聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
[0148] 不管用于将外源核酸引入宿主细胞，或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂 的方法，为了证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如 本领域技术人员公知的"分子生物学"测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR ; "生物化学"测定，例如，例如通过免疫学手段（ELISA和蛋白质印迹）或通过本文描述的落 入本发明范围内的鉴定试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
[0149] T细朐的来源
[0150] 在本发明的T细胞的扩展和基因修饰前，从对象获得T细胞的来源。T细胞可从许 多来源中获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位 的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用在本领域中可 用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可利用技术人员已知的任 何数量的技术例如Ficoll?分离法自从对象中收集的单位血液中获得。在一个优选实施方 式中，来自个体循环血液中的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常包 含淋巴细胞--其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血 小板。在一个实施方式中，可冲洗由单采血液成分术收集的细胞以移除血浆部分并将细胞 放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷 酸盐缓冲盐水（PBS)冲洗细胞。在可选实施方式中，冲洗液缺少钙并可缺少镁，或可缺少很 多一一如果不是全部的话一一的二价阳离子。此外，令人惊讶地，在缺少钙的情况下的初始 活化步骤导致放大的活化。本领域技术人员将容易理解冲洗步骤可通过本领域技术人员已 知的方法完成，例如根据制造商的使用说明通过使用标准离心机、半自动"最大限度"离心 机（例如Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)。在冲 洗后，细胞可重悬浮在多种生物相容的缓冲液中，比如，例如无 Ca2+、无 Mg2+PBS、PlasmaLyte A、5%右旋糖的0. 45%氯化钠溶液或含有或不含有缓冲液的任何组成的其它盐溶液。可选 地，可移除单采血液成分术样本的不期望组分，并且将细胞直接重悬浮在培养基中。
[0151] 在另一个实施方式中，T细胞通过溶解红细胞和耗尽单核细胞从外周血淋巴细 胞中分离出来，例如，通过经过PERC0LL?梯度的离心或通过逆流离心淘洗或Miltenyi CliniMACS、或磁珠、或结合至抗体的磁珠。T细胞的特定亚群，例如⑶3 +、⑶28+、⑶4+、⑶8+、 ⑶45RA+、⑶45R0+、⑶62L+、⑶127+T细胞，可进一步通过阳性或阴性选择技术进行分离或耗 尽。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗-⑶3/抗-⑶28(即，3X28)-缀合珠例如 DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T -起温育持续足以阳性选择期望T细胞的时间段，进 行分离。在一个实施方式中，时间段为大约30分钟。在进一步的实施方式中，时间段范围 为30分钟至36小时或更长，和其间的所有的整数值。在进一步的实施方式中，时间段是至 少1、2、3、4、5或6小时。在还另一个优选的实施方式中，时间段为10至24小时。在一个 优选实施方式中，温育时间段为24小时。对于分离来自具有白血病的患者的T细胞，使用 更长的温育时间例如24小时，可增加细胞产量。更长的温育时间可用于在与其它细胞类型 相比具有更少T细胞的任何情况下分离T细胞，例如，在分离来自肿瘤组织或来自无免疫应 答个体的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL)中。进一步，使用更长的温育时间可增加 CD8+T细胞的 捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合至⑶3/⑶28珠，和/或通过 增加或减少珠与T细胞的比率（如本文中进一步描述的），在培养初始或在该过程的其它时 间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。此外，通过增加或减少珠或其它表面上抗-CD3 和/或抗-CD28抗体的比率，在培养初始或在其它期望的时间点上，可优先选择或排除T细 胞的亚群。技术人员将理解多轮选择也可用于本发明的内容中。在某些实施方式中，可期 望实施选择程序并在活化和扩展过程中使用"未选择的"细胞。"未选择的"细胞也可经历 更多轮的选择。
[0152] 通过阴性选择T细胞群的富集可利用针对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗 体的组合而完成。一种方法为细胞分选和/或选择，其经由阴性磁性免疫粘附或使用针对 存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例 如，为了通过阴性选择富集⑶4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括⑶14、⑶20、⑶11b、⑶16、 HLA-DR和⑶8的抗体。在某些实施方式中，可期望富集或阳性选择通常表达⑶4+、⑶25+、 CD62Lhi、GITR+和FoxP3 +的调节T细胞。可选地，在某些实施方式中，T调节细胞通过抗-C25 缀合珠或其它类似的选择方法耗尽。
[0153] 对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面（例如，例如珠 的颗粒）的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少其中珠和细胞被混合在一起的体积 (即，增加细胞浓度），以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细 胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使 用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 细胞/ml的细胞浓度。在还另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100 X IO6细胞/ml 的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150X IO6细胞/ml的浓度。使用高浓 度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步，使用高细胞浓度允许更有效捕获 可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28-阴性T细胞，或捕获来自有很多肿瘤细胞存 在的样本（即白血病血液、肿瘤组织等）的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将期望 获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效的选择正常地具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
[0154] 在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面 (例如，例如珠的颗粒）的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这样选择的细胞 表达高数量的待结合至颗粒的期望抗原。例如，在稀浓度，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更 高水平的⑶28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5 X IO6Ail。在 其他实施方式中，使用的浓度可从大约IXlOVml至IX IOfVml，和之间的任何整数值。
[0155] 在其它实施方式中，在旋转器上，细胞可在2_37°C的任一个温度下以变化的速度 温育，持续变化的时间长度。
[0156] 在冲洗步骤后，用于刺激的T细胞也可被冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除 细胞群中的粒细胞和以一定程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的 产物。在去除血浆和血小板的冲洗步骤后，细胞可被悬浮在冷冻液中。尽管很多冷冻液 和参数在本领域中是已知的，并将在本内容中是有用的，但一种方法包括使用包含20% DMSO和8 %人血清白蛋白的PBS，或包含10 %葡聚糖40和5 %右旋糖、20 %人血清白蛋白 和 7. 5% DMS0,或 31. 25% Plasmalyte-A、31. 25% 的右旋糖 5%、0· 45% NaCl、10%葡聚糖 40和5%右旋糖、20%人血清白蛋白和7. 5% DMSO的培养基，或包含例如Hespan或喷他淀 粉和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，细胞随后被以Γ每分钟的速率冷冻 至-80°C，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在_20°C下或液 氮中不受控的即刻冷冻。
[0157] 在某些实施方式中，冷藏的细胞如本文所述的解冻和冲洗，并允许在使用本发明 的方法活化前在室温下静止1小时。
[0158] 在本发明的内容下也考虑到的是在当可能需要如本文所述的扩展细胞前的时间 段，从对象收集血液样本或单采血液成分术产物。因此，待扩展的细胞的来源可在必要的 任何时间点收集，并且期望的细胞例如T细胞，被分离和冷冻，以便以后在T细胞治疗中用 于将受益于T细胞治疗的任何数量的疾病或病症，例如本文所述的那些。在一个实施方式 中，血液样本或单采血液成分术样本取自大体健康的对象。在某些实施方式中，血液样本 或单采血液成分术样本取自处于患病风险下但还没有患病的大体健康的对象，并且感兴趣 的细胞被分离和冷冻以便以后使用。在某些实施方式中，T细胞可在以后的时间被扩展、 冷冻和使用。在某些实施方式中，在如本文所述的具体疾病的诊断后，但在任何治疗前， 立刻从患者收集样本。在进一步的实施方式中，在任何数量的有关治疗形式前，从来自对 象的血液样本或单采血液成分术样本分离细胞，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂 治疗：例如那他珠单抗（natalizumab)、厄法珠单抗（efalizumab)、抗病毒剂、化疗、福射、 免疫抑制剂一一例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506,抗体或其它免疫 烧蚀剂例如CAMPATH、抗-CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦 考酚酸、类固醇类、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶一一钙调磷酸酶（环 孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶（雷帕霉素 ）（Liu 等，Cell 66:807-815, 1991 ;Henderson 等，Immun. 73:316-321，1991 ;Bierer 等，Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。在进一步的实施方式中，分离患者细胞并冷冻以便以后与 骨髓或干细胞移植、利用化疗剂例如氟达拉滨、外部光束放射疗法（XRT)、环磷酰胺或抗体 例如0KT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合（例如，之前、同时或之后）使用。在另一个 实施方式中，细胞被分离，然后可被冷冻以便以后用于B-细胞烧蚀疗法之后的治疗，例如 与⑶20反应的试剂，例如Rituxan。
[0159] 在本发明进一步的实施方式中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这点上，已 经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损坏免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久，当患者 将正常地从治疗中恢复期间，获得的T细胞的质量对于其离体扩展能力可以是最佳或改善 的。同样地，在利用本文描述的方法离体操纵后，这些细胞可处于提高的移植物移入和体内 扩展的优选状态。因此，在本发明的内容内考虑在该恢复期期间收集血液细胞，包括T细 胞、树突细胞或造血系的其它细胞。进一步，在某些实施方式中，转移（例如，用GM-CSF转 移）和调节方案可用于在对象中创造以下条件，其中具体细胞类型的再群体化、再循环、再 生和/或扩展是有利的，特别是在治疗后限定的时间窗口期间。说明性的细胞类型包括T 细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
[0160] T细朐的活化和扩展
[0161] 不论在T细胞基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以 下所述的方法活化和扩展：例如美国专利6, 352, 694 ;6, 534, 055 ;6, 905, 680 ;6, 692, 964 ; 5, 858, 358 ；6, 887, 466 ；6, 905, 681 ；7, 144, 575 ；7, 067, 318 ；7, 172, 869 ；7, 232, 566 ； 7, 175, 843 ;5, 883, 223 ;6, 905, 874 ;6, 797, 514 ;6, 867, 041 ;和美国专利申请公布号 20060121005。
[0162] 通常，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其上的 刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地， T细胞群可如本文所述的例如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段 或抗-CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂（例如苔藓抑制素） 接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例 如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为 了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域 中公知的其他方法一样，可使用包括9. 3、B-T3、XR-CD28 (Diacione，Besancon，France)的 抗-CD28 抗体的实例（Berg 等，Transplant Proc. 30 (8) : 3975-3977, 1998 ;Haanen 等，工 Exp. Med. 190 (9) : 13191328, 1999 ;Garland 等，J. Immunol Meth. 227 (1-2) : 53-63, 1999) 〇
[0163] 在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。 例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同 一表面（即，以"cis"形式）或分开的表面（即，以"trans"形式）。可选地，一种试剂可被 连接至表面且另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合 至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在某些实施方式中， 两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可以以可溶形式，随后被交联至表面， 例如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其它结合剂。在这点上，见例如用于人造 抗原呈递细胞（aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810,其被考虑用于 活化和扩展本发明的T细胞。
[0164] 在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，固定在同一珠即"cis"上或固定至分 开的珠即"trans"上。举例说明，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合 片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以 相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞扩展 和T细胞生长的珠的1 : 1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用一定比率的结 合至珠的抗⑶3 :⑶28抗体，以便与利用I : 1比率观察到的扩展相比，观察T细胞扩展 的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1 : 1比率观察到的扩展相比，观察到从大约1 至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的⑶3 :⑶28抗体的比率处于100 : 1 至1 : 100的范围内和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的 抗-⑶28抗体被结合至颗粒，即⑶3 :⑶28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中， 结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2 : 1。在一个具体的实施方式中，使用 结合至珠的抗体的1 : 100的⑶3 :⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗 体的1 : 75的⑶3 :⑶28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1 : 50 的⑶3 :⑶28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1 : 30的⑶3 :⑶28 比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1 : 10的⑶3 :⑶28比率。在另 一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1 : 3的⑶3 :⑶28比率。在还另一个实施方式 中，使用结合至珠的抗体的3 : 1的⑶3 :⑶28比率。
[0165] 从1 : 500至500 : 1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞 或其它靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对 于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在 某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在1 : 100至100 : 1的范围内和其间任何整数值， 和在进一步的实施方式中，该比率包括1 : 9至9 : 1和其间任何整数值，也可用于刺激T 细胞。产生T细胞刺激的抗-⑶3-和抗-⑶28-结合的颗粒与T细胞的比率可如以上记录 的变化，然而某些优选的值包括1 : 1〇〇、1 : 50、1 : 40、1 : 30、1 : 20、1 : 10、1 : 9、 1 : 8、1 : 7、1 : 6、1 : 5、1 : 4、1 : 3、1 : 2、1 : 1、2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、 7 : 1、8 : 1、9 : 1、10 : 1和15 : 1，一个优选的比率为至少I : 1颗粒每个T细胞。在 一个实施方式中，使用1 : 1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选 的颗粒：细胞的比率为1 : 5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数 而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为1 : 1至10 : 1，和额外 的颗粒在每天或此后每隔一天直至10天，以1 : 1至1 : 10的最终比率（基于添加日的 细胞计数）被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天 为I : 1并在刺激的第三和第五天被调节至1 : 5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每 隔一天的基础上添加，以达到第一天I : 1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1 : 5的 最终比率。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2 : 1并在刺激的 第三和第五天被调节至1 : 10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添 加，以达到第一天1 : 1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1 : 10的最终比率。本领 域技术人员将理解多种其它比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小以及细 胞大小和类型而变化。
[0166] 在本发明进一步的实施方式中，例如T细胞的细胞，与包被试剂的珠组合，珠和细 胞随后被分尚，并且随后培养该细胞。在可选实施方式中，在培养前，不分尚包被试剂的珠 和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加例如磁力的 力被聚集，这导致增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
[0167] 举例说明，可通过允许附接抗-⑶3和抗-⑶28的顺磁珠（3X28珠）以接触T细 胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞（例如IO4至10 9个T细胞）和珠（例 如I : 1比率的DYNABEADS? M-450⑶3/⑶28T顺磁珠）在优选为PBS的缓冲液（没 有例如钙和镁的二价阳离子）中组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞 浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占样本的0.01%，或整个样本（即，100%)可 包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容中。在某些实施方式中，可期 望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积（即，增加细胞浓度），以确保细胞和颗粒的最大 接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使 用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100 X IO6细