抗-dr5家族抗体,双特异性或多价抗-dr5家族抗体及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学、肿瘤学的领域，并且更具体地，涉及单特异性、双特异性或多 价的抗体分子，这些单特异性、双特异性或多价抗体分子可以有利地用于治疗表达DR5抗 原的各种癌症、自身免疫疾病、传染病。本发明涉及与DR5受体（也被称为TRAIL受体2) 特异性结合的新的多肽。本发明尤其涉及具有两个不同的结合结构域的多肽，或具有这些 不同的结合结构域的多肽的组合，这些不同的结合结构域与DR5受体的不同表位结合，从 而诱导凋亡。本发明还涉及含有这些多肽的药物组合物，以及使用这些多肽和组合物对癌 症、自身免疫疾病和病毒感染的治疗。
【背景技术】
[0002] 凋亡或程序性细胞死亡是多细胞有机体的正常发育和体内平衡所必需的生理过 程。凋亡的紊乱促使严重的人类疾病发病，包括癌症、神经退行性疾病和获得性免疫缺陷综 合征。
[0003] 肿瘤坏死因子（TNF)-相关的凋亡诱导配体（TRAIL)(细胞因子TNF超家族的成 员）是II型膜蛋白，该II型膜蛋白在大部分正常组织中表达，并且能够经蛋白酶剪切，产 生能够与TRAIL受体结合的溶解形式（Wiley SR.等人，Immunity. 1995 ;3:673-682 ;Daniel PT 等人，J Immunol. 1994 ; 152:5624) 〇
[0004] 该家族的配体通常识别并且结合细胞表面上的同源受体的有限子集，引起受体下 游的信号传导级联，允许大批信号通路（包括NF-kB或半胱天冬酶（caspase)活化）的激 活。TRAIL诱导特定的转化细胞的凋亡，包括许多不同类型的癌症细胞以及病毒感染的细 胞，同时不诱导许多正常细胞类型的凋亡，因此在癌症治疗的发展中特别有意义（Walczak 等人，Nature Medecine. 1999 ;5/157_163,Ashkenazi A.等人，J Clin Invest.1999 ; 104:155)〇
[0005] 存在四种已知的TRAIL细胞表面受体。TRAIL受体1(TRAIL-R1，DR4)和Trail受体 2 (TRAIL-R2、DR5、Ap〇-2、TRICK2、Killer、TR6、Tang〇-63)具有细胞质死亡结构域，并且能够 经由下游的caspase活化引发肿瘤细胞中的凋亡。其它两种受体TRAIL受体3 (TRAIL-R3、 DcRl、TR5、TRIDD、LIT)和 TRAIL 受体 4(TRAIL-R4、DcR2、TRUNDD)缺乏细胞质死亡结构域， 并且不能介导凋亡。此外，骨保护素（OPG)(蛋白TNF受体家族的可溶（分泌）成员）也结 合 TRAIL。
[0006] DR4和DR5的胞质内结构域均包括所谓的死亡结构域。在它的受体DR4和DR5 活化之后，fas-相关的死亡结构域衔接分子被招募至受体，引起自我蛋白酶解和起始因子 caspase-8的活化。已经报道，一旦TRAIL结合，DR4和DR5就将凋亡信号转导至TRAIL敏 感的癌症细胞。活化的caspase-8反过来引发下游caspase (包括caspase-3)的蛋白酶解 活化。下游caspase最终使大范围的细胞蛋白降解，并且终止凋亡。
[0007] 经常在人类癌症中，包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、乳癌和非小细胞肺癌中， 检测到DR4或DR5的表达，而在正常组织中没有DR4或DR5的表达或者表达很低。
[0008] 在很多疾病的发展或推进中，常常是细胞不被去除的情况。在很多自身免疫疾病 和炎症性病症中，存活的被活化的细胞攻击正常的组织或细胞。进一步地，肿瘤发生的进行 和风湿性关节炎的增生性淋巴结炎的形成的特征在于细胞的未受控制的增殖。因此，不充 分的凋亡导致疾病的发展，并且使用凋亡诱导配体或激动性MAb以增强凋亡被认为是消除 那些不想要的细胞的潜在的治疗策略。
[0009] TRAIL在大范围的造血和实体肿瘤细胞中诱导凋亡，同时不伤害大部分正常的细 胞。TRAIL在体外具有针对癌症细胞的强凋亡诱导活性，并且在体内具有针对各种癌症的肿 瘤异种移植物的潜在的抗肿瘤活性。
[0010] 由于TRAIL及其衍生物（包括靶向TRAIL受体的激动性抗体）具有诱导肿瘤消退 且没有显著副作用的能力，因此它们是癌症治疗的有吸引力的化合物。
[0011] 在专利文献中存在很多实例，这些实例致力于使用来源于TRAIL配体的多肽作 为针对癌细胞的疗法（US20090131317 ;US 6, 469, 144 ;US 6, 740, 739 ;US20070026000 ;US 6, 444, 640 ；US20050244857 ；US20050233958 ；US7,736, 637)〇
[0012] 已经首次研宄了 TRAIL多肽作为伤害物以诱导TRAIL凋亡通路，但是具有半衰期 短的缺点。
[0013] 目前，大量注意力都集中在开发治疗癌症的新的免疫治疗策略。一种这样的策略 是基于抗体的癌症疗法。
[0014] 上述目标特性的最突出的决定因素是基于抗体的分子的大小相对于特异性的程 度、肿瘤中的滞留和它们的清除。基于抗体的分子的另一重要特征是效价，因为显著较大的 肿瘤滞留已经与革G标的多价结合相关（Adams等人，Cancer Res. 1993 ;51:6363-6371 ;Wolf 等人，Cancer Res. 1993 ;53:2560-2565)。
[0015] 如之前所述，已经生产出了针对DR4或DR5的激动性抗体，并且该针对DR4或DR5 的激动性抗体代表了新一代的癌症疗法。还对指向TRAIL受体的激动性抗体的使用开展了 工作，以诱导TRAIL凋亡通路。
[0016] 猜想与DR4或DR5特异性结合的激动性单克隆抗体能够直接诱导祀定的肿瘤细 胞的凋亡（Buchsbaum DJ 等人，Future Oncol. 2006 ;2:493 ;Rowinsky EK 等人，J Clin Oncol. 2005 ;23:9394)。
[0017] 其它专利涉及指向DR4，或DR5或DR4和DR5的激动性抗体的应用，或者涉 及针对DR5的抗体和另一化学治疗剂的组合应用：US20040147725 ;US20090022707 ; US20080248037 ；US20020155109 ；US 6,461,823 ；US 6,872,568 ；US7,064, 189 ；US 6, 521，228 ;US 7, 704, 502。
[0018] 而且，已经开发了使用指向不同的TRAIL受体（例如DR4和DR5)的激动性抗体的 组合治疗。为了制备结合DR4或DR5的激动性双特异性抗体（或产生这样的激动性MAb的 杂交瘤），可以利用DR4或DR5作为各种程序中的起始材料（W0 2002/0155109)。
[0019] 这些包括抗 DR5MAb 来沙木单抗（Iexatumumab) (Plummer R.等人，Clin Cancer Res. 2007 ;13:6187)，抗 DR5MAb apomab(Adams C.等人，Cell Death Differ. 2008; 15:751)，抗DR5MAb LByl35(Li J.等人，AACR Meeting Abstracts. 2007. Abstract 4874)， 抗DR5MAb WD-l(Wang J.等人，Cell Mol Immunol. 2008 ;5:55)，及抗DR5MAb AMG655(Wall J.等人，AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract 1326，Kaplan_Lefko Ρ·等人，AACR Meeting Abstracts. 2008. Abstract399)。来自这些研宄的一致的发现是各种肿瘤细胞系 对抗-DR5介导的细胞毒性的敏感性具有相当大的易变性。
[0020] 另外，抗-DR4或抗-DR5的激动性抗体（包括mapatumumab或Iexatumumab) 分别在患者中耐受良好（Herbst R.S.等人，J Clin 0ncol.2006;24(18S)/3013;Hotte S.J.等人，Clin Cancer Res. 2008 ;14/3450-3455 ;Wakelee Η· A 等人，Ann Oncol. 2010; 21/376-381 ;Fox N.L.等人，Expert Opin Biol Ther. 2010; 10/1-18) 〇
[0021] Lexatumumab (还已知为ETR2-ST01)是在癌症治疗中使用的针对DR5的激动性 人类单克隆抗体。HGS-ETR2抗体通常由HGS通过与剑桥抗体技术（Cambridge Antibody Technology)合作生成。
[0022] Tigatuzumab(CS-1008)是由mTRA-8的CDR区域组成的人源化的IgGl单克隆抗 体。从一系列抗-DR5单克隆抗体中，基于它们的特异性、不使用交联试剂的情况下在体外 引发凋亡的能力并且对人类肝细胞没有毒性，选择了鼠抗-DR5单克隆抗体TRA-8 (mTRA-8) (Buchsbaum DJ等人，Clin Cancer Res. 2003 ;9:3731 ;Ichikawa Κ·等人，Nat Med. 2001 ; 7:954)。
[0023] Tigatuzumab介导与mTRA-8非常类似的体外细胞毒性和体内抗肿瘤功效的模 式。已知对人类各种肿瘤细胞系具有强有力的体外细胞毒性，并且在人类癌症的鼠异种移 植物模型中具有体内抗肿瘤功效。与各种化学治疗剂和/或辐射组合时，它的体外细胞毒 性和体内抗肿瘤功效可以得到实质地提高（Buchsbaum DJ等人，Clin Cancer Res. 2003; 9:3731 ;DeRosier LC 等人，Clin Cancer Res. 2007; 13:5535s) 〇
[0024] 已经与其它化学治疗剂或疗法相关联、一起地测试了抗-DR4和抗-DR5抗体。使 用两种激动性抗体HGS-ETRl (抗-DR4)和HGS-ETR2 (抗-DR5)和放射疗法组合治疗结直 肠肿瘤，在体外产生增强的效果，并且在体内产生计量依赖性的生长延迟（Marini P等 人，Oncogene. 2006 ;25(37) :5145-54)。针对DR4和DR5的人类全长的激动性抗体证实 在原代和培养的淋巴瘤细胞中诱导凋亡并且增强阿霉素和硼替佐米-诱导的细胞死亡 (Georgakis GV 等人，Oncogene. 2006 ;25 (37) : 5145-54)。已经发现福射增强 DR5 的表达和 对乳癌细胞的TRAIL-诱导的凋亡的易感性，暗示与辐射组合，会提高TRAIL在癌症治疗中 的效率（Chinnaiyan A. M 等人，PNAS. 2000 ;97/1754-1759)。
[0025] 抗体和化学治疗的组合通常增强凋亡的程度，并且可以部分反转一些细胞系中的 抗性（Buchsbaum DJ 等人，J Clin Cancer Res. 2003 ;9:3731;DeRosier LC 等人，Clin Cancer Res. 2007 ;13:5535s ;01iver PG等人，Clin Cancer Res. 2008 ;14:2180 ;Derosier LC 等人，Mol Cancer Ther. 2007 ;6:3198 ;Long JW.等人，J Surg Res. 2007; 137:167) 〇
【发明内容】
[0026] 发明人现在出乎意料地发现了，通过使用针对DR5受体的至少两个不同表位的两 种抗体，可以诱导DR5凋亡通路。与同一受体上的两个表位结合对受体具有激动作用，并且 以有效地方式诱导凋亡。如本文所公开的抗体DR5-01和DR5-05的组合显示了比配体自身 强的激动作用。
[0027] 相对于针对单一表位的一种抗体，通过使用分别针对DR5受体上的不同表位的两 种抗体，已经观察到了出乎意料的协同的作用。不希望受到理论的束缚，假定与DR5的两个 表位的结合允许有协同的激动剂功能，从而出乎意料地提高凋亡诱导。已经发现了上述出 乎意料的协同的作用可以有利于治疗处理或与治疗方案整合。因此，已经发现了抗体的组 合可以导致尤其是在神经胶质瘤中对癌症细