或双互补 位抗体的片段都包括结合位点，并且其中这些结合位点的每一个都具有与DR5上的对应的 表位结合的能力。这样的片段例如可以是F(ab'） 2抗体片段。
[0086] 如本文所使用的，术语"双价双特异性抗体"指如上所述的抗体，在该抗体中，两对 重链和轻链（HC/LC)中的每一对都特异性结合的不同的表位，S卩，第一重链和第一轻链一 起特异性结合第一表位，并且，第二重链和第二轻链一起特异性结合第二表位；这样的双价 双特异性抗体能够同时或非同时地特异性结合两种不同的表位。
[0087] 根据本发明，通过替换仅一对重链和轻链（HC/LC)中的特定结构域，可以提高期 望的双价双特异性抗体与不期望的副产物的比率。同时，两个HC/LC对的第一 HC/LC对源 自与第一表位特异性结合的抗体并且基本是不变的，两个HC/LC对的第二HC/LC对源自与 第二表位特异性结合的抗体并且通过以下替换进行改变：
[0088] ?轻链：可变的轻链结构域VL被特异性结合第二表位的所述抗体的可变的重链结 构域VH替换，并且恒定的轻链结构域CL被特异性结合第二表位的所述抗体的恒定的重链 结构域CH替换，以及
[0089] ?重链：可变的重链结构域VH被特异性结合第二表位的所述抗体的可变的重链结 构域VL替换，并且恒定的重链结构域CH被特异性结合第二表位的所述抗体的恒定的轻链 结构域CL替换。
[0090] 经设计的蛋白，诸如能够结合两种或更多种抗原或表位的双价抗体或多价抗体， 在本领域中是已知的。这样的多价结合蛋白可以使用细胞融合、化学偶联或重组DNA技术 生成。
[0091] 在一个途径中，已经使用四源杂交瘤技术生产出了与天然抗体非常相似的双特异 性抗体（Milstein C.等人，Nature. 1983;305:537-40)，该四源杂交瘤技术基于表达鼠单 克隆抗体的两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合，该鼠单克隆抗体具有双特异性抗体的 期望的特异性。因为两种不同的抗体重链和轻链在得到的杂种-杂交（或四源杂交瘤）细 胞系内的随机配对，生成多达十种不同的抗体种类，这十种不同的抗体种类中，仅一种是期 望的有功能的双特异性抗体。由于存在错配的副产物并且显著降低的生产产量，意味着需 要复杂的纯化程序（Morrison S.L·，Nature Biotech. 2007;25:1233-1234)。通常，如果使 用重组表达技术，则仍然存在错配的副产物的相同问题。
[0092] 克服错配的副产物的问题的途径（已知为"球进洞（knobs-into-holes) "）的目标 是，通过在CH3结构域中引入突变以改变接触界面，推动两种不同的抗体的重链的配对。在 一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以产生洞。相反地，具有大的侧链的 氨基酸被引入其它CH3结构域中，以产生"球（knob)"。通过共表达这两种重链（和两种相 同的轻链，两种相同的轻链必须适于两种重链），可以观察到杂二聚体形成（"球-洞"）对 同二聚体形成（"洞-洞"或"球-球"）的高产量（Ridgway, JB等人，Protein Eng. 1996 ; 9:617-621;和 TO 96/027011)。
[0093] "抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。适当 的"抗体片段"是抗体的片段，该抗体的片段具有结合DR5表位并且起始凋亡通路的能力。
[0094] 抗体片段的实例包括？&13、？&13'、？( &13'）2、和？￥片段；双链抗体；线性抗体（2&? &七& 等人，Protein Eng. 1995 ;8 (10) :1057-1062);单链抗体分子；以及由抗体片段形成的单价 抗体。
[0095] "完整的"抗体是包括如下区域的抗体：抗原结合的可变区域，以及轻链恒定结构 域（CL)和重链恒定结构域、CH1、CH2和CH3。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两种相同的抗原 结合片段，称为"Fab"片段，每一种"Fab"片段都包括单个抗原结合位点和CL区和CHl区， 以及剩余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生"F(ab'） 2"片段，该"F(ab'）2"片段具有两种抗 原-结合位点并且仍然能够使抗原交联。
[0096] "Fv"是最小的抗体片段，包含完整的抗原-识别和抗原-结合位点。该区域由一 条重链和一条轻链的可变结构域以紧密、非共价结合体的形式的二聚体组成。在这种构象 中，每一可变结构域的三个高变区（CDR)相互作用，以限定VH-VL二聚体表面上的抗原-结 合位点。共同地，六个高变区或CDR共同赋予抗体抗原-结合的特异性。
[0097] "Fab"片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域（CHl)，并且仅具有 一种抗原-结合位点。
[0098] "Fab' "片段通过在重链CHl结构域的羧基末端添加几个残基而不同于Fab片段， 包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
[0099] F(ab'）2抗体片段最初产生为在它们之间具有铰链半胱氨酸的成对的Fab'片段。 抗体片段的其它化学偶联也是已知的（Hermanson等人，Bioconjugate Techniques (生物 偶联技术），Academic Press (学术出版社），1996, US 4342566)。
[0100] "单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中，这些结构 域存在于单个多肽链中。优选地，scFv包括在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，使 得scFv能够形成用于抗原结合的期望的结构。
[0101] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些 术语适用于天然出现的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在 的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。这些术语也包括传统肽键上的变体，该传统 肽键连接构成多肽的氨基酸。优选的"肽"、"多肽"和"蛋白"是氨基酸链，其中氨基酸的碳 通过肽键连接。
[0102] 因此，在链一端（氨基末端）处的末端氨基酸具有自由的氨基，同时在链另一端 (羧基末端）处的末端氨基酸具有自由的羧基。如在本文中使用的，术语"氨基末端"（简称 为N-末端）指在肽的氨基末端处的氨基酸上的自由α-氨基，或者指肽内任何其它位置处 的氨基酸的α-氨基（当参与肽键时是氨基）。类似地，术语"羧基末端"指肽的羧基末端 上的自由羧基，或者指肽内任何其它位置处的氨基酸的羧基。肽还基本包括任何聚氨基酸， 该聚氨基酸包括（但并不限于）肽模拟物，诸如通过与胺键完全不同的醚连接的氨基酸。
[0103] 术语"可变"指如下事实：在抗体之间，可变结构域的特定部分在序列上普遍不 同，并且该可变结构域用于每一具体抗体对其具体抗原的结合和特异性。但是，可变性在 抗体的可变结构域上并不是均匀分布的。它集中在轻链和重链的可变结构域中的三个被 称为互补决定区（CDR)的片段或高变区中。可变结构域中恒定性较高的部分被称为框架 (FR)。天然的重链和轻链的可变结构域都包括四个FR区，这四个FR区主要采取β-折叠 的构象且通过三个⑶R相连。这三个⑶R形成环，连接β-折叠结构，并且在一些情况中形 成β-折叠结构的一部分。每一条链中的⑶R通过FR区被很接近地保持在一起，并且与 来自另一条链的CDR -起促使抗体的抗原结合位点的形成（Kabat等人，NIH Publ. 1991 ; No. 91-3242, Vol. 1，647-669)。恒定结构域不直接参与抗体和抗原的结合，但是显示出各种 效应物的功能，诸如在抗体-依赖的细胞毒性中抗体的参与。
[0104] 本文中的单克隆抗体只要能显示出期望的生物活性，则具体包括"嵌合"抗体 (免疫球蛋白）以及这样的抗体的片段，在"嵌合"抗体中，重链和/或轻链的一部分与 来源于特定物种的抗体中的对应序列是相同或同源的，或属于特定的抗体种类或亚类； 同时，链的剩余部分与来源于另一物种的抗体中的对应序列是相同或同源的，或属于另 一抗体种类或亚类，（U. S. Pat. No. 4, 816, 567 ;Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855(1984))。
[0105] 本发明涵盖的"嵌合抗体"的其它优选形式是如下的嵌合抗体：在这些嵌合抗体 中，已经自原始抗体的恒定区修改或改变了恒定区，以生成根据本发明的特性，特别是在 Clq结合和/或Fc受体（FcR)结合方面的特性。
[0106] 这样的嵌合抗体还被称为"类别转换抗体（class-switched antibody) "。嵌合 抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，该免疫球蛋白基因包括编码免疫球蛋白可变区的 DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规的重 组DNA，并且基因转染技术在本领域是公知的。例如参见Morrison, S. L等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984 ;81:6851-6855,美国专利号 5, 202, 238 和美国专利号 5, 204, 244。WO 2006/093794涉及杂二聚体蛋白结合组合物。W099/37791描述了多种用途的抗体衍生物。 Morrison 等人，the J. Immunolog. 1998 ; 160:2802-2808 涉及可变区结构域互换对 IgG 的 功能特性的影响。
[0107] 非人（例如鼠）抗体的"人源化"形式是包含源自非人的免疫球蛋白的最小序列 的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段（诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab'） 2或抗体的其 它抗体结合序列）。人源化抗体大部分是人类的免疫球蛋白（受体抗体），其中，来自受体 的互补决定区（CDR)的残基被来自非人物种（供体受体）的具有期望的特异性、亲和力和 能力的CDR的残基取代，该非人物种诸如为小鼠、大鼠或兔。在一些实例中，人类免疫球蛋 白的Fv骨架区（FR)残基被对应的非人类残基取代。
[0108] 在优选的实施方式中，鼠源CDR被植入人类抗体的骨架区中，以制备"人源化 抗体"。例如参见 Riechmann, L.等人，Nature. 1988 ;332:323-327,和 Neuberger, MS 等 人，Nature. 1985 ;314:268-270。特别优选的CDR对应于上面提到的嵌合抗体的代表识别 抗原的序列的那些CDR。本发明涵盖的"人源化抗体"的其它形式是如下的人源化抗体：在 这些人源化抗体中，已经自原始抗体的恒定区额外地修改或改变了恒定区，以生成根据本 发明的特性，特别是在Clq结合和/或Fc受体（FcR)结合方面的特性。
[0109] 进一步地，人源化抗体可包括既没有在受体抗体中发现也没有在引入的⑶R或 骨架序列中发现的残基。做出这些修改，以进一步改进和最大化抗体的性能。通常，人 源化抗体基本上都将包括至少一种、并且典型地两种可变结构域，其中，所有CDR区或基 本所有的CDR区都对应非人的免疫球蛋白，并且所有FR区或基本所有FR区都是人类免 疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还将包括免疫球蛋白恒定区（Fe)的至少一部 分，典型地将包括人类免疫球蛋白的恒定区（Fe)的至少一部分。具体细节参见Jones等 人，Nature. 1986 ;321:522-525 ;Reichmann 等人，Nature. 1988 ;332:323-329 和 Presta 等 人，Curr. Op. Struct. Biol. 1992 ;2:593-596。
[0110] 已经示出有助于抗体介导的细胞毒性的免疫效应物的功能包括抗体依赖的细胞 介导的细胞毒性（ADCC)、抗体依赖的细胞介导的吞噬作用（ADCP)和补体依赖的细胞毒性 (CDC)〇
[0111] 还可以经由抗增殖效果来介导细胞毒性。对于肿瘤细胞增殖的抗体调节的机制知 道的很少。但是，在对抗体与Fcg受体（FcgR)的相互作用对免疫效应细胞的影响的理解上 的进步，已经能够进行效应物功能显著提高的抗体的基因改造。
[0112] MAb的作用机制复杂，并且不同的MAb显现出不同的作用机制。存在很多机制，MAb 通过这些机制引起靶细胞的死亡。这些包括凋亡、⑶C、ADCC和信号传导的抑制。
[0113] 效应物功能（诸如CDC和ADCC)是对于Mb的临床疗效可能很重要的效应物功 能。所有这些