专利名称:制备新的耐热的转葡糖苷酶方法
本发明是关于从Talaromyces duponti中制备转葡糖苷酶的新方法。该转葡糖苷酶，十分耐热，能用于把麦牙糖转化成4-α葡糖基麦牙糖和异麦牙糖。
转葡糖苷酶(也已知为1，4-α-D-葡聚糖-6-α-D-葡糖(基)转移酶和转葡糖基酶)已从各种微生物中获得。这是一种酶，它能从麦牙糖中由键裂和键的形成而引起三糖酶4-α-葡糖基麦牙糖和二糖异麦牙糖的形成。这些低聚糖是不发酵的，故能用于食品、软质饲料和其它工业，也用于新食品配制上。例参阅Nunokawa等，日本专利号Sho.56(1981)-27236。他们叙述了一种方法，该方法是用Aspergilluo Sairoi或A.Vsami培养的一种菌株生产转葡糖苷酶和葡糖淀粉酶。培养物滤液是被经过一个保留转葡糖苷酶的树脂贮存柱，同时葡淀粉酶进入流出液。于是转葡糖苷酶和乙酸缓冲液，pH5.5，便一起从树脂中被去除。同样，Pazur等在“一种霉菌的转葡糖基酶的作用方式和分离中”，摘自生化和营养料，Nebraska、Lincoln、Nebraska等大学，生物化学和生物物理的案卷保管处，93卷，43-49(1961)页中，叙述了一种方法来获得Asperqillus Niger的转葡糖基酶，包括在二乙氨基乙基纤维素、淀粉和羧甲基纤维素上，用色谱和吸附法，从其它共同生成的糖酶中来分离这种酶。
另一方面，Tamura等在美国专利号4，247，637中，叙述了一种从Talaromyces duponti菌株中生产耐热的葡糖淀粉酶方法，包括，在一种营养培养基中，培养菌株和分离酶。当它们培养出菌株和用过滤去除菌类之后，把它们通过有活性粘土的滤液，并能在流出液中找到葡糖淀粉酶。
即使不去识别Tamura等所提的一切，也不去管一种十分耐热的转葡糖苷酶，Talaromyces duponti也会分泌出转葡糖苷酶。
同样，现在科学家们已经发现，在一种适当营养介质中，培养Talaromyces duponti细胞，便能制备出耐热的转葡糖苷酶。
本发明提供了一种制备转葡糖苷酶的方法，包括在一种适当的营养生长介质中，培养Talaromyces duponti的菌株和分离转葡糖苷酶。本发明也提供了由T.duponti一种真菌生成的转葡糖苷酶。
本发明是专门关于从真菌类T.duponti中获取转葡糖苷酶的酶。这种酶是，在这种微生物的一种营养生长介质中，由发酵生成。这种酶在发酵过程中被分泌出来之后，生物量可用任何一种液体或固体分离技术来从发酵液体培养基中去除，如过滤法或倾析离心法来得到一种含酶溶液。
一般来讲，凡是能用于培养一般霉菌的介质都可用来作为T.duponti发酵的营养源。各种炭源是众所皆知的，它们可选自淀粉、糖蜜、糠米等等。氮源也是一般皆知的，诸如大豆、棉花籽、胨、玉米浆、酵母膏等等。硫酸盐或氯化物盐也被用于发酵介质，如硫酸镁、氯化钙、氯化钠和氯化钾。磷酸盐也常被应用因为它们常可用作缓冲剂。另外，发酵的pH值是可以调节的，最好是很接近中性的范围，用的碱如氢氧化钠或氢氧化钾;用的酸如盐酸或醋酸。
pH的条件、时间和温度，在培养霉菌的工艺上是从所皆知的，pH必须是在约3-9的范围内，最好在约5-8的范围内。培养介质的一种很佳的pH是十分接近中性。发酵可在任何地方进行，大致为2天至10天，最好是约4天至8天。温度必须是在约25℃-50℃之间，最好是在30℃-45℃之间。最合适的生长温度是介于40℃左右。
凡属于生成转葡糖苷酶的Talaromyces duponti类的真菌都能用于本发明。在一个很佳的实施例中，所用的T.duponti菌株是贮存在发酵研究院，工业科技所，西巴城，日本，在FRI登记，登记号为4566。人们意外地发现，由这种特殊真菌的菌株生成的转葡糖苷酶是特别嗜热的，这可从下例见到。FRI4566突变型菌株也能应用。Talaromyces duponti的鉴定，在“嗜热的真菌”一书中由Cooney和Emerson进一步阐述;“在Trans.Mycol.Soc.，”日本，第14卷中由Awao和Mitsuqi阐述。另外，在美国专利4，247，637中也详细地引证了这种菌株和它的繁殖。
在一种适当的营养介质中，T.duponti的培养已经达到细胞团所需的状态后，生物量可用任何一种液体或固体分离法来去除，如过滤法或倾析离心法。溶液中含有酶，即被浓缩、沉淀或合并过的滤液或上清液。举例来讲，溶液可用一般方法来浓缩，诸如超滤作用或蒸发。然后，从浓缩物中沉淀酶(或从未经浓缩的溶液中沉淀酶)，在加入无机盐的状况下，使其成为块状或稀浆，无机盐可以是硫酸胺、或硫酸钠，或也可加有机溶剂，诸如甲醇、乙醇，或丙酮。在含酶块沉淀出来之后，它会在一种溶液里变成稀浆，诸如水或缓冲过的水，从上述的水中提取和溶解这种酶就能得到一种含酶的提出物。因为pH的选择洗提，下面还要进一步述及，最好是用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲(pH8.0)作提取剂来溶解这种酶，然后需透析含酶缓冲提取物，最好是过夜。
含转葡糖苷酶的溶液，无论是用浓缩法获得，，或者用沉淀法获得，或者用以上一段所述的取合方法获得，都需经过提纯处理，处理可用粘土、色谱法、或它们的一些联合方法。
举例来讲，色谱法的进行，是把含转葡糖苷酶溶液通过一个二乙氨乙基纤维素(DEAE-纤维素)柱管，并保持适当的pH数值。含转葡糖苷酶溶液必须缓冲至约7-9的pH数值，最好保持在8，上述柱管必须被平衡在约7至9的pH数值，更好是8。而最好是用柠檬酸钠-磷酸盐缓冲来完成(pH数值约为8.0)。在pH数值约为7至9，最好是8，转葡糖苷酶将存在于流出水分馏物中，而其它不纯物如葡糖淀粉酶则仍留于柱管内。另外的转葡糖苷酶可通过清洗柱管来回收，可用更多的缓冲液，其用量至少跟DEAE纤维素同量。生成物是一种基本上不含葡糖淀粉酶和其它不纯物的转葡糖苷酶。
另外，把生物量从营养生长介质中去除掉以后，可用任一种固体或液体分离技术如上述的各种方法来提供含转葡糖苷酶溶液，那么，转葡糖苷酶苷酶便能从这溶液里分离出来，该溶液里祗要加上粘土，最好是微粒皂土，适当的pH数值，最好在3-5间。用粘土处理法来从一种溶液中移出转葡糖苷酶，该溶液从Aspergillus或Rhizopus中，同时含有转葡糖苷酶和葡糖淀粉酶，这在美国专利文献第3，042，584中已经公布。
转葡糖苷酶与粘土形成一种反应产品，凝结和沉淀在溶液的底下，葡糖淀粉酶则留在溶液中。反应产品可用任何一种标准固体或液体分离技术从溶液中分离出来，随后用洗提液把转葡糖苷酶从粘土中洗提出来，该洗提液外面范围有一pH数值，在这个数值范围内，最好是一种中性的或碱性的pH数值，粘土和转葡糖苷酶形成一种沉淀物。
从Talaromyces duponti中获得的转葡糖苷酶是很耐热的。举例来讲，在60℃，活性最适宜的pH是约4.5至5.0。被净化过的转葡糖苷酶的适宜温度是70℃。
按照本发明，来自T.duponti中的转葡糖苷酶的热减活化作用，在70℃时，已与来自Aspergillus Niger中的转葡糖苷酶的热减活化作用相比。尤其，在70℃仅经过60分钟，来自A.Niger中的转葡糖苷酶就完全减活，其实，来自T.duponti的转葡糖苷酶，活性的40%以上仍然保留着。这些嗜热的特性将在下列的A、B、C表中进一步详细叙述。
本发明的转葡糖苷酶可应用于把麦牙糖转化成三糖4-α葡糖基麦牙糖和二糖异麦牙糖，它们都是非发酵的糖。这些非发醇的低聚糖的形成可由培育一种含麦牙糖溶液和转葡糖苷酶来进行。可发酵的糖，葡萄糖也在系统中形成，以及一些残余的麦牙糖也基本上存在于生成物。进行1-6天的培育，温度在50-70℃，pH数值保持在酸性的范围。在一个极佳的实施中，培育可在60℃进行72个小时和pH4.5(0.1M醋酸钠缓冲)。
下面的例子说明本发明的最佳实施，且在本例中，所公布的实施例并不限止权利要求
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实例在一个发酵罐里，加10升液体发酵介质，包括5%可溶的Lintner淀粉、2%玉米浆、0.5%药物介质(由Trade Protein Co.供应的一种棉籽粉)、0.5%酵母膏(由Difco Laboratories，Detroit，Michigan供应)、0.1%磷酸二钾盐、0.05%硫酸镁和0.01%氯化钙，与氢氧化钠一起调至pH7.0。
制备五种种子培养物，从发酵罐中取出5分100ml等分试样介质，把每分等分试样置于一个500ml的锥形瓶内，在121℃中，高压消毒五分等分试样二十分钟，以达到灭除介质中的细菌。随后把每分灭菌试样与Talaromyces dupenti菌株FRI4566接种，并在一个旋转摇动器内;温度保持在40℃，摇动六小时，再把五分试样合成约500ml的液体。介质的残余部分，在温度121℃中，在发酵罐中加热二十分钟，再与500ml的T.dupenti菌株4566接种，并在40℃中，搅拌7天。发酵的终止，菌丝通过过滤，全部从发酵培养基中去除，并得到一种无细胞的过滤液。
把固态硫酸胺加到70℃饱和的滤液中，来沉淀稀浆。沉淀物是用离心法回收，随后用上清液倾析。各种酶便从沉淀物中溶解于200ml0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液中(pH8.0)并在同一缓冲液中透析过夜。透析试样通过一个DEAE-纤维素管柱，该管柱已跟0.1M柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液(pH8.0)平衡。管柱用另外的缓冲液(pH8.0)洗涤，溶量相当于DEAE纤维素的二倍。转葡糖苷酶便能从流出液部分中找到，而葡糖淀粉酶和其它不纯物跟DEAE纤维素仍然留在管柱内。郁积部分的转葡糖苷酶，可用去离子水透析过夜。聚丙烯酰胺凝胶电泳可在一玻璃管(0.5×7cm)内施行，每支玻璃管内含7.5%凝胶和2毫安电流，按照下列方法，在三-甘氨酸缓冲液(pH8.3)中，保持室温达1.5小时。该法是B.J.Davis所述，在“Annals New York Acad.sci。”，121卷，404页，(1964)。被分离的转葡糖苷酶试样基本上是纯的。
被纯化的转葡糖苷酶试样，部份用作鉴定，部分用来作为4-α-葡糖基麦牙糖的形成。转葡糖苷酶活性的鉴定是基于一种转葡糖基酶的液体色层谱的定量测定，即4-α-葡糖基麦牙糖在酶和麦牙糖的培育混合物中，pH4.5，温度为60℃，这是一种改性法，该方法，Pazur等在“生物化学和生物物理的案卷里，”93卷，43-49页(1961)中已经述及。转葡糖苷酶活性的单位是由一定酶的数量来定，该酶在pH4.5和60℃，从20%重量/容量(W/V)麦牙糖溶液中，每小时生成一微摩尔的4-α-葡糖基麦牙糖。在滤液中，转葡糖苷酶的活性被发现为每毫升为20单位。从麦牙糖中形成非发酵的低聚糖的方法如下把4.0ml，25%麦牙糖溶液(pH4.5)与1.0ml酶溶液(2.6v/ml)培育72小时，温度为60℃，pH4.5(与0.1M醋酸钠缓冲)。用气体色层谱测得碳水化合物的剖面如下22.6%葡萄糖，46.4%麦牙糖，6.5%异麦牙糖和24.6%4-α-葡糖基麦牙糖。
这转葡糖苷酶能与来自Aspergillus niger的转葡糖苷酶相比。来自A.niger的数据是摘自上一段所述的Pazur等的方法。在表A中，这酶活性的适当pH是约4.5-5.0，温度60℃，而来自A.niger转葡糖苷酶的pH3.5，温度30℃。表B显示在转葡糖苷酶活性上温度的作用。被净化过酶的适当温度是70℃。表C比较来自T.dupenti和A.niger，在70℃，转葡糖苷酶的热失活曲线。在本表中，现在这种酶要比来自A.niger的转葡糖苷酶更耐热。
表A在转葡糖苷酶活性上pH的作用有关活性(%)pH2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 7.0T.duponti转葡糖苷酶 - - - 58 71 100 98 84 61 44A.niger 51 78 84 100 73 56 51 - 21 -转葡糖苷酶测定活性，温度在60℃，用20%(W/V)麦牙糖为基质缓冲液pH3.5-5.0∶0.1M醋酸钠pH6.0-7.0∶0.1M3-醋酸盐本数据资料摘自J.P.Pazur和Tadakiko Ando”生物化学和生物物理的案卷，93，43-49，1961，测定活性在30℃，用20%(W/V)麦牙糖为基质。
表B关于在T.dupenti转葡糖苷酶活性上温度的作用，该酶活性系，在pH4.5，用0.1M醋酸钠为基质与麦牙糖缓冲。
温度(℃) 相对活性(%)40 12.650 24.460 48.970 100.080 64.990 0.0表C转葡糖苷酶的热稳定性＊转葡糖苷酶，在70℃，经特定时间培育后的残余活性T.dupenti 最小值 15 30 45 60 120转葡糖苷酶 78.5% 68.8% 62.4% 41.9% 32.2%(pH4.5)A.niger 17.2% 6.3% 4.7% 3.1% 0%转葡糖苷酶(pH4.0)＊转葡糖苷酶热稳定性的测试法，在70℃，无需基质，可在0.1M的醋酸缓冲液中进行，(pH分别为4.5和4.0)。
权利要求
1.一种制备转葡糖苷酶的方法，它包括在一种适当的营养生长介质中，培养一种Talaromycesduponti菌株和从其中分离转葡糖苷酶。
2.根据权利要求
1的方法，其中T.duponti的菌株与FRI4566视为同一的。
3.根据权利要求
1的方法，其中转葡糖苷酶是从营养生长介质中分离出来的，即a)从营养生长介质中去除生物量，来获得一种含转葡糖苷酶的溶液;b)处理溶液，对块状的含转葡糖苷酶进行沉淀，随后从中提取转葡糖苷酶，便可获得一种含转葡糖苷酶的提出物;c)净化含转葡糖苷酶的提出物;d)从葡糖淀粉酶和其它不纯物中，回收净化过的转葡糖苷酶。
4.根据权利要求
3的方法，其中先用(b)的步骤，或随后再用浓缩法。
5.根据权利要求
3的方法，其中步骤(c)的净化，是把来自步骤(b)，经过处理的含转葡糖苷酶提出物，在一个适当的pH，通过一个DEAE管柱来完成，而步骤(d)是从管柱用回收含转葡糖苷酶流液来完成。
6.根据权利要求
1的方法，其中，(a)即从营养生长介质中去除生物量，来获得一种含转葡糖苷酶的溶液。(b)转葡糖苷酶是从含有转葡糖苷酶的溶液中分离出来的，即在一个适当的pH范围内，加入一种特殊的粘土来引起转葡糖苷酶与粘土形成一种反应生成物，(c)粘土/转葡糖苷酶反应生成物可用一种固态/液体分离技术从溶液中回收。
7.根据权利要求
6的方法，其中进一步包括(d)即用一种洗提液来从反应生成物中洗提出转葡糖苷酶，该洗提液外面有一适当的pH范围，能引起，在步骤(b)，粘土/转葡糖苷酶反应生成物。
8.转葡糖苷酶由T.duponti类真菌生成。
9.根据权利要求
8中的转葡糖苷酶是由T.duponti FRI4566生成。
10.一种把非发酵和发酵的糖转化成麦牙糖的方法，其中包括用权利要求
1方法生成的转葡糖苷酶与麦牙糖接触。
11.根据权利要求
10的方法，其中接触麦牙糖就是主要把麦牙糖和转葡糖苷酶培育1到6天，并回收葡萄糖，麦牙糖，异麦牙糖和4-α-葡糖基麦牙糖。
专利摘要
揭示一种制备转葡糖苷酶的方法，包括在一种适当的营养生长介质中培养一种Talaromycesduponti菌株和分离转葡糖苷酶。也揭示了用Tduponti来生成转葡糖苷酶。
文档编号C12P19/00GK86106322SQ86106322
公开日1987年4月8日 申请日期1986年9月19日
发明者约翰·江百郡, 小奥雷斯蒂·约翰兰特罗 申请人:迈尔斯实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan