识别α-突触核蛋白的人源化抗体的制作方法
【专利说明】识别α-突触核蛋白的人源化抗体
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求于2012年1月27日递交的美国临时专利申请No. 61/591,835以及于 2012年8月8日递交的美国临时专利申请No. 61/711，207的优先权，出于所有目的，以上两 个临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本申请中。
【背景技术】
[0003] 突触核蛋白病，包括路易体病（路易体病，LBDs)的特征是多巴胺能神经系统 退化，行动改变，认知障碍以及路易小体（Lewy bodies，LBs)和/或路易神经突（Lewy neurites)形成（参考 McKeith et al·，Neurology(1996)47:1113_24)。突触核蛋白病包 括帕金森氏病（包括特发性帕金森氏病），弥漫性路易体病（DLBD)也被称为路易体痴呆 (DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型、综合阿尔茨海默病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰 竭和多系统萎缩（multiple system atrophy，MSA，例如，橄榄桥脑小脑萎缩、纹状体黑质变 性和Shy-Drager综合征）。在疾病的前驱阶段（例如，症状前阶段，亚临床阶段，临床前阶 段或运动前期（premotor period))，一些非运动（nonmotor)信号和症状被认为是突触核 蛋白病的预兆。这样的早期信号包括，例如，REM睡眠行为紊乱（RBD)，嗅觉丧失以及便秘 (参考（Mahowald et al. ,Neurology (2010) 75:488-489)。在老年群体中，路易体病仍然是 运动障碍和认知退化的普遍原因。
[0004] α -突触核蛋白是包括β和γ -突触核蛋白和Synoretin(突触核蛋白新家族成 员）在内的大蛋白家族的一部分。α -突触核蛋白在与突触相关的正常状态下表达，被认为 在神经可塑性、学习和记忆中起到关键作用。几项研宄已经暗示α-突触核蛋白在帕金森 氏病发病机理中起到中心作用。在发病条件下，该蛋白能够聚集，形成不可溶性的原纤维。 例如，突触核蛋白在 LBs 中聚集（参考 Spillantini et al.，Nature(1997)388:839-40; Takeda et al. , J.Pathol. (1998) 152:367-72 ；ffakabayashi et al. , Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8)。α -突触核蛋白基因的突变与帕金森氏病罕见的家族形式共分离 (co-segregate)(参见 Kruger et al·，Nature Gen. (1"8)18 :l〇6-8;Polymero poulos， et al.，Science(1997)276:2045_7)。α-突触核蛋白在转基因小鼠 （Masliah et al·， Science (2000) 287:1265-9)和果蝇（参见 Feany et al·，Nature (2000) 404:394-8)中的 过度表达模拟了路易体病病理学的几个方面。此外，已有研宄显示可溶性的突触核蛋白寡 聚化可能毒害神经（参见 Conway et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:571 - 576 ; Voiles et al.，J. Biochemistry(2003)42:7871 - 7878)。在多个物种和动物模型（如人 类、小鼠和果蝇）中具有相似形态和神经病变的α-突触核蛋白的聚集表明该分子在路易 体病的发病中起了作用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了包括成熟重链可变区域（所述成熟重链可变区域包括SEQ ID Ν0:44 的三个Kabat CDR(Kabat互补决定区），与SEQ ID Ν0:44具有至少90%的同一性）和轻链 (所述轻链包括SEQ ID NO:45的三个Kabat CDR，与SEQ ID NO:45具有至少90 %的同一 性）的抗体。在一些抗体中，成熟重链可变区域与SEQ ID N0:44具有至少95%、96%、97%、 98%或99%的同一性，成熟轻链可变区域与SEQ ID N0:45具有至少95%、96%、97%、98% 或99%的同一性。在一些抗体中，第L46位（Kabat编号）可能被F占据，第L49位（Kabat 编号）可能被C占据；第L83位（Kabat编号）可能被A占据；第Hll位（Kabat编号）可能 被L占据；第H28位（Kabat编号）可能被S占据；第H38位（Kabat编号）可能被K占据； 第H48位（Kabat编号）可能被I占据；第H67位（Kabat编号）可能被A占据；第H69位 (Kabat编号）可能被L占据；第H71位（Kabat编号）可能被A占据；和/或第H91位（Kabat 编号）可能被F占据。在某些这样的抗体中，第H97位（Kabat编号）可能被S占据。在某 些这样的抗体中，成熟重链可变区域的氨基酸序列是SEQ ID N0:44,成熟轻链可变区域的 氨基酸序列是SEQ ID N0:45,但第L46位（Kabat编号）可能被L或F占据，和/或第L49位 (Kabat编号）可能被Y或C占据，和/或第L83位（Kabat编号）可能被A或C占据，和/ 或第Hll位（Kabat编号）可能被V或L占据，和/或第H28 (Kabat编号）可能被T或S占 据，和/或第H38 (Kabat编号）可能被R或K占据，和/或第H48 (Kabat编号）可能被M或 I占据，和/或第H67 (Kabat编号）可能被V或A占据，和/或第H69 (Kabat编号）可能被 M或L占据，和/或第H71 (Kabat编号）可能被T或A占据，和/或第H91 (Kabat编号）可 能被Y或F占据，和/或第H97 (Kabat编号）可能被C或S占据。在某些这样的抗体中，第 H71位（Kabat编号）被A占据。在某些这样的抗体中，第H67位（Kabat编号）被A占据， 第H71位（Kabat编号）被A占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占 据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被C 占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被C 占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被 Y占据。在某些这样的抗体中，第H67位（Kabat编号）被A占据，第H71位（Kabat编号） 被A占据，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被C占据。在某些这 样的抗体中，第Hll位（Kabat编号）被L占据，第H38位（Kabat编号）被K占据。在某些 这样的抗体中，第Hll位（Kabat编号）被V占据，第H38位（Kabat编号）被R占据。在某 些这样的抗体中，第H28位（Kabat编号）被S占据，第H48位（Kabat编号）被I占据，第 H69位（Kabat编号）被L占据，第H91位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体中， 第H28位（Kabat编号）被T占据，第H48位（Kabat编号）被M占据，第H69位（Kabat编 号）被M占据，第H91位（Kabat编号）被Y占据。在某些这样的抗体中，第L83位（Kabat 编号）被A占据。在某些这样的抗体中，第L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的 抗体中，第H97位（Kabat编号）被S占据。在某些这样的抗体中，第H97位（Kabat编号） 被C占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编 号）被C占据，第L83位（Kabat编号）被A占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat 编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被Y占据，第L83位（Kabat编号）被A占据。在 某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被C占据，第 L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占据， 第L49位（Kabat编号）被Y占据，第L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体 中，第Hll位（Kabat编号）被L占据，第H28位（Kabat编号）被S占据，第H38位（Kabat 编号）被I占据，第H48位（Kabat编号）被I占据，第H67位（Kabat编号）被A占据，第 H69位（Kabat编号）被L占据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第H91位（Kabat编号） 被F占据，第H97位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第Hll位（Kabat编号） 被V占据，第H28位（Kabat编号）被S占据，第H38位（Kabat编号）被R占据，第H48位 (Kabat编号）被I占据，第H67位（Kabat编号）被A占据，第H69位（Kabat编号）被L占 据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第H91位（Kabat编号）被F占据，第H97位（Kabat 编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第Hll位（Kabat编号）被V占据，第H28位（Kabat 编号）被T占据，第H38位（Kabat编号）被R占据，第H48位（Kabat编号）被M占据，第 H67位（Kabat编号）被A占据，第H69位（Kabat编号）被M占据，第H71位（Kabat编号） 被A占据，第H91位（Kabat编号）被Y占据，第H97位（Kabat编号）被C占据。在某些这 样的抗体中，第Hll位（Kabat编号）被V占据，第H28位（Kabat编号）被S占据，第H38位 (Kabat编号）被R占据，第H48位（Kabat编号）被I占据，第H67位（Kabat编号）被A占 据，第H69位（Kabat编号）被L占据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第H91位（Kabat 编号）被F占据，第H97位（Kabat编号）被S占据。在某些这样的抗体中，第Hll位（Kabat 编号）被V占据，第H28位（Kabat编号）被T占据，第H38位（Kabat编号）被R占据，第 H48位（Kabat编号）被M占据，第H67位（Kabat编号）被A占据，第H69位（Kabat编号） 被M占据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第H91位（Kabat编号）被Y占据，第H97位 (Kabat编号）被S占据。在某些这样的抗体中，成熟重链可变区域的氨基酸序列是SEQ ID NO: 44,而成熟轻链可变区域的氨基酸序列是SEQ ID NO: 45。
[0006] 本发明进一步提供了一种包括人源化重链和人源化轻链的抗体，所述人源化重链 含有SEQ ID NO: 44的三个Kabat CDR，所述人源化轻链含有SEQ ID NO: 45三个CDR，但是第 L46位（Kabat编号）被F占据，和/或第L49位（Kabat编号）被C占据，和/或第L83位 (Kabat编号）被F占据，和/或第Hll位（Kabat编号）被V占据，和/或第H28和/或第 Hll位（Kabat编号）被V占据，位（Kabat编号）被T占据，和/或第H48位（Kabat编号） 被M占据，和/或第H67位（Kabat编号）被A占据，和/或第H69位（Kabat编号）被M占 据，和/或第H71位（Kabat编号）被A占据，和/或第H91位（Kabat编号）被Y占据，和 /或第H97位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F 占据，第L49位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第H67位（Kabat编号）被 A占据，第H71位（Kabat编号）被A占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号） 被F占据，第H67位（Kabat编号）被A占据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第L49位 (Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第Hll位（Kabat编号）被V占据，第H38 位（Kabat编号）被R占据。在某些这样的抗体中，第H28位（Kabat编号）被T占据，第 H48位（Kabat编号）被M占据，第H69位（Kabat编号）被M占据，第H91位（Kabat编号） 被Y占据。在某些这样的抗体中，第L49位（Kabat编号）被C占据，第L83位（Kabat编 号）被F占据。在某些这样的抗体中，第H28位（Kabat编号）被T占据，第H48位（Kabat 编号）被M占据，第H69位（Kabat编号）被M占据，第H91位（Kabat编号）被Y占据，第 L49位（Kabat编号）被C占据，第L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体中， 第H97位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中，第L46位（Kabat编号）被F占 据，第L49位（Kabat编号）被C占据，第L83位（Kabat编号）被F占据，第Hll位（Kabat 编号）被V占据，第H28位（Kabat编号）被T占据，第H38位（Kabat编号）被R占据，第 H48位（Kabat编号）被M占据，第H67位（Kabat编号）被A占据，第H69位（Kabat编号） 被M占据，第H71位（Kabat编号）被A占据，第H91位（Kabat编号）被Y占据，第H97位 (Kabat编号）被C占据。
[0007] 本发明进一步提供了一种包括成熟重链可变区域和成熟轻链可变区域的抗体，所 述成熟重链可变区域的氨基酸序列与SEQ ID NO:23至少有90%的同一性，所述成熟轻链可 变区域的氨基酸序列与SEQ ID NO:37至少有90%的同一性。在某些这样的抗体中，成熟重 链可变区域含有SEQ ID NO: 23的三个Kabat CDR，成熟轻链可变区域含有SEQ ID NO: 37分 绒三个Kabat⑶R，且第H67位（Kabat编号）被A占据，第71位（Kabat编号）被A占据， 第L46位（Kabat编号）被F占据，第L49位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体 中，第L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体中，第H97位（Kabat编号）被C 占据。在某些这样的抗体中，成熟重链可变区域与SEQ ID N0:23至少有95%的序列同一 性，成熟轻链可变区域与SEQ ID N0:37至少有95%的序列同一性。在某些这样的抗体中， 成熟重链可变区域和成熟轻链可变区域CDR与SEQ ID NOs. 52和60中的所有差别分别位 于第H60?H65位。在某些这样的抗体中，抗体对α-突触核蛋白Kd值是小鼠抗体或嵌合 1Η7抗体对α -突触核蛋白Kd值的0. 5?2倍。在某些这样的抗体中，第L83位（Kabat编 号）被F或A占据，第Hll位（Kabat编号）被V占据，第Η28位（Kabat编号）被T占据， 第Η38位（Kabat编号）被R占据，第Η48位（Kabat编号）被M占据，第Η67位（Kabat编 号）被A占据，第Η69位（Kabat编号）被M占据，第Η71位（Kabat编号）被A占据，第Η91 位（Kabat编号）被Y占据，以及第Η97位（Kabat编号）被C占据。在某些这样的抗体中， 第L83位（Kabat编号）被F占据。在某些这样的抗体中，第Η97位（Kabat编号）被C占 据。在某些这样的抗体中，成熟重链可变区域的可变区域框和SEQ ID Ν0:23的所有差别 是第Hll位（Kabat编号）被F占据；第Η28位（Kabat编号）被T占据；第Η38位（Kabat 编号）被R占据；第Η48位（Kabat编号）被M占据；第Η69位（Kabat编号）被M占据；第 Η91位（Kabat编号）被Y占据中的一个或多个。在某些这样的抗体中，成熟轻链可变区域 的可变区域框和SEQ ID NO: 37的所有差别是第L83位（Kabat编号）被A占据。在某些这 样的抗体中，成熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:23所示的氨基酸序列，成熟轻链可变区 域具有如SEQ ID N037所示的氨基酸序列。
[0008] 在某些抗体中，成熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:44所示的氨基酸序列，成熟 轻链可变区域具有如SEQ ID N0:45、33、35、37或39所示的氨基酸序列。在某些抗体中，成 熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:19所示的氨基酸序列，成熟轻链可变区域具有如SEQ ID N0:45、33、35、37或39所示的氨基酸序列。在某些抗体中，成熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:21所示的氨基酸序列，成熟轻链可变区域具有如SEQ ID勵:45、33、35、37或39所示的 氨基酸序列。在某些抗体中，成熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:23所示的氨基酸序列， 成熟轻链可变区域具有如SEQ ID勵:45、33、35、37或39所示的氨基酸序列。在某些抗体 中，成熟重链可变区域具有如SEQ ID N0:25所示的氨基酸序列，成熟轻链可变区域具有如 SEQ ID N0:45、33、35、37或39所示的氨基酸序列。在某些抗体中，成熟重链可变区域具有 如SEQ ID N0:27所示的氨基酸序列，成熟轻链可变区域具有如SEQ ID勵:45、33、35、37或 39所示的氨基酸序列。
[0009] 在任一上述抗体中，成熟重链可变区域可以融合在重链恒定区域，成熟轻链恒定 区域可以融合到轻链恒定区域。
[0010] 在任一上述抗体中，重链恒定区域可以是天然人类恒定区域的突变形式，相对于 所述天然人类恒定区域，其与Fcy受体的结合能力下降。
[0011] 在任一上述抗体中，重链恒定区域可以是人类IgGl同种型（isotype)的重链恒定 区域。在某些抗体中，同种异型是Glm3。在某些抗体中，同种异型是Glml。
[0012] 在某些抗体中，重链恒定区域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示，但其C末端赖 氨酸残基可能被删除。在某些抗体中，轻链恒定区域的氨基酸序列如SEQ ID N0:49。在某 些抗体中，成熟重链可变区域融合到氨基酸序列如SEQ ID N0:52所示的重链恒定区域，但 重链恒定区域C末端赖氨酸残基可能被删除。成熟轻链恒定区域融合到氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示的轻链恒定区域。在某些抗体中，成熟轻链含有SEQ ID NO: 53,成熟重链含 有 SEQ ID NO:56。
[0013] 本发明进一步提供了编码上述任一成熟重链可变区域和/或上述任一成熟轻链 可变区域的核酸，例如，SEQ ID 勵5:18、20、22