量。
[0059] "编码"指的是诸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的核苷酸的特异性序列用作 模板在生物学过程中合成其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷 酸（S卩，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生 物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产 生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同于mRNA序列并通常在序列表中提供的编码 链和非编码链一一用作转录基因或cDNA的模板，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白 质或其他产物。
[0060] 如本文所用的"内源的"指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细 胞、组织或系统内产生的任何物质。
[0061] 如本文所用的，术语"外源的"指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在 有机体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
[0062] 如本文所用的术语"表达"被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录 和/或翻译。
[0063] "表达载体"指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连 接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元 件；用于表达的其它元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有 本领域已知的那些载体，例如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒（例如裸露或包含在脂质体 中）和病毒（例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。
[0064] "同源的"指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。 当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA 分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间 的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数XlOO的函 数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60%同源的。 举例说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50 %的同源性。通常，当比对两个序列以给出最 大同源性时，进行比较。
[0065] 如本文所用的术语"免疫球蛋白"或"Ig"被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。 由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体）或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五 个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物例如唾液、泪液、母乳、胃肠分 泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM 是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他 抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有 已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥 大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
[0066] 如本文所用的，"指导材料"包括出版物、记录、图表或任何其它可用于传达本发明 组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发 明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可 选地，指导材料可与容器分开运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
[0067] "分离的"指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是 "分离的"，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是"分离的"。分 离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，例如宿主细 胞中。
[0068] 在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。"A"指的是腺苷，"C" 指的是胞嘧啶，"G"指的是鸟苷，"T"指的是胸苷，和"U"指的是尿苷。
[0069] 如本文所用的"慢病毒"指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯 一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以其是 基因送递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的实例。源自慢病毒的 载体提供了完成显著水平的基因体内转移的工具。
[0070] 如本文所用的术语"调节"指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/ 或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的 增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象一一优选人一一 的有益的治疗性应答。
[0071] 除非另有规定，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括为彼此简并版本并编码相同 的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
[0072] 术语"可操作地连接"指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后 者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第 二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操 作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必 须连接两个蛋白编码区。
[0073] 术语"过表达的"肿瘤抗原或肿瘤抗原的"过表达"意欲指示相对于来自组织或器 官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤 抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可 由本领域已知的标准测定确定。
[0074] 免疫原性组合物的"肠胃外"施用包括例如皮下（s.c)、静脉内（i.v.)、肌肉内 (i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
[0075] 术语"患者"、"对象"、"个体"等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方 法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个 体为人。
[0076] 如本文所使用的术语"多核苷酸"被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚 体。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可被 水解成单体"核苷酸"的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用 的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段非 限制性地包括重组手段，即，从重组文库或细胞基因组利用普通克隆技术和PCR等等克隆 核酸序列，和合成手段。
[0077] 如本文所使用的，术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"可交换使用，并指的是由肽键共价 连接的由氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可构成 蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋 白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所使用的，该术语指的是短链，例 如，其在本领域中也通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋 白质，其具有很多类型。"多肽"包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚 体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、 重组肽、合成肽或其组合。
[0078] 如本文所用的术语"启动子"被定义为起始多核苷酸序列的特异性转录所需要的， 由细胞的合成机器识别的，或引入合成机器的DNA序列。
[0079] 如本文所用的，术语"启动子/调节序列"指可操作地连接至启动子/调节序列的 基因产物的表达需要的核酸序列。在一些实例中，该序列可为核心启动子序列，并且在其它 实例中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其它调节元件。启动子/调节 序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
[0080] "组成型"启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地 连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
[0081] "诱导型"启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地 连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产 物。
[0082] "组织-特异性"启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸 可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产 生基因产物。
[0083] 如本文所使用的关于抗体的术语"特异性结合"指识别特异性抗原但基本上不识 别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结 合来自一个或多个物种的该抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别为特异性 的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这 种交叉反应性本身不改变抗体的类别为特异性的。在一些实例中，术语"特异性的结合"或 "特异性地结合"可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互 作用依赖化学种类上特定结构（例如抗原决定簇或表位）的存在；例如，抗体识别和结合特 异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位"A"是特异的，则在包含 标记的"A"和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子将降低结合至 抗体的标记的A的量。
[0084] 术语"刺激"指通过将刺激分子（例如TCR/CD3复合物）与它的关联配体结合，由 此介导信号转导事件一一例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导一一诱导的初级应 答。刺激可介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织 等等。
[0085] "刺激分子"，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体 特异性结合的T细胞上的分子。
[0086] 如本文所使用的"刺激配体"指如下配体，当存在于抗原呈递细胞（例如aAPC、树 突细胞、B-细胞等等）上时，可与T细胞上的关联结合伴侣（在本文中被称为"刺激分子"） 特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的起始、增殖等 等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28 抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
[0087] 术语"对象"意欲包括在其内可引起免疫应答的活的有机体（例如哺乳动物）。对 象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
[0088] 如本文所用的"基本上纯化的"细胞为基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上 纯化的细胞也指的是已经与其它细胞类型分离的细胞，其在天然发生状态中与其它细胞类 型正常相关联。在一些实例中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它实例中，该 术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施 方式中，细胞在体外培养。在其它实施方式中，细胞不在体外培养。
[0089] 如本文所用的术语"治疗性的"表示治疗和/或预防。治疗性效果通过疾病状态 的抑制、缓和或根除获得。
[0090] 术语"治疗有效量"指的是将引起由研宄者、兽医、医学医生或其他临床医生正在 寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语"治疗有效量"包 括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防正在治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的 一个或多个的发展，或以一定程度减轻正在治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多 个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
[0091] "治疗"疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱中的至少一种 迹象或症状的频率或严重性。
[0092] 如本文所用的术语"转染的"或"转化的"或"转导的"指的是如下过程，通过该过 程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。"转染的"或"转化的"或"转导的"细胞是已经被转 染、转化或转导外源核酸的细胞。该细胞包括原代对象细胞和其子代。
[0093] 如本文所用的短语"转录控制下"或"可操作地连接"指启动子处于与多核苷酸有 关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
[0094] "载体"为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递核酸至细胞内部。很 多载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的 多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语"载体"包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解 释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、月旨 质体等等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等 等。
[0095] 范围：遍及该公开内容，本发明的多个方面可以以范围形式展示。应当理解范围形 式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范 围的描述应被考虑为已经具体公开了所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。 例如，例如从1至6的范围的描述应被考虑为已经具体公开了子范围例如从1至3、从1至 4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2. 7、3、 4、5、5. 3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
[0096]
[0097] 本发明提供了分析对转导T细胞目的用于施用给受试人有用的载体上清液的方 法。本发明也提供了分析转导T细胞和其上清液的方法，目的用于施用给受试人。在各种实 施方式中，本发明的分析方法包括分析T细胞存活、T细胞特性（例如⑶3、⑶4、⑶8、⑶25、 CD27、CD45RA、CD57、CD62L、CD95、CD127、CD134、CD244、CCR7、CD40L、CTLA4、PD-1、HLA-DR、 TIM3、Ki-67、穿孔蛋白、和/或粒酶表达）、转导效率、内毒素的存在和量、支原体的存在和 量、具有复制能力的慢病毒（RCL)的存在和量、p24的存在和量、源自用于包装慢病毒质粒 的各个质粒的核酸和/或蛋白质的存在和量、VSV-G核酸和/或蛋白质的存在和量、HIVgag、 残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基 组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌（例如粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆 菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群）或活化 和/或调节免疫系统的细菌产物（例如LPS、核酸、RNA等等）的存在和量，和真菌的存在和 量的方法。
[0098] 在一些实施方式中，受试人可患有癌症。在各种实施方式中，该癌症可为血液学恶 性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为血液学恶性肿瘤，和更优选地， 该癌症为慢性淋巴细胞白血病（CLL)。利用本发明的组合物和方法可治疗的其它疾病包括 病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
[0099] 在一个实施方式中，载体包括编码CAR的核酸序列，其中当CAR是由T细胞表达 时，CAR T细胞显示抗肿瘤性质。CAR可被工程改造以包括胞外结构域，其具有融合至T细 胞抗原受体复合物ζ链（例如CD3G)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。CAR 当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变（redirect)抗原识别。示例性抗原为 ⑶19,因为该抗原在恶性B细胞上表达。然而，本发明不限制于识别⑶19的CAR。相反地， 本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生 长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合部分优选 地与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选 自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3G信号结构域和其任何组合 的一个或多个胞内结构域融合。
[0100] 在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CD137(4-1BB)信号传导结构域的 核酸序列。这是因为随着共刺激结构域的添加，CAR-介导的T细胞应答可被进一步加 强。例如，与没有被工程改造以表达⑶137 (4-1BB)的其它相同的CAR T细胞相比，包括 CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加了 CAR T细胞的抗肿瘤活性和体内持久性。使用 CAR基因修饰的T细胞的方法在PCT/US11/64191中描述，通过引用以其全部并入本文。
[0101] 组合物
[0102] 本发明提供了包括编码CAR的核酸的载体，其中CAR包括胞外和胞内结构域。胞 外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。胞内结构域或另外的胞 浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子 的胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面 分子，而不是抗原受体或它们的配体。
[0103] 在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之 间，可并入间隔结构域。如本文所使用的，术语"间隔结构域"通常指起到将跨膜结构域连 接至多肽链中的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至 300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
[0104] 抗原结合部分
[0105] 在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CAR的核酸，其中CAR包括另外被称为 抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和 数目。例如，可选择抗原结合结构域以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表 面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR中的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的 实例包括与病毒，细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
[0106] 在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CAR的核酸，其中通过工程改造特异 性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分的方法，CAR被工程改造以靶向感兴趣的肿 瘤抗原。在本发明的内容中，"肿瘤抗原"或"过度增生性紊乱抗原"或"与过度增生性紊乱 相关的抗原"指的是对于特定过度增生性紊乱例如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以 实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容 易显而易见的。
[0107] 肿瘤抗原是由引起免疫应答，特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的 蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领 域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原（CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、 α -胎蛋白（AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-UMN-CA IX、人端粒酶反转录 酶、RU1、RU2 (AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原（PSA)、 PAP、NY-ESO-I、LAGE_la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤 抗原-I (PCTA-I)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因 子（IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
[0108] 在一个实施方式中，