1] 表达：术语"表达"包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转 录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。可以对表达进行测量一例如，来检测增加的表达一 通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。
[0052] 表达载体：术语"表达载体"意指一种线性或环形的DNA分子，该分子包括编码一 种多肽的多核苷酸并且被可操作地连接至控制序列，其中这些控制序列提供编码该多肽的 多核苷酸的表达。最低限度上，该表达载体包括启动子序列，以及转录和翻译终止信号序 列。
[0053] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指对用核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转 导等是易感的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细 胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0054] 转化：术语"转化"意指将异源多核苷酸引入进芽孢杆菌属细胞中，这样使得该 DNA被保持为染色体整合体或保持为自主复制的染色体外载体。在此将转化后所得的芽孢 杆菌属细胞描述为"转化株"。
[0055] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0056] 在此提及"约"一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及 "约X"的描述包括方面"X"。当与测量值组合使用时，"约"包括涵盖至少与测量该具体数 值的方法相关的不确定性的范围，并且可以包括在给定的数值附近正或负两个标准差的范 围。
[0057] 如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式"一种/个"、"或"以及"该"包括 复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的这些方面包括 "由……方面组成"和/或"基本由……方面组成"。
[0058] 除非由上下文以另外的方式定义或清楚表明，在此使用的所有技术术语和科学术 语具有如本领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
[0059] 详细说明
[0060] 芽孢杆菌属突变体
[0061] 在此尤其描述了亲本芽孢杆菌属菌株的突变体，包括对内源mecA基因的破坏和 对内源sinl基因的破坏，其中该突变体具有改进的转化效率。
[0062] 这些突变体及相关方法的亲本菌株可以是任何芽孢杆菌属菌株，例如野生型芽孢 杆菌属或其突变体。在一些方面中，该亲本芽孢杆菌属菌株是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆 菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢 杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯 草芽孢杆菌、或苏芸金芽孢杆菌菌株。
[0063] 被破坏的基因可以是任何适合的内源芽孢杆菌属mecA基因和sinl基因。靶基因 的实例包括SEQ ID NO: 1的地衣芽孢杆菌mecA基因（编码SEQ ID NO: 2的多肽）、SEQ ID NO:3的地衣芽孢杆菌sinl基因（编码SEQ ID NO:4的多肽）、SEQ ID NO: 15的枯草芽孢 杆菌mecA基因（编码SEQ ID NO: 16的多肽）以及SEQ ID NO: 17的枯草芽孢杆菌sinl基 因（编码SEQ ID NO: 18的多肽）。
[0064] 在突变体及相关方法的一些方面中，该内源mecA基因编码一种多肽，该多肽与 SEQ ID NO:2或16具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100 %序列一致性。在一些方面中，该内 源mecA基因编码一种多肽，该多肽具有一个与SEQ ID NO: 2或16相差不多于十个氨基酸， 例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于 两个氨基酸或相差一个氨基酸的序列。在一些方面中，该内源mecA基因编码一种多肽，该 多肽包括SEQ ID NO:2或16或由其组成。
[0065] 在突变体或相关方法的其他方面中，该内源mecA基因包括一个编码序列，该编码 序列与SEQ ID NO: 1或15具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。在一些方面 中，该内源mecA基因的编码序列包括SEQ ID NO: 1或15或由其组成。
[0066] 在突变体或相关方法的其他方面中，该内源mecA基因包括一个编码序列，该编码 序列在至少低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严 谨度条件下与SEQ ID NO: 1或15的全长互补链杂交。
[0067] 在突变体及相关方法的一些方面中，该内源sinl基因编码一种多肽，该多肽与 SEQ ID N0:4或18具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100 %序列一致性。在一些方面中，该内 源sinl基因编码一种多肽，该多肽具有一个与SEQ ID NO:4或18相差不多于十个氨基酸， 例如相差不多于五个氨基酸、相差不多于四个氨基酸、相差不多于三个氨基酸、相差不多于 两个氨基酸或相差一个氨基酸的序列。在一些方面中，该内源sinl基因编码一种多肽，该 多肽包括SEQ ID N0:4或18或由其组成。
[0068] 在突变体或相关方法的其他方面中，该内源sinl基因包括一个编码序列，该编码 序列与SEQ ID NO: 3或17具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。在一些方面 中，该内源sinl基因的编码序列包括SEQ ID N0:3或17或由其组成。
[0069] 在突变体或相关方法的其他方面中，该内源sinl基因包括一个编码序列，该编码 序列在至少低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严 谨度条件下与SEQ ID NO:3或17的全长互补链杂交。
[0070] 在此披露的多核苷酸序列或其子序列；以及在此披露的氨基酸序列或其片段可以 用来设计核酸探针，以便根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株中鉴定并克隆同源 mecA和sinl基因。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用此类探针与来自感兴趣的 芽孢杆菌属物种的DNA杂交，以便鉴定并分离其中的对应基因。这样的探针可以大大短于 整个序列，例如至少14个核苷酸、至少25个核苷酸、至少35个核苷酸、至少70个核苷酸长 度。该探针可以更长，例如至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少 400个核苷酸、至少500个核苷酸长度。可以使用甚至更长的探针，例如至少600个核苷酸、 至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都 可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因（例如，用 3牛、咕、355、生物素或抗生 物素蛋白）。
[0071] 可以针对与上述探针杂交的DNA来筛选由此类其他菌株制备的DNA文库。来自这 类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离 技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载 体材料上。为了鉴定与在此描述的多核苷酸序列或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印 迹法中可以使用载体材料。出于上述探针的目的，杂交是指在非常低至非常高严谨度条件 下，多核苷酸杂交至与多核苷酸序列、其全长互补链、或前述各项的子序列对应的标记核酸 探针上。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。
[0072] 对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严谨度条件定义为 最佳地按照标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSSPE、0. 3% SDS、200微克/mL剪切并变性的 鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25%甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在 35%甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将 载体材料最终使用2乂35(：、0.2%505在45°0下（非常低严谨度）、在50°0下（低严谨度）、 在55°C下（中严谨度）、在60°C下（中-高严谨度）、在65°C下（高严谨度）以及在70°C 下（非常高严谨度）洗涤三次，每次15分钟。
[0073] 对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严谨度条件被定义为 最佳地，遵循标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿（Bolton)和麦卡锡（McCarthy)(美 国国家科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1962,48,1390)的计算所计算的Tm低约5°C 至约 10°C下，在0.9M NaCl、0.09M TrisHCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0·5%NP-40、1X登哈特氏溶 液（〇6111131(11:'8 8〇1111:;[011)、11111焦磷酸钠、11111磷酸二氢钠、0.1111141?、以及每1]11^0.211^的 酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在所计算的T m之下5°C至10°C， 在6X SCC加0· 1 % SDS中洗涤1次（持续15分钟）并且使用6X SSC洗涤2次（每次15 分钟）。
[0074] 由来自不同属或种的菌株的在此描述的内源me cA和s i η I基因编码的多肽的同系 物通常具有以下氨基酸变化，这些氨基酸变化是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋 白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺 失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端甲硫氨酸残基；具有多达约20-25个残 基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组 氨酸段（poly-histidine tract)、一种抗原表位或一种结合域。
[0075] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领 域已知的并且例如由H.诺伊拉特（Neurath)和R.L.希尔（Hill)，1979,在蛋白质（The Proteins)，学术出版社（Academic Press)，纽约中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/ lie、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、 Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0076] 可以根据本领域已知的程序鉴定必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变 (坎宁安（Cunningham)和威尔斯（Wells)，科学（Science) 1989,244,1081-1085)。在后 一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的活 性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿（Hilton) 等人，生物化学杂志（J. Biol. Chem.) 1996, 271，4699-4708。也可结合假定接触位点氨基 酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对 结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如德沃斯 (de Vos)等人，科学（Science) 1992, 255, 306-312;史密斯等人，分子生物学杂志（J. Mol. Biol. ) 1992,224,899-904;沃德弗（Wlodaver)等人，欧洲生物化学学会联盟简讯（FEBS Lett.) 1992, 309, 59-64。还可以从用其他相关酶进行的鉴定分析中推断鉴定必需氨基酸。
[0077] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组 的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森（Reidhaar-Olson) 和萨奥尔（Sauer)，科学（Science) 1988, 241，53-57 ;博维（Bowie)和萨奥尔，美国国家科学 院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 1989,86, 2152-2156 ;W0 95/17413;或 WO 95/22625 所 披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示（例如，洛曼（Lowman)等人， 生物化学（Biochemistry) 1991，30,10832-10837 ;美国专利号 5, 223, 409 ;W0 92/06204)以 及区域定向诱变（达比希尔（Derbyshire)等人，基因（Gene)，1986,46,145 ;内尔（Ner)等 人，DNA 1988, 7,127)。
[0078] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克 隆的、诱变的多肽的活性（内斯（Ness)等人，自然生物技术（Nature Biotechnol.) 1999， 17,893-896)。编码活性酶的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准 方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0079] mecA和SinI基因的破坏与产生芽孢杆菌属突变体的方法
[0080] 可以使用本领域熟知的方法（包括在此描述的那些方法），通过破坏参照内源 mecA和sinl基因来构建在此描述的芽孢杆菌属突变体菌株。可以破坏该基因的一部分，例 如编码区或为编码区的表达所需的控制序列。该基因的这样的一个控制序列可以是启动子 序列或其功能部分，即足以影响该基因的表达的部分。例如，可以将启动子序列失活从而无 表达或可以将天然启动子替换为较弱的启动子以减少编码序列的表达。可修饰的其他控制 序列包括但不限于前导子、前肽序列、信号序列、转录终止子以及转录激活因子。
[0081] 可以通过基因缺失技术来构建芽孢杆菌属突变体菌株，以消除或减少该基因的表 达。基因缺失技术使得可以部分或完全除去该基因，从而消除表达。在此类方法中，使用已 经构建为邻接地包含侧翼于该基因的5'和3'区的质粒，通过同源重组完成该基因的缺失。
[0082] 还可以通过引入、取代和/或除去该基因或为其转录或翻译所需的其控制序列中 的一个或多个（例如，两个、若干个）核苷酸来构建芽孢杆菌属突变体菌株。例如，可以插 入或除去核苷酸，用于引入终止密码子、除去起始密码子或移码开放阅读框。可以根据本 领域已知的方法，通过定点诱变或PCR产生的诱变完成这样一种修饰。参见例如，波特斯 坦（Botstein)和绍特勒（Shortle)，科学（Science) 1985, 229,4719 ;洛（Lo)等人，美国国 家科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 1985,81，2285;樋口（Higuchi)等人，核酸 研宄（Nucleic Acids Res) 1988,16,7351 ;岛田（Shimada)，分子生物学方法（Meth. Mol. 81〇1.) 1996,57，157;霍01〇)等人，基因（66116) 1989,77,61;霍尔顿01〇竹〇11)等人，基因 1989, 77,61 ;以及萨卡尔（Sarkar)和松梅尔（Sommer)，生物技术（BioTechniques) 1990,8， 404 〇
[0083] 还可以通过基因破坏技术，通过将破坏性核酸构建体插入进该基因中而构建芽孢 杆菌属突变体菌株，该破坏性核酸构建体包括与该基因同源的核酸片段，该片段将产生具 有同源性的区域的重复并且在重复的区域之间掺入构建体DNA。这样的一种基因破坏可以 消除基因表达，如果插入的构建体将该基因的启动子与编码区分离或打断编码序列，这样 使得产生无功能性基因产物。破坏构建体可以简单地是伴有与该基因同源的5'和3'区的 选择性标记基因。该选择性标记使得可以鉴定包含破坏的基因的转化株。
[0084] 还可以通过基因转化过程构建芽孢杆菌属突变体菌株（参见例如，伊格莱 西亚斯（Iglesias)和特劳特勒（Trautner)，分子普通遗传学（Molecular General Genetics) 1983,189, 73-76)。例如，在基因转化方法中，将对应于该基因的核苷酸序列体外 诱变，以产生缺陷核苷酸序列，然后将其转化进亲本芽孢杆菌属菌株中以产生缺陷基因。通 过同源重组，该缺陷核苷酸序列替换该内源基因。该缺陷核苷酸序列还包括一种用于选择 包含缺陷基因的转化株的标记可以是令人希望的。
[0085] 还可以使用与该基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列，通过已建立的反义技术构 建芽孢杆菌属突变体菌株（帕里斯（Parish)和斯托克（Stoker)，FEMS微生物学简讯（FEMS Microbiol. Lett.) 1997,154,151-157)。更确切而言，可以通过引入与该基因的核苷酸序列 互补的的核苷酸序列来减少或失活芽孢杆菌属菌株对该基因的表达，该核苷酸序列可以在 该菌株中转录并且能够与在该菌株中产生的mRNA杂交。在允许互补的反义核苷酸序列与 mRNA杂交的条件下，所翻译蛋白的量由此减少或消除。
[0086] 可以使用本领域熟知的方法（包括但不限于化学诱变），通过随机或特异诱变进 一步构建芽孢杆菌属突变体菌株（参见例如，霍普伍德（Hopwood)，微生物学方法中的突变 体分离（The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J. R.诺里斯（Norris) 和D.W.里本（Ribbons)，编辑））第363-433页，学术出版社（Academic Press)，纽约， 1970)。可以通过使亲本菌株经受诱变并筛选其中该基因的表达已经被减少或失活的突变 体菌株来修饰该基因。诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变 剂、使用适合的寡核苷酸或使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可以通过使 用这些诱变方法的任何组合来进行。
[0087] 适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实