标记疫苗的制作方法
【专利说明】标记疫苗
[0001] 本发明涉及在病毒蛋白质的表位中具有修饰的可复制的牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、古典猪瘟病毒（CSFV)、羊边界病病毒（BDV)和非典型瘟病毒，其作为药物的用途， 作为疫苗的用途，包含此类可复制的BVDV、CSFV、非典型瘟病毒或BDV的疫苗，以及用于检 测针对此类病毒的抗体和区分已接种疫苗的动物与野外感染的动物的诊断测试。
[0002] 癌病毒属是在黄病毒科（/7ZariririiZae)内的属，其尤其（i. a.)包 含牛病毒性腹泻病毒（BVDV)、古典猪瘟病毒（CSFV)、羊边界病病毒（BDV)和称为非典型瘟 病毒的一组病毒，例如HoBi病毒和Khon Kaen病毒。
[0003] BVDV、CSFV、非典型瘟病毒或BDV可以诱导在全世界具有显著经济损失的严重疾 病。
[0004] 牛病毒性腹泻病毒（BVDV)，其为牛病毒性腹泻的病原体的瘟病毒成员，是全世界 经济上重要的牛疾病。由BVDV感染引起的重大经济损失是生育能力降低、流产和产生持续 感染的小牛，其可以发展出致命性"粘膜病"。
[0005] CSFV引起古典猪瘟，在猪中高度传染性和有时致命性的疾病，其可以引起显著经 济损失。
[0006] 边界病（BD)是绵羊和山羊的先天性病毒疾病。绵羊中最常见的临床体征包括不 育性母羊、流产、死胎和弱小羔羊的出生。
[0007] CSFV、BVDV、非典型瘟病毒和羊边界病病毒是遗传和结构上紧密相关的。
[0008] 动物可以通过疫苗接种，尤其是保护预防CSFV和BVDV :保护猪和牛预防例如CSFV 和BVDV感染的常规灭活或经修饰的活疫苗是本领域已知的，并且是商购可得的。
[0009] 瘟病毒基因组由正向的单链RNA组成。所述RNA具有至少12. 3 kb的长度且含有 一个大开放读码框（ORF)，其侧翼为在两个基因组末端处的非翻译区（NTR)。瘟病毒ORF翻 译成一个多蛋白，其通过病毒和细胞蛋白酶共翻译且翻译后加工成至少12种成熟蛋白质。 [0010] 瘟病毒ORF的第一种蛋白质为Npro (N末端蛋白酶）。Npro是非结构性自身蛋白酶 (autoprotease)，其将自身与ORF编码的多蛋白的剩余部分切开，并且从而产生其自身的C 末端以及ORF中的第一种结构蛋白（C (核心）蛋白）的正确N末端。
[0011] ORF中的C蛋白随后为其他结构蛋白：EMS、E1、E2 (以该次序）。衣壳（C)蛋白和 三种糖基化的包膜蛋白（E?S、E1、E2) -起构成瘟病毒的病毒粒子。结构蛋白随后为非结构 蛋白（口7、呢2-呢3和呢3、呢4八、呢48、呢5八和呢58)。呢3(丝氨酸蛋白酶）和呢5〇?隱 依赖性RNA聚合酶活性）直接参与病毒复制。
[0012] 关于瘟病毒复制的研究已通过反向遗传学系统和自 主复制亚基因组RNA (复制子）的发现而得到相当大促进 (Behrens等人，（1998)，Meya-S等人，（1996、，Lamp, B. (2011))。
[0013] 例如通过制备缺乏结构蛋白的基因序列的缺陷型CSFV基因组来研究CSFV复制的 最低限度要求。发现缺陷型CSFV基因组仍复制，并且当连同辅助A187-CAT RNA -起引入 SK-6细胞内时，可以包装成病毒颗粒（Moser等人，（1999))。
[0014] 缺乏Npro基因序列的一部分以及编码C、Ems、El、E2、p7和NS2的基因的自主复 制的缺陷型BVDV基因组已由Behrens等人（1998)进行描述。
[0015] 目前，在瘟病毒引起经济损害的不同国家应用不同方法处理瘟病毒感染。然而，将 这些不同方法平行使用的事实引起问题，如下文对于BVDV举例说明的。然而，该问题是所 有瘟病毒的普遍问题。
[0016] BVDV和BDV在饲养反刍动物的全世界的所有国家出现，只有几个国家例外。
[0017] 瘟病毒同样在野生动物中循环，并且这些因此构成储库，病毒可以由该储库泄漏 到驯养家畜内。
[0018] BVDV诊断测试的开发已使得能够检测BVDV感染的兽群，并且追踪且去除持续感 染的动物。
[0019] 与严格迁移限制和卫生措施组合，这种开发结果已允许斯堪的纳维亚国家实际上 从驯养家畜中根除BVDV。然而，因此，疫苗接种目前在这些国家中已禁用。
[0020] 多少可比较的情况对于CSFV在欧洲发生：当时CSFV实际上通过疫苗接种从EU根 除，从1980年代开始引入非疫苗接种政策。
[0021] 然而，由于高牛密度、密集的贸易和高BVDV流行率，迄今大多数其他国家已决定 仍遵循疫苗接种方法。
[0022] 当处理BVDV感染或CSFV感染时，这两种不同方法的平行存在已导致下述冲突性 情况：接种疫苗的牛无法容易地与野外感染的牛区分，因为在两种情况下均存在针对病毒 的抗体。因此在很大程度上不知道BVDV抗体阳性动物是由于感染（在所述情况下，它们可 能携带病毒）还是疫苗接种而是抗体阳性的。并且为此，尤其是斯堪的纳维亚国家不允许 BVDV抗体阳性动物和肉类的进口。
[0023] 该问题可以在理论上通过使用所谓的标记疫苗得到解决。此类疫苗缺乏免疫原性 病毒蛋白质中的一种或多种，因此标记疫苗接种的动物将不产生针对所有免疫原性病毒蛋 白质的抗体。接种疫苗和受感染的动物之间在抗体调色板（antibody-palette)中的差异 可以在设计用于该目的的诊断测试中显示。此类测试因此允许区分接种疫苗和受感染的动 物。
[0024] 该方法例如已得到遵循用于开发针对CSFV的标记疫苗。该标记疫苗事实上是基 于CSFV E2包膜蛋白的亚单位疫苗。此类亚单位疫苗是安全有效的，但缺点在于下述事实： 当与灭活的全病毒疫苗和经修饰的活疫苗相比较时，它们在免疫的发动方面可能功效稍 差。
[0025] 因此，需要具有改善的功效概况且适合作为标记疫苗的疫苗。
[0026] 本发明的目的是提供此类改良的标记疫苗。
[0027] 目前惊讶地发现此类改良的标记疫苗可以通过修饰非结构蛋白NS3的解旋酶结 构域的表位而获得。
[0028] 非结构蛋白NS3具有双重功能：它具有丝氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性。瘟病 毒解旋酶的主要功能假定为在聚合酶反应后基因组的正和负RNA链的解旋。另外，存在由 Riedel等人，2012提议的强烈证据：解旋酶在感染性病毒颗粒的细胞内装配中是重要的。
[0029] 两种酶促活性的作用和功能已尤其是由Tautz，N. (2000)，Ming Xiao (2008)， Wei Cheng (2007)，Tackett, A. J. (2001)，Deregt, D. (2005)和 Jian Xu (1997)进行 描述。
[0030] Jian Xu (1997)的出版物明确显示NS3区域，更具体而言在NS3蛋白质内的解旋 酶在例如BVDV和CSFV之间是如何相关和高度保守的。
[0031] NS3蛋白质的解旋酶已成为诊断抗体检测测定（例如基于单克隆抗体的ELISA) 的开发的主要靶标。关于这点的原因很明确：NS3解旋酶是1)非常免疫原性的；和2)在 瘟病毒中是高度保守的：在解旋酶中未发现或实际上未发现突变。参见例如Collet，M. S. (1992)和Bathia，S. (2008)。从诊断观点来看，这具有下述优点：1)针对NS3的解旋酶的 抗体在动物中容易被诱导，和2)由于解旋酶的高保守水平，针对解旋酶的抗体检测测定将 识别例如所有BVDV或CSFV毒株。
[0032] 图7给出了包含与NS3区域反应的单克隆抗体的商购可得的诊断测试的概述。
[0033] 具有经修饰的表位的解旋酶结构域的例如BVDV或CSFV的突变株可以良好地构 成标记疫苗的基础：此类疫苗对动物的施用将诱导不同于野生型病毒的抗体组（antibody panel)，并且因此可以将疫苗接种与野生型感染区分。
[0034] 然而，由于这种非常高的保守水平，NS3的解旋酶将大约是病毒基因组允许或制备 突变的最不优选的区域，理由如下：解旋酶是病毒的必需酶，即病毒如果没有解旋酶活性将 不能复制，即它是不可复制的。解旋酶的高保守水平的原因是与很多酶共有的：解旋酶的作 用高度依赖于其一级、二级和三级结构，并且因此突变将扰乱解旋酶活性，从而致使病毒无 法存活。因此，事实上这将是最不优选的用于制备突变的病毒基因组区域。
[0035] 目前已惊讶地发现出乎意料的是，在解旋酶结构域内存在的确允许突变的某些特 异性区域，同时携带此类突变的病毒仍是可复制的。此外，这些突变可以在解旋酶结构域的 表位中产生，使得这些经修饰的表位不再被与野生型形式的这些表位反应的单克隆抗体识 别。
[0036] 此类病毒因此具有下述优点：一方面，它们仍能够复制，并且因此适合作为活疫苗 的基础，而另一方面，在下述意义上，它们可以与所有其他BVDV、BVD、非典型瘟病毒或CSFV 区分：与野生型BVDV、BVD、非典型瘟病毒或CSFV相反，它们已丧失其与一种或多种BVDV、 BVD、非典型瘟病毒或CSFV特异性抗体的反应性。此外，它们在动物中确实不再诱导这些抗 体。
[0037] 因此，本发明人已发现与预期的相反，BVDV、BDV、非典型瘟病毒或CSFV的NS3蛋白 质的解旋酶包含可以进行修饰的表位，由于所述修饰，它们确实不再与针对野生型NS3蛋 白质上的相应表位的抗体反应（或诱导所述抗体），但不引起病毒丧失其复制能力。
[0038] 本发明目前允许技术人员生成可复制的BVDV、BDV、非典型瘟病毒或CSFV突变株， 其可以构成标记疫苗的基础。
[0039] 因此，本申请的第一个实施方案涉及在病毒蛋白质的表位中具有修饰的可复制的 BVDV、CSFV、非典型瘟病毒或BDV，由于所述修饰，所述表位不再与针对野生型BVDV、CSFV、 非典型瘟病毒或BDV中的该表位的单克隆抗体反应，其中所述表位位于非结构蛋白NS3的 解旋酶结构域中。
[0040] 如本文定义的，可复制的BVDV、CSFV、非典型瘟病毒或BDV是仍可以复制，即能够 产生感染性子代病毒的病毒。所述感染性子代病毒可以是可复制的感染性子代病毒或复制 缺陷型感染性子代病毒。
[0041] 此类可复制的BVDV、CSFV、非典型瘟病毒或BDV可以是包含足够的遗传材料以能 够产生感染性子代病毒的病毒，所述感染性子代病毒在新感染的细胞中进一步复制（可复 制的感染性子代病毒）。
[0042] 它还可以是这样的病毒，其缺乏遗传信息至不能产生在新感染的细胞中进一步复 制的感染性子代病毒的程度，但当存在于互补细胞中时，能够产生能够单循环感染的