX11的方法，包括用HindⅢ-BglⅡ切断质粒pXHP24，以产生750碱基对片段，分离所述片断，在有T4连接酶存在下，用合成DNA片段连接所述片段，5′TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG5′用HindⅢ-BamHⅠ切断由此产生的连接产物，以产生790碱基对片段，分离所述790碱基片段，用由BamHⅠ-XmaⅠ切断质粒pLS3得到的440碱基对片段和由HindⅢ-XmaⅠ切断质粒pLS3得到的～8.0仟碱基片段，在有T4连接酶存在下，连接所述的790碱基对片段，用由此产生的连接产物转化大肠杆菌。挑选抗氨苄青霉素的转化株，和从所述的转化株中分离质粒pXX11。
专利摘要
解脂亚罗威阿(YARROWIA LIPOLYTICA)的XPR2和LEU2基因顺序的排列，重组体解脂亚罗威阿无性繁殖的载体，包括编码表达哺乳动物蛋白质和其他多肽的异源DNA；用XPR2基因启动子、碱性蛋白质前源区和XPR2终止密码子区等整合表达载体，能够在已转化的解脂亚罗威阿的细胞培养物中表达和分泌细胞外异源蛋白质；解脂亚罗威阿转化株包括所述的载体和质粒；并提供制备载体的方法。
文档编号C12N15/62GK86106522SQ86106522
公开日1987年9月16日 申请日期1986年10月17日
发明者兰斯·史蒂文·维多, 约翰·罗伯特·德齐, 阿瑟·欧内斯特·弗兰克 申请人:美国辉瑞有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan