具有改进的转化效率的细菌突变体的制作方法
【专利说明】具有改进的转化效率的细菌突变体
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 背景
[0004] 遗传感受态是一种外源DNA可以被内化，从而引起转化事件的生理状态（贝尔 卡（Berka)等人，分子微生物学（Mol.Microbiol.)2002,43，1331-1345)，但是不同于涉 及电穿孔、原生质体和热激或CaCl 2*理的人工转化。已经在革兰氏阳性和革兰氏阴性 细菌两者的物种中观察到天然感受态（杜布诺（Dubnau)，微生物学年评（Annual Rev. Microbiol.) 1999, 53, 217-244)，并且该过程需要超过一打其表达针对每个生物体的需求 被精确精心设计的蛋白质。
[0005] 已经就天然感受态的目的提议了若干假说，并且可以将它们总结为用于食物的 DNA、用于修复的DNA和用于遗传多样性的DNA(杜布诺（Dubnau)，1999,见上文）。用于食 物的DNA假说由以下观察现象支持，感受态是当细胞的营养素被限制时出现的静止期现 象，并且通常，一种强有力的无特异性核酸酶与转化特异性蛋白共表达。第二种假说的证据 来自以下事实，编码DNA修复酶的基因与编码DNA转运蛋白的基因协同地表达。最后，针 对遗传多样性的DNA假说提议到，感受态是一种用于经由水平基因转移而探索适合度景观 (fitness landscape)的机制。感受态由群体感应机制调控和它是一种双稳状态的观察现 象（艾弗里（Avery)，微生物学趋势（Trends Microbiol.) 2005,13,459-462)支持这一假 说。
[0006] 公共数据库现在包含众多的完整的细菌基因组，包括来自相同物种的不同菌株 的若干基因组。使用成对全基因组比对，最近的分析已经显示相同物种的不同菌株在 基因含量方面可能在实质上具有差异。例如，大肠杆菌菌株CFT073、EDL933和MG1655 的基因组比较揭示到，仅仅其蛋白（基因产物）的组合组的39.2%为所有三种菌株所 共有，从而突出了相同物种的菌株之中的惊人多样性（布拉特纳（Blattner)等人，科 学（Science) 1997, 277,1453-1474 ;林（Hayashi)等人，2006,分子系统生物学（Mol. Syst.Biol.)doi:10.1038:msb4100049;佩纳（Perna)等人，自然（Nature)2001，409， 529-533;韦尔奇（Welch)等人，美国国家科学院院刊（Proc. Natl. Acad Sci. USA) 2002,99， 17020-17024)。此外，大肠杆菌菌株CFT073的基因组序列揭示了 1，623个菌株特异性基 因（21.2%)。自此类型的比较，可以清楚地看到细菌基因组被分段为共有的保守骨架和菌 株特异性序列。典型地，就在所有菌株之中保守的保守"骨架"基因和可能为水平转移所需 的非保守基因的分布而言，一个物种内的给定菌株的基因组显示出一种镶嵌结构（布鲁斯 科维克兹（Brzuszkiewicz)等人，美国国家科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 2006， 103,12879-12884;韦尔奇（Welch)等人，2002,见上文）。
[0007] 就实用性而言，经由天然感受态的转化是一种用于构建细菌菌株（例如，芽孢杆 菌属）的极其有用的工具，这些细菌菌株可以包含染色体基因的改变的等位基因或经由重 组DNA方法组装的质粒。尽管可以经由如以上所指出人工手段（例如，电穿孔、原生质体和 热激或CaCl2处理）实现用质粒和染色体DNA转化某些物种，但是通过天然感受态引入DNA 提供简单、方便、快速及有效的明显优势。
[0008] 在枯草芽孢杆菌中，经由涉及群体感应、信号转导和基因表达级联的过程，群体中 仅仅5%-10%的细胞区别于感受态状态（称为K-状态）（艾弗里（Avery)，2005,见上文）。 已知在感受态中直接涉及至少50个基因，并且多达165个基因由中心转录因子ComK (直接 或间接）调控（贝尔卡（Berka)等人，2002,见上文）。枯草芽孢杆菌中的感受态级联由两 个被分子开关打断的调控模块组成（图1)，该级联涉及ComS结合至衔接分子MecA，从而干 扰ClpC/ClpP蛋白酶降解转录因子ComK (图尔加伊（Turgay)等人，欧洲分子生物学学会杂 志（EMBO J.)1998,17,6730-6738)。
[0009] 在枯草芽孢杆菌中，已经显示mecA失活适度地提高转化效率，这归因于ComK的增 加的有效性（哈恩（Hahn)等人，分子微生物学（Mol. Microbiol.)，1995,18, 755-767)。一 项最近的研宄表明，根据示于图2中的mecA与eps和tasA调节子之间的调控关系，枯草芽 孢杆菌mecA缺失引起eps和tasA操纵子的表达增加（普利皮克（Prepiak)等人，分子微 生物学（Mol. Microbiol. )，2011，80,1014-1030)。
[0010] 除comP和comS之外，地衣芽孢杆菌赋予实现天然感受态所必需的基因的直系同 源物。表面上，不能获得天然感受态地衣芽孢杆菌细胞，这归因于缺乏功能性comS基因，从 而引起ComK被MecA连续螯合并且被ClpC/P/MecA复合物蛋白水解地降解。申请人已经显 示，ComS和ComK在地衣芽孢杆菌中的表达可以改进感受态（US 2010/0028944)。
[0011] 因为芽孢杆菌属物种为多种工业相关过程（例如代谢工程和生化生产）提供了关 键平台，表现改进的感受态的工程化菌株对于构建新的且改进的生产菌株而言是高度令人 希望的。用于改进芽孢杆菌属菌株中的感受态的全包（turn-key)方法的有效性将改进随 其可以引入染色体标记/等位基因和表达载体的速度与效率。本发明满足这些以及其他需 求。
[0012] 概述
[0013] 在此描述了具有改进的转化效率的芽孢杆菌属突变体。诸位申请人已经出人意料 地发现，与单独破坏内源mecA基因相比，在芽孢杆菌属宿主细胞中破坏内源基因 mecA和 sinl两者显示出显著改进的转化效率。
[0014] 在一个方面中，是一种亲本芽孢杆菌属菌株的突变体，该突变体包括对内源mecA 基因的破坏和对内源sinl基因的破坏，其中当在相同条件下培养时，与缺乏对内源mecA基 因的破坏并缺乏对内源sinl基因的破坏的该亲本芽孢杆菌属菌株相比，该突变体具有改 进的转化效率。在一些方面中，该芽孢杆菌属突变体是一种地衣芽孢杆菌突变体或枯草芽 孢杆菌突变体。
[0015] 还描述了用于获得芽孢杆菌属突变体的方法，该方法包括在亲本芽孢杆菌属菌株 中破坏内源mecA基因和内源SinI基因。
[0016] 还描述了用于获得芽孢杆菌属转化株的方法，该方法包括将异源多核苷酸转化进 该芽孢杆菌属突变体中。
[0017] 还描述了获得多肽的方法，该方法包括：(a)培养包括编码该多肽的异源多核苷 酸的芽孢杆菌属转化株；并且（b)回收该多肽。
[0018] 还描述了获得发酵产品的方法，该方法包括：(a)培养包括编码发酵途径的多肽 的异源多核苷酸的芽孢杆菌属转化株；并且（b)回收该发酵产品。
[0019] 附图简要说明
[0020] 图1示出了枯草芽孢杆菌的感受态调控级联。模块1涉及经由磷酸化机制检测 感受态信息素 CSF和信号转导，从而合成ComS肽。ComS经由结合至MecA而干扰转录因子 ComK的蛋白水解降解，该MecA激活编码后期感受态功能的模块2,该模块编码DNA转运机 制。
[0021] 图2示出了枯草芽孢杆菌中的mecA与印s和asA调节子之间的调控关系。
[0022] 图3示出了地衣芽孢杆菌mecA基因的DNA序列和推导的氨基酸序列（分别为SEQ ID NO: 1 和 2)。
[0023] 图4示出了地衣芽孢杆菌sinl基因的DNA序列和推导的氨基酸序列^IjSSEQ ID NO:3 和 4)。
[0024] 图5示出了枯草芽孢杆菌mecA基因的DNA序列和推导的氨基酸序列（分别为SEQ ID NO:15 和 16)。
[0025] 图6示出了枯草芽孢杆菌sinl基因的DNA序列和推导的氨基酸序列^IjSSEQ ID NO:17 和 18)。
[0026] 图7示出了包括mecA基因破坏的菌株TaHy9的转化效率。
[0027] 图8示出了菌株TaHy9 (包括mecA基因破坏）和BaC0155 (包括mecA基因破坏和 sinl基因破坏）的相对转化效率。
[0028] 定义
[0029] 破坏：术语"破坏"意指参照基因的编码区和/或控制序列被部分或完全修饰（例 如通过缺失、插入和/或取代一个或多个核苷酸，或通过与RNAi缔合或反义技术），从而 使得编码的多肽的表达不存在（失活）或降低，和/或编码的多肽的酶活性不存在或降 低。可以使用本领域已知的技术测量破坏效果，如使用来自在此参照的无细胞提取物测量 值检测酶活性的不存在或降低；或通过对应的mRNA的不存在或降低（例如，至少25%降 低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低或至少90 %降低）；具有 酶活性的对应多肽的量的不存在或降低（例如，至少25%降低、至少50%降低、至少60% 降低、至少70%降低、至少80%降低或至少90%降低）；或具有酶活性的对应多肽的比活 性的不存在或降低（例如，至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、 至少80%降低或至少90%降低）。可以通过本领域已知的方法破坏感兴趣的具体基因，例 如通过直接同源重组（参见酵母遗传学方法（Methods in Yeast Genetics) (1997版）， 亚当斯（Adams)，戈特斯科林（Gottschling)，凯泽（Kaiser)及施特姆斯（Stems)，冷泉 港出版社（Cold Spring Harbor Press) (1998))。在此描述了用于破坏芽孢杆菌属基因 的技术并且已经在本领域中证实（参见斯特尔（Stahl)&法拉利（Ferrari)，细菌学杂志 (J. Bacteriol.) 1984,158,411-418)〇
[0030] 亲本：术语"亲本"或"亲本芽孢杆菌属菌株"意指对其进行破坏以产生在此描述 的突变芽孢杆菌属菌株的芽孢杆菌属菌株。亲本可以是一种天然发生的（野生型）或先前 修饰的芽孢杆菌属菌株。
[0031] 突变体：术语"突变体"意指对亲本芽孢杆菌属菌株做出一个或多个破坏后的所得 芽孢杆菌属菌株。
[0032] 改进的转化效率：术语"改进的转化效率"意指当在相同条件下转化和培养 时，与亲本芽孢杆菌属菌株相比，参照芽孢杆菌属突变体菌株能够产生增加数目的转化 株。可以使用描述于以下实例中的转化方法，通过产生增加数目的转化株证实改进的转 化效率。还可以使用先前描述的方法证实改进的转化效率（例如，阿纳格诺斯托普洛 斯（Anagnostopoulos)和斯皮宰曾（Spizizen)，细菌学杂志（J. Bacteriol.) 1961，81， 741-746)。在一些方面中，当在相同条件下培养时，与缺乏对内源mecA基因的破坏并缺乏 对内源sinl基因的破坏的亲本芽孢杆菌属菌株相比，芽孢杆菌属突变体菌株能够产生多 至少2倍，例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少 500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少20000倍、至少50000 倍或至少100000倍的转化株。
[0033] 编码序列：术语"编码序列"意指明确一种多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编 码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性 起始密码子（例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子（例如TAA、TAG、和TGA)结束。编 码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。
[0034] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0035] 出于在此所述的目的，使用尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔 曼和翁施，分子生物学杂志（J.M 〇l.Bi〇l.) 1970,48,443-453)来确定两个氨基酸序列之 间的序列一致性程度，该算法是如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，遗传学趋 势（Trends Genet.) 2000,16, 276-277)(优选 3.0.0 版或更新版本）的尼德尔（Needle) 程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5,及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0036] (一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0037] 出于在此所述的目的，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼（Needleman)和翁施 (Wunsch)，1970,见上文）来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度，该算法 是如在EMBOSS软件包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯（Rice)等人，2000,见 上文）（优选3. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空 位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,及EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。 尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并 且如下计算：
[0038] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0039] 杂交条件：术语"非常低严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针 而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的 鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、 0. 2 % SDS，在45 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0040] 术语"低严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA 和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在 50 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0041] 术语"中严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA 和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在 55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0042] 术语"高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA 和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在 60 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0043] 术语"高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA 和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在 65 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0044] 术语"非常高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标 准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA 和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0. 2X SSC、0. 2% SDS，在 70 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0045] 异源多核苷酸：在此将术语"异源多核苷酸"定义为以下多核苷酸：对该宿主细胞 而言不是天然的多核苷酸；已经对编码区做出一种或多种（例如，两种，若干种）结构修饰 的天然多核苷酸；由于通过重组DNA技术对DNA的操作而定量改变其表达的天然多核苷酸， 例如，将一种不同的（外源的）启动子连接至该多核苷酸；或通过向该宿主细胞中引入该多 核苷酸的一个或多个另外的拷贝而定量改变其表达的天然多核苷酸。
[0046] 分离的：术语"分离的"意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质 的非限制性实例包括⑴任何非天然存在的物质，⑵任何物质，包括（但不限于）从与其 性质上相关的一种或多种或所有天然存在的组分至少部分除去的任何宿主细胞、酶、变体、 核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然中发现的物质，由人工修饰的任何物质；或（4) 通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质。
[0047] 内源基因：术语"内源基因"意指对亲本芽孢杆菌属菌株而言天然的基因。
[0048] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指一种包括一个或多个（例如，两个、若干个） 控制序列的多核苷酸。多核苷酸可以是单链的或双链的，并且可以分离自天然存在的基因、 可以被修饰来以另外的不会在自然界中存在的方式包含核酸的区段，或可以是合成的。
[0049] 控制序列：术语"控制序列"意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码 多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列 包括但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终 止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特 异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
[0050] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
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