包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用图
【专利说明】包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用途
[0001] 本文报道了通过使用转肽酶，诸如分选酶A(sortase A)生产和选择通过两个不同 实体，诸如结合实体、效应子实体、或有效负荷的组合形成的分子，其中至少两个不同实体 在体内连接。这是通过将内质网驻留信号（retention signal)添加至分选酶和实体之一 而实现的。
[0002] 发明背景
[0003] 在过去的几年里，已经开发并临床测试了多种特异性治疗蛋白质，包括细胞表面 受体的抗体、抗体片段和配体。示例性蛋白质是抗体、Fc区缀合物，或靶向递送载体。已经 将这些治疗蛋白质中的一些缀合到若干种类的治疗毒素上，如小分子药物、酶、放射性同位 素、蛋白毒素和用于向患者特定递送的其他毒素。
[0004] 向疾病位点有效递送是任何治疗分子高效和低毒的前提。例如，抗体可以参与到 该背景中。如果抗体本身不是治疗性原理的，那么效应子分子缀合到抗体上使得可以实现 药物在人体内想要位点上准确定位。这增加了该靶区域内有效药物的浓度，由此优化活性 剂的治疗效力。此外，利用靶向递送，临床医师能够降低治疗剂的总体剂量并因此最小化全 身暴露-如果药物有效负荷具有相关毒性或如果待用于治疗慢性状况，这是特别相关的事 情（参见例如 McCarron, P. A.，等，Mol. Interventions 5 (2〇〇5) 368_38〇) 〇
[0005] 在WO 2010087994中报道了用于连接的方法及其用途。由Marvin, J. S.，等（Acta Pharmacol. Sinica 26(2005)649-658)报道了 IgG 样双特异性抗体的重组方法。Levary, D. A.，等（PLoS one，6(2011)el8342. I_el8342. 6)报道了由分选酶A催化的蛋白质-蛋白 质融合。在WO 2013/003555中报道了分选酶安装用于蛋白质连接的掣子化学柄（click chemistry handles)的用途。
[0006] Strijbis，K.等（Traffic 13(2012)780-789)报道了使用分选酶在活细胞中的 蛋白质连接。据称Ca2+-依赖性金黄色葡萄球菌（S. aureus)分选酶A在胞内是非功能性 的，但是Ca2+-非依赖性化脓链球菌（S. pyogenes)分选酶A在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和哺乳动物HEK293T细胞的胞质和内质网（ER)腔中均是功能性的。
[0007] 发明概沐
[0008] 本文报道了通过使用金黄色葡萄球菌（S. aureus)的Ca2+-依赖性酶分选酶A来在 胞内体内生产第一多肽结构域与第二多肽结构域的酶催化的（即酶促的）缀合物的方法， 以此多肽结构域之一和可溶分选酶A含有内质网驻留信号。
[0009] 此技术特别适用于快速生成例如，第一组多肽结构域（例如第一组结合结构域诸 如抗体可变结构域的同族对（cognate pair))和第二组多肽结构域（例如第二组结合结构 域诸如抗体可变结构域的同族对，但针对与第一组所针对的不同的表位/抗原，或有效负 荷分子的组）的组合的文库。此文库可例如，通过在HEK细胞中瞬时转染容易地生成，并且 之后可以就例如，预期的生物学效应或预期的性质筛选获得的组合。
[0010] 如本文报道的一个方面是生产包含至少两个多肽结构域的多肽的方法，所述方法 包括步骤为
[0011]-培养细胞，所述细胞包含
[0012] a)编码具有C末端内质网驻留信号的可溶分选酶A的核酸，
[0013] b)编码在其C末端处或在其C末端区中包含后接内质网驻留信号的分选酶基序的 第一多肽结构域的核酸，和
[0014] c)编码在其N末端处包含至少两个甘氨酸残基的寡甘氨酸基序的第二多肽结构 域的核酸，
[0015] 由此细胞分泌第一多肽结构域和第二多肽结构域的分选酶A(介导的/催化的） 缀合物，
[0016] 从而生产包含至少两个多肽结构域的多肽。
[0017] 如本文报道的一个方面是生产包含至少两个结合实体的多特异性结合物的方法， 所述方法包括步骤为
[0018] -培养细胞，所述细胞包含
[0019] a)编码具有C末端内质网驻留信号的可溶分选酶A的核酸，
[0020] b)编码在其C末端处或在其C末端区中包含后接内质网驻留信号的分选酶基序的 第一结合实体的核酸，和
[0021] C)编码在其N末端处至少包含二甘氨酸（diglycine)的第二结合实体的核酸，
[0022] 由此细胞分泌第一结合实体和第二结合实体的分选酶A(介导的/催化的）缀合 物，
[0023] 从而第一结合实体特异性结合第一抗原或靶，并且第二结合实体特异性结合第二 抗原或靶，
[0024] 从而生产包含至少两个结合实体的多特异性结合物。
[0025] 在全部方面的一个实施方案中分选酶A是金黄色葡萄球菌（S. aureus)的分酶A。 在一个实施方案中编码具有C末端内质网驻留信号的（可溶）分选酶A的核酸编码SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0026] 本文报道了提供用于在需要治疗的患者中治疗疾病，如癌症或病毒感染的定制的 高度特异的治疗分子的方法，以此所述治疗分子适合患者的疾病特征和/或患者的基因型 /表型。
[0027] 通过考虑患者携带疾病/受影响细胞的基因型/表型制备定制分子实现这种适 合。
[0028] 在第一步中，确定旨在利用治疗分子靶向的细胞的基因型/表型（疾病特异性细 胞表面分子的存在和数目/数量）。这例如通过细胞成像技术，如使用荧光标记的单特异性 (治疗性或诊断性）抗体对来自例如血液和/或活组织检查材料的患者细胞免疫组织化学 染色（IHC，免疫组织化学）来实现。或者，可以在利用标记的治疗或诊断抗体染色后使用基 于FACS的方法分析细胞的基因型/表型。体内成像技术，包括光学成像、分子成像、荧光成 像、生物发光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活体显微镜检查也可以用于确定患者的疾病相关 细胞的基因型/表型。根据患者的疾病相关细胞确定的基因型/表型，可以/进行选择靶 向/结合实体的定制组合，并且组合在治疗分子中。该治疗分子可以是例如双特异性抗体。
[0029] 此类定制的治疗分子i)将是高度特异的，ii)将具有好的治疗功效，并且iii)与 常规选择的治疗剂相比将诱导较少的和/或较不严重的副作用。这可以通过提供具有改善 的靶向和/或改善的定制递送性质，例如对其预期的作用位点递送治疗有效负荷的治疗分 子来实现。
[0030] 可以通过与常规选择的治疗分子相比对靶向治疗分子的较高的/增加的选择性 和/或特异性来实现治疗分子向其作用位点，如例如癌细胞的改善递送。治疗分子包含至 少两个实体，其特异性结合或可以被不同蛋白质结合（例如两种不同的细胞表面标志物）。
[0031] 可以通过两个靶向实体同时结合其各自的靶标/表位，或通过两个多肽结构域与 其相互作用伙伴的同时结合，或通过其混合，实现定制治疗分子的增加的选择性和/或特 异性。
[0032] 尤其适合的是对其各自的靶标/表位具有低亲和力到中等亲和力的两个结合实 体的组合。此外，脱靶结合被极大地减少或甚至可以被完全消除。
[0033] 已经发现使用本文报道的方法能够定制例如双特异性结合物诸如，特异性针对细 胞（诸如癌细胞）表面上发现的两种表面标志物的双特异性抗体。由于结合特异性是由 起始组分单独提供的，能够简单地通过确定细胞，例如癌细胞上存在的表面标志物，并通过 酶促流程缀合特异性结合这些表面标志物或其各自配体的各抗体片段，定制多特异性靶向 和结合分子。由于酶促缀合是通过酶分选酶A，在一个实施方案中是通过金黄色葡萄球菌 的分选酶A进行的，获得的双特异性结合物（双特异性抗体）的特征为存在氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基）。
[0034] 如本文报道的一个方面是选择特异性结合两种不同表位或抗原的多特异性结合 物的方法，所述方法包括步骤为
[0035] -从包含第一结合实体和第二结合实体的不同组合的多种多特异性结合物中选择 特异性结合两种不同表位或抗原的多特异性结合物。
[0036] 如本文报道的一个方面是选择双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤
[0037] (i)测定含有细胞的样品中存在的细胞表面标志物并至少选择其中第一表面标志 物和第二表面标志物，
[0038] (i i)用以下转染细胞：(a)核酸，其编码在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸 序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基）、后接内质网驻留信号KDEL(SEQ ID N0:02)的抗体Fab，或scFab片段，或scFv抗体，以此Fab，或scFab片段，或scFv抗体 特异性结合第一表面标志物或其配体，（b)核酸，其编码包含全长抗体重链、全长抗体轻链 和抗体重链Fc区多肽的单臂抗体片段，以此全长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的 同族抗体链并且其可变结构域对（VH和VL)形成与第二表面标记物或其配体特异性结合的 抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fc区多肽通过形成抗体铰链区的一个或多 个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fc区多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、 或3、或4、或5)氨基酸序列，和（c)编码具有C末端内质网驻留信号的可溶分选酶A的核 酸，
[0039] 并从而生产双特异性抗体。
[0040] 如本文报道的一个方面是确定抗原结合位点的组合的方法，所述方法包括以下步 骤：
[0041] (i)确定通过如下方式制备的多种双特异性抗体的结合特异性和/或选择性和/ 或亲和力和/或效应子功能和/或体内半寿期：组合（a)第一多种抗体Fab，或scFab片段， 或scFv抗体片段的每个成员，以此每个成员在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基）、后接内质网驻留信号KDEL(SEQ ID 勵:02)，以此？&13，或8〇?313片段，或8〇?￥抗体与第一表位或抗原特异性结合，与〇3)多种包 含全长抗体重链、全长抗体轻链和抗体重链Fe区多肽的单臂抗体片段的每个成员，以此全 长抗体重链和全长抗体轻链是彼此互补的同族抗体链并且其可变结构域对（VH和VL)形成 与第二表位或抗原特异性结合的抗原结合位点，以此全长抗体重链和抗体重链Fe区多肽 通过形成抗体铰链区的一个或多个二硫键彼此共价连接，并且以此抗体重链Fe区多肽在 其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，通过分选酶A催化的酶促反 应共价连接，
[0042] 和
[0043] (ii)选择具有合适的结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功能和 /或体内半寿期的双特异性抗体并且因而确定抗原结合位点的组合。
[0044] 在全部方面的一个实施方案中分选酶A是金黄色葡萄球菌（S. aureus)的分选酶 A。在一个实施方案中编码（可溶的）具有C末端内质网驻留信号的分选酶A的核酸编码 SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0045] 如本文报道的一个方面是通过本文报道的方法获得的双特异性抗体。
[0046] 如本文报道的一个方面是在其重链之一中包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01， 其中X可以是任何氨基酸残基）的双特异性抗体。