例包括紫外线（UV)照射，羟胺，N-甲 基-Ν' -硝基-N-亚硝基胍（MNNG)，N-甲基-Ν' -亚硝基胍（NTG)，邻甲基羟胺，亚硝酸，乙 基甲磺酸（EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸和核苷酸类似物。当使用此类试剂时，诱变典型地是在适 合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本菌株并选择展现出该基因的 减少表达或无表达的突变体来进行的。
[0088] 可以使用来自其他微生物来源的与在此描述的基因同源或互补的核苷酸序列来 破坏所选的芽孢杆菌属菌株中的对应基因。
[0089] 在一个方面中，芽孢杆菌属突变体中的基因修饰未用选择性标记加以标记。可以 通过将突变体在反向选择培养基中进行培养来除去选择性标记基因。在该选择性标记基因 包含侧翼于其5'和3'端的重复序列的情况下，当该突变体菌株经受反向选择时，这些重复 序列将有助于该选择性标记基因通过同源重组而环出。还可以通过向该突变体菌株中引入 一个核酸片段，该核酸片段包括缺陷基因的5'和3'区但是缺乏该选择性标记基因，随后在 反向选择培养基上进行选择，通过同源重组来除去该选择性标记基因。通过同源重组，包含 该选择性标记基因的缺陷基因被缺乏该选择性标记基因的核酸片段替换。还可以使用本领 域已知的其他方法。
[0090] 还描述了产生在此描述的芽孢杆菌属突变体的方法。在一个方面中，是一种用于 获得在此描述的芽孢杆菌属突变体的方法，该方法包括在亲本芽孢杆菌属菌株中破坏内源 mecA基因和内源sinl基因。在另一个方面中，是一种用于获得在此描述的芽孢杆菌属突变 体的方法，该方法包括：(a)培养亲本芽孢杆菌属菌株；(b)破坏（a)的亲本芽孢杆菌属菌 株中的内源mecA基因和内源sinl基因；并且（c)分离从（b)中所得突变体菌株。
[0091 ] 转化的DNA及相关方法
[0092] 将在此描述的芽孢杆菌属突变体用于产生芽孢杆菌属转化株。在一个方面中，是 一种获得芽孢杆菌属转化株的方法，该方法包括将异源多核苷酸转化进在此描述的芽孢杆 菌属突变体中。在另一个方面中，是一种获得芽孢杆菌属转化株的方法，该方法包括：(a) 培养在此描述的芽孢杆菌属突变体；(b)将异源多核苷酸转化进（a)的该芽孢杆菌属突变 体中；并且（c)分离从（b)中所得转化株菌株。
[0093] 在此描述的转化的DNA可以是任何感兴趣的DNA。DNA可以是基因组、cDNA、半合 成、合成来源的，或其任何组合。DNA可以是编码具有感兴趣的生物学活性的任何多肽的异 源多核苷酸或可以是具有生物学活性的多肽的表达中涉及的DNA(例如启动子）。
[0094] 具有生物学活性的该多肽可以是任何感兴趣的多肽。该多肽对于感兴趣的芽孢杆 菌属宿主细胞而言可以是天然的或外源的。该多肽可以是以下提及的多肽和杂合多肽的天 然发生的等位基因变异和工程化变异。
[0095] 术语"多肽"在此不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋 白。术语"多肽"还涵盖杂合多肽，其包括自至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列 的组合，其中一种或多种序列对于芽孢杆菌属细胞而言可以是外源的。多肽进一步包括多 肽的天然发生的等位基因变异和工程化变异。
[0096] 在一个方面中，该多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂 (immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白以及转录因子。
[0097] 在另一个方面中，该多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接 酶。在一个最优选的方面中，该多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化 氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α -半乳糖 苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、转化酶、漆 酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚 氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
[0098] 在另一个方面中，该多肽是白蛋白、胶原、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶。
[0099] 在另一个方面中，该多肽是一种杂合多肽，其包括自至少两种不同多肽获得的部 分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种序列对于芽孢杆菌属宿主细胞而言可以是外源 的。
[0100] 在另一个方面中，该多肽是一种融合多肽，其中另一种多肽融合在该多肽或其片 段的N-末端或C-末端。通过将编码一种多肽的核苷酸序列（或其部分）融合至编码另一 种多肽的核苷酸序列（或其部分）而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是 已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且融合多肽的表达处于 相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。
[0101] 编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸可以由任何原核、真核或其他来源获得。出于 本发明的目的，在此与给定来源结合使用的术语"从……中获得"应意指该多肽由该来源或 有其中已经插入来自该来源的基因的细胞产生。
[0102] 用来分离或克隆编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸的技术在本领域中是已知的， 并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。例如通过使用熟知的聚合酶链式反应 (PCR)可以实现从此类基因组DNA中克隆感兴趣的DNA。参见例如，英尼斯（Innis)等人， PCR 方案：方法与应用指南（PCR Protocols: A Guide to Methods and Application)，学术 出版社，纽约，1990。克隆程序可以涉及切割并分离包括编码该多肽的核酸序列的希望的核 酸片段，将该片段插入进载体分子中，并且将该重组载体掺入芽孢杆菌属突变体中，其中该 核酸序列的多个拷贝或克隆将被复制。DNA可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的， 或其任何组合。
[0103] 可以按多种方式操作编码感兴趣的多肽的异源多核苷酸，以在突变体芽孢杆菌属 菌株中提供该多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸序列插入进载体之前对其进行操 作可以是令人希望的或必要的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域是熟 知的。
[0104] 可以将包括编码多肽的多核苷酸的核酸构建体可操作地连接至一个或多个（例 如，两个、若干个）控制序列，这些控制序列能够在与这些控制序列相容的条件下，指导编 码序列在本发明的突变体芽孢杆菌属菌株中的表达。
[0105] 控制序列可以是一个适当的启动子序列、一个为本发明的突变体芽孢杆菌属菌株 所识别的核苷酸序列，用于表达编码该多肽的该多核苷酸。启动子序列包括介导该多肽的 表达的转录控制序列。启动子可以是在突变体芽孢杆菌属菌株中显示出转录活性的任何核 苷酸序列，包括突变体、截短和杂合启动子，并且可以获得自编码对该突变体芽孢杆菌属菌 株而言天然或外源的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0106] 用于指导核酸构建体在突变体芽孢杆菌属菌株中进行转录的适合启动子的实例 是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀 粉酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶 基因（amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢杆菌xylA以及xylB基 因、大肠杆菌Iac操纵子、大肠杆菌trc启动子（埃贡（Egon)等人，基因（Gene) 1988,69， 301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因（dagA)，以及原核β-内酰胺酶基因（维拉-卡马 洛夫（Villa-Kamaroff)等人，美国国家科学院学报（Proc. NatL Acad Sci. U.S.A.) 1978， 75,3727-3731)，以及tac启动子（德波尔（DeBoer)等人，美国国家科学院学报（Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 1983,80,21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特（Gilbert)等 人，Scientific American(科学美国人）1980,242,74-94中的"来自重组细菌的有用蛋白 (Useful proteins from recombinant bacteria) " ；以及萨拉布鲁克（Sambrook)等人， 1989,见上文中。
[0107] 该控制序列还可以是一种适合的转录终止子序列，一种为突变体芽孢杆菌属菌株 所识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接至编码异源多肽的核苷酸序列的3' 末端。可以使用在芽孢杆菌属菌株中具有功能的任何终止子。
[0108] 该控制序列还可以是一种适合的前导序列，即对突变体芽孢杆菌属菌株翻译而言 重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码异源多肽的核苷酸序列的5'末端。 可以使用在突变体芽孢杆菌属菌株中具有功能的任何前导序列。
[0109] 该控制序列还可以是一种信号肽编码序列，其编码连接至多肽的氨基末端并指导 编码的多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列。核苷酸序列的编码序列的5'端可以固有地 包含在翻译阅读框中与编码分泌的多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码 序列。或者，编码序列的5'端可以包含对于该编码序列而言外源的一个信号肽编码序列。 在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替 代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然 而，可以在本发明中使用指导表达的多肽进入突变体芽孢杆菌属菌株分泌途径的任何信号 肽编码序列，即被分泌进培养基中。
[0110] 可以将重组表达载体用于重组产生感兴趣的多肽，该重组表达载体包括一个核苷 酸序列、一个启动子以及转录和翻译终止信号。可以将在此描述的各种核酸和控制序列连 接在一起以产生一个重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个（例如，两个、若 干个）适当的限制酶切位点，以允许在此类位点处插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可 替代地，可以通过将该核苷酸序列或包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中 来表达该核苷酸序列。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码 序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0111] 该重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该核苷酸序 列表达的任何载体（例如，质粒或病毒）。载体的选择将典型地取决于该载体与该载体有 待引入其中的突变体芽孢杆菌属菌株的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质 粒。
[0112] 该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染 色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保 自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入突变体芽孢杆菌 属菌株中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此 夕卜，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含有待 引入到突变体芽孢杆菌属菌株的基因组中的总DNA)或转座子。
[0113] 该载体可以包含一个或多个（例如，两个、若干个）允许容易选择转化的突变体芽 孢杆菌属菌株的选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性 或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0114] 用于在突变体芽孢杆菌属菌株中使用的选择性标记的实例包括但不限于，来自枯 草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性（例如氨比西林、氯霉素、卡那 霉素或四环素抗性）的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、 TRPl 以及 URA3。
[0115] 该载体可以包含一个或多个（例如，两个、若干个）允许将该载体整合进芽孢杆菌 属基因组中或在该细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
[0116] 用于整合进突变体芽孢杆菌属菌株的基因组中，该载体可以依赖于编码感兴趣的 多肽的多核苷酸的序列或该载体的通过同源或非同源重组而整合进该基因组中的任何其 他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合进突变体芽孢杆菌属菌 株的基因组的染色体中的一个或多个精确位置处的另外的核苷酸序列。为了增加在精确位 置处整合的可能性，这些整合的元件应该优选包含足够数目的核酸，例如100至1，500个碱 基对，优选400至1，500个碱基对，并且最优选800至1，500个碱基对，这些碱基对与对应 的靶序列具有高一致性程度以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与突变体芽孢 杆菌属菌株的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码或编 码核苷酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组而整合进突变体芽孢杆菌属菌株的 基因组中。
[0117] 对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在突变体芽孢杆菌属菌株中 自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制 子。在此将术语"复制起源"或"质粒复制子"定义为使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸 序列。在突变体芽孢杆菌属菌株中有用的细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复 制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUBllO、 pE194、pTA1060 及 ρΑΜ β 1 的复制起点。
[0118] 用于连接在此描述的元件以构建重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员 所熟知的（参见例如，J.萨姆布鲁克（Sambrook)，E.F.弗里奇（Fritsch)和Τ.马尼亚蒂 斯（Maniatis)，1989,分子克隆实验手册（Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第 2 版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，纽约）。
[0119] DNA还可以是用于操纵感兴趣的基因的表达的控制序列，例如启动子。上文描述了 控制序列的非限制性实例。
[0120] DNA可以进一步是用于使芽孢杆菌属细胞中的感兴趣基因失活的核酸构建体。
[0121] DNA并不限于上面披露的具体实例的范围，因为这些实例意图作为本发明若干方 面的说明。
[0122] 可以使用本领域已知的技术，例如如描述于以下实例部分中的电穿孔，而将DNA 转化进突变体芽孢杆菌属菌株中。
[0123] 可以使用本领域熟知的标准技术分离在此描述的转化株，包括但不限于，划线平 板分离、在富集或选择性培养基中生长、温度生长选择、过滤、或单细胞分离技术（例如流 式细胞术和微流体技术）。
[0124] 产生多肽和发酵产品的方法
[0125] 金肽
[0126] 如上文所提及，在此描述的芽孢杆菌属突变体可以增加产生芽孢杆菌属转化株的 效率，这在例如产生具有生物学活性的多肽中是有用的。因此，在一个方面中，是一种产生 具有生物学活性的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养用编 码该多肽的异源多核苷酸转化的芽孢杆菌属宿主细胞，其中该芽孢杆菌属宿主细胞是一种 在此描述的芽孢杆菌属突变体（例如，包括对内源mecA基因和内源sinl基因的破坏的芽 孢杆菌属突变体）；并且（b)回收该多肽。
[0127] 在另一个方面中，是一种产生多肽的方法，该方法包括：(a)培养在此描述的芽孢 杆菌属转化株（例如包括对内源mecA基因和内源sinl基因的破坏的芽孢杆菌属突变体）； 并且（b)回收该多肽。
[0128] 使用本领域已知的方法，在适于产生感兴趣的多肽的营养培养基中培养感受态芽 孢杆菌属宿主细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离感兴趣的 多肽的条件下，进行摇瓶培养，在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括 连续，分批，分批补料或固态发酵）来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一 种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供 应商获得或可以根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。可 以直接从培养基中回收分泌的感兴趣物质，例如多肽或发酵产品。
[0129] 可以使用本领域已知的专门用于该物质的方法检测具有生物学活性的多肽。这 些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、醉底物 的消失或SDS-PAGE。例如，可以使用酶测定来确定具有酶活性的多肽的活性。对于许多 酶而言，用于确定酶活性的程序在本领域是已知的（参见例如，D.朔姆堡（Schomburg) 和扎尔茨曼（M. Salzmann)(编辑），酶手册（Enzyme Handbook)，施普林格出版社 (Springer-Verlag)，纽约，1990) 〇
[0130] 可以通过本领域已知的方法分离具有生物学活性的所得多肽。例如，可以通过常 规程序，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从培养基中分离感兴趣的 多肽。然后，可以通过本领域已知的多种程序进一步纯化分离的多肽，这些程序包括但不限 于层析（例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析和大小排阻层析）、电泳方法 (例如，制备性等电聚焦（IEF))、差别溶解度（例如，硫酸铵沉淀）、或萃取（参见，例如，蛋 白纯化（Protein Purification)，编者 J.-C.詹森（Janson)和拉尔斯赖登（Lars Ryden)， VCH出版社，纽约，1989)。
[0131] 发酵产品
[0132] 在此描述的芽孢杆菌属突变体可以用于代谢工程中，例如用于产生发酵产品。这 些突变体的增加的转化效率可以提供使用芽孢杆菌属优于现有宿主的工具，并且可以允许 迅速筛选过量表达的异源基因，用于现有及新的代谢途径。
[0133] "发酵"或"发酵过程"是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程 包括用于消费性醇工业（例如，啤酒和葡萄酒）、乳品工业（例如，发酵的乳制品）、皮革工 业、烟草工业以及特种或散装化学品工业的发酵过程。
[0134] 在一个方面中，是一种产生发酵产品的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该发 酵产品的条件下，培养在此描述的芽孢杆菌属转化株（例如，用一个或多个编码发酵途径 的一种或多种多肽的异源多核苷酸转化的、在此描述的芽孢杆菌属突变体）；并且（b)回收 该发酵产品。
[0135] 该芽孢杆菌属转化株可以是在此描述的任何芽孢杆菌属突变体，该突变体用一 个或多个异源发酵途径基因转化，从而引起希望的发酵产品的产生增加。用于发酵多种 希望的发酵产品的代谢途径基因及相应的工程化转化株在本领域是已知的，例如以下各 项的产生：异丙醇和正丙醇（W0 2012/058603)、3_羟基丙酸（W0 2005/118719)、苹果酸 (W0 2011/028