一株核桃内生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及一株核桃内生菌及其应用。
【背景技术】
[0002] -直以来，植物病虫害是威胁农业生产的主要祸手之一。化学药剂由于其见效快、 成本低、使用方便等特点而自上世纪七十年代以来，被人们大量使用，虽然对农作物的产量 提高具有重大的作用。但随着社会经济的增长，人们逐渐意识到长期大量使用农药带来的 一系列问题：首先杀伤害虫天敌，土壤中微生物的种群减少，破坏了生态平衡；其次由于常 年使用，使病原菌与害虫产生了抗药性，防治成本加大、防效降低；还有农药的残留问题，一 方面导致生态环境恶化，另一方面食物中存在的农药残留最终威胁到人类的健康。因此在 倡导环保和农业可持续性发展的今天，高效低毒低残留、与环境相容性好的生物制剂的开 发与应用已成为农药界和植保界人士研究的热点。
[0003]目前筛选生防菌及其利用其发酵产物来防治植物病虫害是生防途径之一，生防菌 通过直接抑制病原菌的生长或与其竞争生存空间，提高植株抗病虫能力等而达到防病虫害 的目的。自Weindling在1932年首次发现木霉菌对植物病原真菌的抑制作用以来，植病生 防研究取得了较大的进展，现已筛选出大量的生防菌，并开发出多种生物制剂。但有关的生 防菌株大多是从土壤、植物根际或体表分离的，室内测定具有拮抗作用的菌株，室外施用时 大多不能在寄主体表或体内正常定殖，同时受环境条件变化和不同生态条件下植物根围微 生物种群变化等因素影响，致使其生防效果不稳定，有时甚至无效。
[0004] 植物内生菌以其占据有利的生态位，不易受环境条件的影响，能够很好定殖于植 株的相应部位，抵抗病虫害入侵等独有的优势，成为植物病虫害生物防治的潜在资源菌。因 此研究和利用内生菌对于替代或减少农药与化肥的使用，改善农业生态系，保持植物微生 态系统的生物多样性，维护农田生态平衡，实现农业可持续发展都具有重要意义。
[0005]植物内生细菌是能够定殖在健康植物组织内，并与植物建立了和谐联合关系的 一类微生物。目前，已经从多种植物体内分离筛选出具有生防作用的内生拮抗细菌。其 中芽胞杆菌是主要类群之一，由于其芽胞具有耐热、抗逆等特点，易于加工制剂及度过不 良环境而受到人们的重视。据报道马英元等（甜菜白粉病内生拮抗细菌的筛选鉴定及 其防治效果的研究[刀.植物保护，2011，37(2):25-30)从高抗白粉病的甜瓜品种植株 内筛选出对甜瓜白粉病（Sphaerothecafuliginea)有较好防效的内生枯草芽胞杆菌， 张宝俊等（内生解淀粉芽胞杆菌LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性[J].植物保护学报， 2010(2) :143-147)从梨树枝条中筛选出对梨黑斑病具有拮抗作用的内生解淀粉芽胞杆 菌（Bacillusamyloliquefaciens)，欧雄常等（拮抗辣椒疫病菌的红树内生细菌筛选及 RS261菌株鉴定[J].微生物学通报，2009,36(2) :175-180)从红树内分离筛选出对辣椒疫 霉菌（Phytophthoracapsici)有较好拮抗作用的内生解淀粉芽胞杆菌RS261。窦瑞木等 (透骨草内生细菌生理生化特性及抑菌效果研究[J].河南农业科学，2008,5:79-81)从中 草药透骨草中筛选出对灰霉菌（Botrytiscinerea)有抑制作用的内生枯草芽孢杆菌。
[0006] 由胶孢炭疽菌（GloeosporiumfructigenumBerk.)引起的核桃炭疽病是危害核 桃果实和叶片的重要病害，据报道分布在我国多个核桃产区，造成落果落叶，对核桃产量和 品种造成重要的影响。本专利以核桃炭疽病菌（GloeosporiumfructigenumBerk.)作为 目标菌，从核桃的青皮中分离筛选具有抑菌作用的核桃内生菌株。并对其分类地位、抑菌效 果和发酵条件的优化配方等进行了系统研究，为进一步开发研制生防制剂提供菌株来源。
[0007] 对核桃炭疽病化学防治的药剂生产上常用铜制剂、有机硫类、苯并咪唑类等，特 别是苯并咪唑类杀菌剂应用较多。如刘霞等（8种杀菌剂对核桃炭疽病病原菌胶孢炭 疽菌的室内毒力[J].农药学学报，2013,15(4) :412-420)通过室内筛选，建议在生产中 防治核桃炭疽病的化学药剂有咪鲜胺（prochloraz)、戊唑醇（tebuconazole)、三唑酮 (triadimefon)、代森猛锌（mancozeb)和异菌脲（iprodione)。但是如果长期和频繁地使用 某类杀菌剂，易导致抗药性的产生，防治效果下降，成本上升，并且污染环境，杀伤天敌，破 坏生态平衡，且农药残留影响果品，直接危险到人类的健康。
[0008] 筛选对核桃炭疽病菌有拮抗作用的生防菌株，王清海等（核桃炭疽病高效生防菌 株鉴定及抑菌活性[J].山东农业大学学报（自然科学版），2011，42(3) :335-337)从土壤 中分离筛选出4株对核桃炭疽病菌具有较强抑制活性的拮抗细菌，Bf-02为坚强芽孢杆菌 (Bacillusfirmus),Bs_03 为枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)，PF-1 为幼虫芽抱杆菌 (Bacilluslacivae)，PF_2为短芽孢杆菌（Bacillusbrevis)。生防菌株是从土壤和植物 根际分离的，室内测定具有拮抗作用的菌株，室外施用时大多不能在寄主体表或体内正常 定殖，同时受环境条件变化和不同生态条件下植物根围微生物种群变化等因素影响，其生 防效果往往不稳定，有时甚至无效。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是解决现有技术的不足提供一株核桃内生菌及其应用，本发明以核 桃炭疽病菌为目标菌，从核桃组织中分离筛选出对核桃炭疽病菌具有拮抗作用的核桃内生 菌。明确其分类地位，抑菌效果及其发酵条件的优化配方。为下一步开发研制生防制剂奠 定理论基础。
[0010] 本发明的技术方案如下：
[0011] 一株核桃内生菌，它为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)Ht_q6,该菌株已于2014年06月30日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCCNo. 9401。
[0012] 核桃内生菌在制备用于防治病原菌的生防制剂中的应用。
[0013] 所述的核桃内生菌在制备用于防治病原菌的生防制剂中的应用，其中所述病菌为 核桃炭疽病菌、梨褐腐病菌、苹果褐腐病菌、茄子枯萎病菌、番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、 梨黑斑病菌、苹果干腐病菌、西瓜炭疽病菌和菜豆菌核病菌。
[0014] 核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用。
[0015] 所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用，包括如下步骤：
[0016] 1)将核桃内生菌Ht-q6转接至NB培养液中，于28°C、170r^化―1下震荡培养24h;
[0017] 2)将步骤1)培养的核桃内生菌Ht_q6转接至新的NB培养液中，于28°C、 170r?mirT1下震荡培养48h;
[0018] 3)将步骤2)培养的核桃内生菌Ht_q6进行离心，去沉淀，留上清液，得核桃内生菌 Ht_q6无菌滤液；
[0019] 4)用步骤3)所得核桃内生菌Ht_q6无菌滤液对核桃炭疽病菌进行抑制；
[0020] 根据权利要求5所述的核桃内生菌在抑制核桃炭疽病菌中的应用，其特征在于， 步骤1)和步骤2)中所述NB培养液为NA培养基的液体培养基，其中，NA培养基为：蛋白胨 〇. 5g，牛肉膏0. 3g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH为7。
[0021] 有益效果：
[0022] 1.从核桃青皮中分离筛选出的核桃内生菌，鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)，命名为Ht_q6。因为是从核桃青皮中分离筛选出的，所以 研制的生防菌剂中菌体容易在植株体内定殖，尤其是针对核桃病害，在核桃组织中更容易 定殖，防治效果更加稳定。
[0023] 2?从核桃中分离出对核桃炭疽病菌Gloeosporiumfructigenum具有拮抗作用 的内生菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)菌株Ht_q6,同时对梨褐腐病 菌Moniliafructigena、苹果褐腐病菌Marssoninacoronaria、爺子枯萎病菌Fusarium oxysporum、番爺灰霉病菌Botrytiscinerea、棉花立枯病菌Rhizoctoniasolani、梨黑斑 病菌Alternariakikuchiana、苹果干腐病菌Botryosphaeriaerengeriana、西瓜炭疽病菌 colletotrichumorbiculare和菜豆菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum病原菌具有拮 抗作用，对开发研制防治多种病害的新型生防制剂提供菌株来源。
[0024] 3.本研究通过对菌株Ht_q6的最佳发酵培养的优化研究，筛选出了生产成本相对 较低的发酵培养基。为今后该菌株的扩大规模和生产研究应用奠定了基础。即确定产抑菌 活性物质最佳培养液配方：1%玉米粉，1%牛肉浸膏，〇.〇2%1 §504*71120,0.02%1((：1;最佳 产菌量培养液配方：1%玉米粉，〇. 5%牛肉浸膏，0. 02%MgS04 ? 7H20,0. 01%KC1 ;最佳培养 条件为：接种量4mL，初始pH6. 0,装瓶量75mL/250mL，培养温度30°C，摇床转速180r/min， 培养时间48h。
【附图说明】
[0025] 图1-1为核桃内生菌菌株Ht_q6平板菌落形态；
[0026] 图1-2为核桃内生菌菌株Ht_q6的菌体形态，（光学显微镜40倍）；
[0027] 图1-3为核桃内生菌菌株Ht_q6的基因组DNA电泳图；
[0028] 图1-4为核桃内生菌菌株Ht_q6的PCR扩增产物电泳图；
[0029] 图1-5为基于16SrDNA序列构建的菌株Ht_p6的系统发育树；
[0030] 图2-1为菌株Ht_q6不同浓度无菌滤液对核桃炭疽菌孢子萌发的影响；
[0031]图2-2为菌株Ht_q6无菌滤液对核桃炭疽菌孢子萌发的抑制（40X)，其中，a:正常 萌发的分生孢子；b:干燥条件萌发的分生孢子，孢子芽管短；c:经发酵滤液处理的分生孢 子，孢子畸形（c-1)，芽管短，末端膨大（c_2,3);
[0032] 图2-3不同浓度无菌滤液对核桃炭疽菌菌丝形态的影响（光学显微镜40倍），其 中，a:正常菌丝；b:产孢正常；c、经无菌滤液处理后的畸形菌丝；d:产孢异常；
[0033] 图2-4为菌株Ht_q6对不同病原真菌的抑制作用，其中，A、a是菜豆菌核病 菌（Sclerotiniasclerotiorum) ;B、b是爺子枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.Melongenae);C、c是苹果干腐病菌（Botryosphaeriaberengeriana);D、d是梨黑斑病菌 (Alternariakikuchiana) ;E