评估用于施用的转导t细胞的适用性的方法
【专利说明】评估用于施用的转导T细胞的适用性的方法
[0001] 关于联邦资助的研宄或开发的声明
[0002] 本发明在美国国立卫生研宄院（NIH)给予的资助号K24CA11787901、 1PN2-EY016586、1R01CA105216、1R01CA120409、R01AI057838 和 R01113482 下利用政府支持 完成。政府拥有本发明中的某些权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671，495的优先权，其内 容在此通过引用以其全部并入本文。
【背景技术】
[0005] 大部分具有B-细胞恶性肿瘤一一包括慢性淋巴细胞白血病（CLL)的患者，将死于 他们的疾病。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体（CAR)的 表达靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR为设计来以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别 细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰细胞治疗这些类型患者的尝试已经 得到非常有限的成功。见例如，Brentjens 等，2010，Molecular Therapy, 18:4,666-668; Morgan 等，2010，Molecular Therapy, 2010 年 2月 23 日在线公布，1-9 页；和 Till 等，2008, Blood, 112:2261-2271。
[0006] 尽管CAR可以以类似于内源T-细胞受体的方式引发T-细胞活化，但至今该技术 的临床应用的主要阻碍已经限于CAR+T细胞的体内扩展、注入后细胞的快速消失和令人失 望的临床活性（Jena 等，Blood, 2010, 116:1035-1044 ;Uckun 等，Blood, 1988,71:13-29)。 产生用于施用给人的基因修饰的T细胞的方法具有产生不需要的污染物的可能性，所述污 染物可在施用后对基因修饰的T细胞的持续和功能造成负面影响。
[0007] 因此，在本领域中需要通过检测可以对基因修饰细胞的持续和功能造成负面影响 的污染物，分析用于施用给受试人的转导T细胞的适用性。本发明满足了该需要。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了分析基因修饰的T细胞以检测污染物的方法，其中基因修饰的T细 胞包括编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺 激信号传导区和信号传导结构域。
[0009] 在一个实施方式中，基因修饰的T细胞通过用慢病毒载体转导被基因修饰。
[0010] 在一个实施方式中，污染物是选自内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒（RCL)、 p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗-⑶3/抗-⑶28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血 清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌中的至少一种。
[0011] 在一个实施方式中，细菌是选自粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、 脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群中的至少一 种。
[0012] 在一个实施方式中，信号传导结构域是CD3 ζ信号传导结构域。
[0013] 在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗体或其抗原-结合片段。
[0014] 在一个实施方式中，抗原-结合片段是Fab或scFv。
[0015] 在一个实施方式中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
[0016] 在一个实施方式中，肿瘤抗原与血液学恶性肿瘤相关。
[0017] 在一个实施方式中，肿瘤抗原与实体瘤相关。
[0018] 在一个实施方式中，肿瘤抗原选自⑶19、⑶20、⑶22、ROR1、间皮素、⑶33/IL3Ra、 c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、NY-ESO-I TCR、MAGE A3 TCR 和其任何组合。
[0019] 在一个实施方式中，共刺激信号传导区包括选自⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、 CD40、PD-1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与 CD83特异性结合的配体和其任何组合的共刺激分子的胞内结构域。
[0020] 在一个实施方式中，因为污染物的鉴定和定量，基因修饰的T细胞不被施用给受 试人。
[0021] 在一个实施方式中，因为与相应的对照水平相比污染物的量过多，基因修饰的T 细胞不被施用给受试人。
【附图说明】
[0022] 当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为 了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于 附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
[0023] 图1，包括图IA至1C，是基因转移载体和转基因、基因修饰的T细胞制造和临床方 案设计的示意图的一系列图像。图IA描绘了显示主要功能元件的慢病毒载体和转基因。 产生了指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFv、人CD8a铰链和跨膜结构域、和人 4-1BB与CD3 ζ信号传导结构域的表达的水泡性口炎病毒G蛋白假型临床等级慢病毒载体 (命名为pELPsl9BBZ)。通过包括EF-la(延伸因子-la启动子）；LTR，长末端重复 ；RRE， rev应答元件（cPPT)和中央终止序列（CTS)，指导转基因的组成型表达。图不是按比例的。 图IB描绘了 T细胞制造。自体细胞经由单采血液成分术获得，并且对于非-CLL研宄对象， T细胞通过单核细胞淘洗（elutriation)富集。对于CLL对象，残余的白血病细胞通过添 加抗-⑶3/⑶28包被的顺磁珠用于阳性选择和T细胞活化而被耗尽。对于非-CLL对象，冲 洗淘洗的细胞，然后通过添加抗-CD3/CD28包被的顺磁珠用于T细胞活化。慢病毒载体在 细胞活化时被添加，并在培养开始后第3天被冲洗掉。两天后，细胞在摇动平台装置（WAVE Bioreactor System)上扩展额外的3-7天。在培养的最后一天，通过经过磁场珠被移出，并 且CART19T细胞被收获、冲洗和冷藏在难溶的（infusible)培养基中。图IC描绘了临床方 案设计。给予患者如上所述的淋巴耗尽（Iymphodepleting)化疗，随后在15-20分钟的时 期内通过静脉内重力流滴注CART19注入剂#1。在完成化疗后1至5天开始，利用在3天内 的分次剂量方法（10%、30%、60%)给予注入。在研宄第4周进行终点测定。在主动监测 结束后，按照FDA指南，对象被转移至目标流程，以长期追踪。
[0024] 图2描绘了 CART-19细胞的制造方法。
[0025] 图3是列出了在转导T细胞上执行的分析的类型的表格。
[0026] 图4描绘了在离体培养时期期间，量化VSV-G核酸的分析的结果。
[0027] 图5描绘了在离体培养时期期间，量化HIVgag核酸的分析的结果。
[0028] 发明【具体实施方式】
[0029] 本发明涉及生产包括编码嵌合抗原受体（CAR)的核酸的载体的方法，所述载体适 于目的用于施用给受试人的T细胞的转导。本发明还涉及用包括编码嵌合抗原受体（CAR) 的核酸的载体转导T细胞的方法，目的用于施用给受试人。在优选的实施方式中，载体是慢 病毒载体。本发明涉及采用慢病毒载体转导以表达CAR的T细胞的过继细胞转移。CAR是 联合对期望的靶抗原（例如肿瘤抗原）的基于抗体的特异性和T细胞受体-活化胞内结构 域以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0030] 在一些实施方式中，本发明的方法涉及分析对转导T细胞目的用于施用给受试人 有用的载体上清液的方法。在其它实施方式中，本发明的方法涉及分析目的用于施用给受 试人的转导T细胞的方法。在各种实施方式中，本发明的分析方法包括分析T细胞存活、T细 胞特性（例如 CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD45RA、CD57、CD62L、CD95、CD127、CD134、CD244、 CCR7、CD40L、CTLA4、ro-1、HLA-DR、??Μ3、Ki-67、穿孔蛋白和/或粒酶表达）、转导效率的方 法，以及检测和量化与制造工艺有关的污染物的方法，所述污染物例如内毒素、支原体、具 有复制能力的慢病毒（RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、 小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细 菌（例如粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、 金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群）和真菌。本发明不限制于任何具体的污 染物。相反地，本发明包括影响转导T细胞的安全或功效的任何污染物的分析方法。
[0031] 本发明一般地涉及使用载体以基因修饰T细胞从而稳定表达期望的CAR。表达CAR 的T细胞在本文被称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，该细胞可被基因修饰以 在其表面上稳定表达抗体结合结构域，给予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些实例 中，T细胞被基因修饰以稳定表达CAR，所述CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3- ζ 链或Fcy RI蛋白的胞内结构域结合为单一嵌合蛋白。
[0032] 在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜 结构域和胞浆结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜 结构域。在另一个实施方式中，可选择或由氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这样的结构 域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其它成员的相 互作用。优选地，跨膜结构域为⑶8 α铰链结构域。
[0033] 相对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计为由其本身包括CD28和/或4-1ΒΒ信 号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容中有用的任何其它期望的胞浆结构域（一个或 多个）联合。在一个实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计为进一步包括CD3-G的信号 传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于⑶3- ζ、4-1ΒΒ和⑶28信号传导模 块和其组合。因此，本发明提供了 CAR T细胞和它们用于过继疗法的方法。
[0034] 本发明包括生产包括编码抗-⑶19CAR的核酸的载体的方法，所述抗-⑶19CAR包 括⑶3-ζ和4-1BB共刺激结构域二者。在一个实施方式中，载体包括期望的CAR，例如包括 抗-⑶19、⑶8 α铰链和跨膜结构域，以及人4-1BB和⑶3 ζ信号传导结构域的CAR。本发 明不限于包括抗-⑶19的CAR，而也包括与选自⑶137 (4-1BB)信号传导结构域、⑶28信号 传导结构域、CD3G信号结构域和其任何组合的一个或多个胞内结构域融合的任何抗原结 合部分。在优选的实施方式中，载体为慢病毒载体。
[0035]
[0036] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人 员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等同于本文描述的 那些方法和材料的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要 求保护本发明时，将使用以下术语。
[0037] 也应理解本文使用的术语仅是为了描述【具体实施方式】的目的，并不意欲是限制性 的。
[0038] 本文使用的冠词"一个（a) "和"一个（an) "指的是一个或多于一个（即，指的是 至少一个）的该冠词语法对象。举例说明，"一个元件"表示一个元件或多于一个的元件。
[0039] 如本文使用的"大约"，当指的是诸如量、时间期间等可测量的值时，表示包括从 给定值的±20%或±10%，在一些实例中±5%，在一些实例中±1%，和在一些实例中 ±0. 1 %的变化，只要这些变化适于实施公开的方法。
[0040] "活化"，如本文所使用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细 胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语"活化的T 细胞"指的是经历细胞分裂的T细胞等。
[0041] 术语"抗体"，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗 体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫 反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存 在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab) 2，以及单链抗体和人源化抗体 (Harlow 等,1999, In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ；Harlow 等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird 等，1988, Science 242:423-426)。
[0042] 术语"抗体片段"指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变 区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段，由抗体片段形成的线性 抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
[0043] "抗体重链"，如本文所用的，指的是以其自然发生构象存在于所有抗体分子中的 两种类型的多肽链中较大的链。
[0044] "抗体轻链"，如本文所用的，指的是以其自然发生构象存在于所有抗体分子中的 两种类型的多肽链中较小的链。κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
[0045] 如本文所用的术语"合成抗体"，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，如本 文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗 体，所述DNA分子编码该抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定该抗体的氨基酸序列，其 中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
[0046] 如本文所用的术语"抗原"或"Ag"被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可 涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解实际上包括所有的 蛋白质或肽的任何大分子可用作抗原。此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员 将理解任何DNA-一其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列， 因此编码如本文使用的术语"抗原"。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因 的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个的基因的部分核 苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置以引起期望的免疫应答。而 且，技术人员将理解抗原根本不必由"基因"进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、 合成或可源自生物学样本。这样的生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或 生物学流体。
[0047] 如本文所用的术语"抗肿瘤效应"，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减小、月中 瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状 的改善清楚表示。"抗肿瘤效应"也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第 一位置的发生的能力清楚表示。
[0048] 根据本发明，术语"自体抗原"指由免疫系统错误识别为外源的任何自身抗原。自 体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，其包括细 胞表面受体。
[0049] 如本文所用的术语"自身免疫疾病"被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自身 免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的实例包括但不限于阿 狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病 (I型）、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴 雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型 天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病 变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
[0050] 如本文所用的，术语"自体"指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入 该个体。
[0051] "同种异基因的（allogeneic) "指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
[0052] "异种的（xenogeneic) "指的是源自不同物种的动物的移植物。
[0053] 如本文所用的术语"癌症"被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。 癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其它部分。各种癌症的实例包括 但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑 癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0054] 如本文使用的术语"共刺激配体"包括特异性结合T细胞上的关联共刺激分子的 抗原呈递细胞（例如aAPC、树突细胞、B细胞等等）上的分子，由此除了通过例如将TCR/ CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信 号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、 B7-1 (CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可诱导的共刺激配体（ICOS-L)、 细胞间粘附分子（ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素 β 受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与Β7-Η3特异性结 合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗 体，例如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴细胞功能相关抗 原-I (LFA-I)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3 和与 CD83 特异性结合的配体。
[0055] "共刺激分子"指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此 通过T细胞介导共刺激应答，例如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、 BTLA和Toll配体受体。
[0056] 如本文所用的，"共刺激信号"指的是与初级信号结合的信号，例如TCR/CD3连接作 用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
[0057] "疾病"是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，并且其中如果不改善该 疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的"紊乱"是一种健康状态，其中动物能够 保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不 必定引起动物健康状态的进一步降低。
[0058] 如本文所用的"有效量"，指提供治疗性或预防性益处的