[0047] 在下文中给出如本文报道的全部方面的实施方案。
[0048] 在一个实施方案中多种多特异性结合物的成员每个通过本文报道的方法获得。
[0049] 在一个实施方案中基于其结合特异性和/或选择性和/或亲和力和/或效应子功 能和/或体内半寿期选择多特异性结合物。
[0050] 在一个实施方案中结合实体是抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的同 族对。
[0051] 在一个实施方案中多特异性结合物是包含两个或四个结合实体的双特异性抗体。
[0052] 在一个实施方案中第一多肽结构域和第二多肽结构域彼此独立地选自全长抗体、 scFv、seFab、抗体重链、抗体轻链、抗体重链Fe区片段、抗体轻链可变结构域和抗体重链可 变结构域对、抗原结合抗体片段、VH、VL、CH1、CH2、CH3、CH4、CL、抗体铰链区、细胞因子、受 体、受体配体、可检测的标签、标记，和结合对的配偶体。
[0053] 在一个实施方案中内质网驻留信号选自SEQ ID N0:02 (KDEL)、SEQ ID NO: 03 (HDEL)，或 SEQ ID NO: 04 (SFIXXXXMP)。
[0054] 在一个实施方案中分选酶基序是LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸 残基）。
[0055] 在一个实施方案中第一结合结构域或第一结合实体在20个C末端氨基酸残基内 具有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基）。
[0056] 在一个实施方案中细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。在一个实施方案中哺乳动物 细胞选自HEK细胞、CHO细胞，或BHK细胞。
[0057] 在一个实施方案中，Fe区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少 一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第 228、233、234、235、236、237、297、318、320、322 和331位置的氨基酸残基的组，其中？(：区中 的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的（野生型）Fe区相比，这些特定氨基酸残基 的变化导致Fe区的效应子功能改变。
[0058] 在一个实施方案中结合实体选自（或第一结合实体和第二结合实体彼此独立地 选自）基于darpin结构域的结合实体、基于抗运载蛋白（anticalin)结构域的结合实 体、基于T细胞受体片段样scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基 于第十纤连蛋白3结构域的结合实体、基于生腱蛋白结构域的结合实体、基于钙黏着蛋白 结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于 GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构 域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体，或抗体片段如Fab，或seFab，或 scFv片段。
[0059] 在一个实施方案中第一多肽结构域i)在其C末端氨基酸序列区中（即20个C末 端氨基酸残基内）包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸残基） 和ii)在其C末端处包含内质网驻留信号KDEL(SEQ ID N0:02)，并且第二多肽结构域在其 N末端处包含寡甘氨酸GniOii = 2,或3,或4,或5)。
[0060] 在一个实施方案中第二多肽结构域或第二结合实体在其N末端处包含寡甘氨酸 G111Oii = 2,或3,或4,或5)氨基酸序列。
[0061] 如本文报道的一个方面是包含如本文报道的多特异性结合物的药物制剂。
[0062] 如本文报道的一个方面是如本文报道的多特异性结合分子在制造药物中的用途。
[0063] 在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
[0064] 如本文报道的一个方面是用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向该个 体施用有效量如本文报道的多特异性结合物。
[0065] 如本文报道的一个方面是用于摧毁个体中癌细胞的方法，所述方法包括向该个体 施用有效量的如本文报道的多特异性结合物。
[0066] 如本文报道的一个方面是包含如本文报道的双特异性抗体的药物制剂。
[0067] 如本文报道的一个方面是如本文报道的双特异性抗体在制造药物中的用途。
[0068] 在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。
[0069] 如本文报道的一个方面是用于治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向该个 体施用有效量的如本文报道的双特异性抗体。
[0070] 如本文报道的一个方面是用于摧毁个体中癌细胞的方法，所述方法包括向该个体 施用有效量的如本文报道的双特异性抗体。在如本文报道的全部方面的一个实施方案中， Fe区是人Fe区或其变体。
[0071] 在一个实施方案中，人抗体Fe区是人IgGl亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3 亚类的，或人IgG4亚类的。
[0072] 在一个实施方案中，抗体Fe区是人IgGl亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fe区。
[0073] 在一个实施方案中，人抗体Fe区包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322、329和/或331中一个处天然存在氨基酸残基向不同残基的突 变，其中抗体Fe区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
[0074] 在一个实施方案中，人抗体Fe区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变 和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包 含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中 Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的（野生型）Fc区相比，这些特定氨基 酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
[0075] 在一个实施方案中，与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区针对 人FcyRIIIA、和/或FcyRIIA和/或FcyRI具有减低的亲和力。
[0076] 在一个实施方案中，人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨 酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
[0077] 在一个实施方案中，人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种： S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G 和 / 或 P331S。
[0078] 在一个实施方案中，如果抗体Fc区是人IgGl亚类，则突变是L234A和L235A，或如 果抗体Fc区是人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
[0079] 在一个实施方案中，抗体Fc区包含突变P329G。
[0080] 在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第 二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
[0081] 在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第 二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
[0082] 附图简沐
[0083] 图1可溶分选酶A的表达质粒的质粒图，在其C末端包含内质驻留信号。
[0084] 图2考马斯染色的SDS凝胶，还原性条件；用 scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (第 1 泳道），scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (第 2泳道），（GGGGS) 2-scFab (第3泳道），可溶分选酶A-KDEL (第4泳道），组合1+3+4 (质粒 比例2. 5:5:1)(第5泳道），组合2+3+4 (质粒比例2:8:1)(第6泳道）转染的HEK293细 胞的培养物上清；scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL 和 scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-K DEL主要驻留在胞内，（GGGGS)2-ScFab表达并分泌到培养基中（约50kDa)，对于组合能够 看到约IOOkDa处的酶促缀合物的条带。
[0085] 图3考马斯染色的SDS凝胶，还原性条件；用 scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL (第 1 泳道），scFab-GS-His6-GAPPPS-LPETGGS-KDEL (第 2泳道），（GGGGS) 2-scFab (第3泳道），可溶分选酶A-KDEL (第4泳道），组合1+3+4 (质粒 比例2. 5:5:1)(第5泳道），组合2+3+4 (质粒比例2:8:1)(第6泳道）转染的HEK293细 胞的细胞裂解物（左侧）；scFab-GS-His6-GS-LPETGGS-KDEL 和 scFab-GS-His6-GAPPPS-LP ETGGS-KDEL主要驻留在胞内。
[0086] 图4使用相同样品并在与图2和3的凝胶相同的条件下进行的SDS凝胶的Western 印迹分析；用抗-His标签抗体（PentaHis-AK(Qiagen))检测scFab-LPXTG分子和缀合产 物；对于组合能够看到约IOOkDa处的酶促缀合物的条带。
[0087] 本发明的实施方式的具体描沐
[0088] I.宙义
[0089] 在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链Fc区中残基的编号是Kabat的EU索 弓I 编号（Kabat，E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)，NIH Publication 91 3242,所述文献通过引用的方式明确并入本文）。
[0090] 术语"改变"指亲本氨基酸序列中突变、添加或缺失一个或多个氨基酸残基。
[0091] 术语"标签"指通过具有特异性结合特性的肽键彼此连接的氨基酸残基的序列。 在一个实施方案中，标签是亲和标签或纯化标签。在一个实施方案中、标签选自Arg标 签、His标签、FLAG标签、3xFlag标签、Strep标签、纳米标签、SBP标签、c-myc标签、S标 签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、GST标签或MBP标签。在 一个实施方案中，标签选自 SEQ ID NO: 05 (RRRRR)、或 SEQ ID NO: 06 (RRRRRR)、或 SEQ ID N0:07(HHHHHH)、或SEQIDN0:08(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK)、或SEQIDN0:09(DYKDDDDK)、 或 SEQ ID NO:10(DYKDHD⑶YKDHDIDYKDDDDK)、或 SEQ ID NO:11(AWRHPQFGG)、或 SEQ ID N0:12(WSHPQFEK)、或SEQIDN0:13(MDVEAWLGAR)、或SEQIDN0:14(MDVEAWLGARVPLVET)、 或 SEQ ID N0:15(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、或 SEQ ID N0:16(EQKLISEEDL)、或SEQIDN0:17(KETAAAKFERQHMDS)、或SEQIDN0:18(KRRWKKNFIAV SAANRFKKISSSGAL)、或SEQ ID NO: 19 (纤维素结合结构域）、或SEQ ID NO: 20 (纤维素结合 结构域）、或SEQ ID N0:21(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVT