一种小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFAR1的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI的应用。
【背景技术】
[0002] 表皮蜡质是覆盖在植物表面最外层的保护物质，植物叶表皮蜡质成分复杂，通常 被认为是一类有机物质的混合物，借助气相色谱-质谱，研究者发现主要的成分为长链的 脂肪酸、醇、醒、醋和n~烧姪。植物叶表的蜡质成分及形态在不同的种，同一种的不同生长 阶段，甚至同一个种的不同品种中都有变化。植物外部的非生物因素往往影响着其表皮蜡 质的合成与分泌，蜡质成分会因各种水、旱胁迫、臭氧、酸雾、水冲洗和污染物等的出现发生 变化。据研究结果表明，决定表皮水分散失程度的一个重要因素是蜡质的化学成分，而不是 蜡层厚度。由此，作物表皮蜡质作为一种综合抗性指标，在最近几年成为国内外的一个研究 热点。目前，通过人工选育新品种来提高植物的抗旱性和果实保鲜性，既耗时又费力，而且 效率低下；相反，通过转基因技术过量表达蜡质合成基因，可W提高植物表皮蜡质含量，提 高植物的抗旱性和果实的保鲜，既方便又快捷。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI 的应用，该小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI可调控超长链脂肪醇合成，从而可提高植 物表皮蜡质成分。
[0004] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，
[0005] 本发明之SEQ ID NO ;1所示的小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI在植物育种 中的应用。
[0006] 本发明从NCBI数据库中查询获得FAR基因的序列信息，W小麦品种明988苗期叶 片的cDNA为模板，W序列如SEQ ID No ;2和SEQ ID No ;3所示的上下游引物进行RT-PCR 扩增，获得TaFARI基因的全长序列如SEQ ID No ;1所示；经PCR扩增后，将得到的TaFARI 基因的1578bp编码区连接到35S启动子驱动的植物表达双元载体pCXSN，获得融合表达载 体TaFARl-pCXSN ;转化大肠杆菌DH5 a，并将测序确认的重组质粒转入农杆菌，通过农杆菌 介导的转化法转化植物品种，获得过量表达TaFARI的转基因植株。
[0007] 本发明之SEQ ID NO ;1所示的小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI在提高植物 抗旱能力中的应用。
[000引本发明之SEQ ID NO ;1所示的小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI在提高果实 保鲜中的应用。
[0009] 本发明之SEQ ID NO ;1所示的小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARI在培育产超 长链脂肪醇的酵母菌株中的应用。
[0010] 本发明将带有化nd III和EcoR I酶切位点的TaFARI编码区连接到经过化nd III 和EcoR I双酶切的酵母表达载体PYES2,获得融合表达载体TaFARl-pYES2,转化大肠杆菌 D册a，挑选阳性克隆经测序确认后，提取质粒DM,通过阳G法转入酿酒酵母菌株。
[0011] 本发明之小麦超长链脂肪醇合成酶基因TaFARl的应用，与现有技术相比，可使获 得表达TaFARl基因的酵母发酵生产超长链脂肪醇，也可使过量表达TaFARl基因的植物抗 旱性显著增强，生产的果实保鲜时间延长。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明进一步加W说明。
[0013] 实施例1 ;培育产超长链脂肪醇的酿酒酵母菌株的实验 UTaFARl基因的克隆；从NCBI数据库中查询获得FAR基因的序列信息，W小麦品种明 988苗期叶片的cDNA为模板，设计引物为； TaFARl(F) ;5' ATGGTGGGCACGCTGGATGAGG 3'，如 SEQ ID No ;2 所示； TaFARl(R) ;5, TCACTTGAGGACGTACTTCATG 3，，如沈Q ID No ;3 所示； PCR反应体系为；在50yl反应体系，内含DNA模板5yl，上下游引物各2. 5yl，dNTP 10 y 1，Buffer 25 y 1，KOD 聚合酶 1 y 1，d地204 y 1 ;PCR 反应程序；94°C预变性 2min ;98°C 变性10s、60°C退火30s、68°C延伸2min，共进行35次循环；68°C延伸10min，10°C保存；进行 RT-PCR扩增，PCR产物回收纯化后，连接到克隆载体pM护M 18-T，转化大肠杆菌D册a，挑选 阳性克隆测序，获得TaFARl基因的全长序列，如SEQ ID No ;1所示。 2、 构建TaFARl基因表达载体：将带有化nd III和EcoR I酶切位点的TaFARl编 码区连接到经过化nd III和EcoR I双酶切的酵母表达载体PYES2,获得融合表达载体 TaFARl-pYES2,转化大肠杆菌D册a，挑选阳性克隆经测序确认。 3、 获得表达TaFARl基因的酵母；提取质粒DNA，通过PEG法转入酿酒酵母菌株INVScl， 挑选酵母菌落的单克隆，提取酵母DNA，通过TaFARl基因的扩增和测序，筛选获得转TaFARl 基因的酵母的阳性克隆。 4、 转基因酵母发酵生产超长链脂肪醇：挑选3~5个单克隆进行液体培养，经诱导培养 后，收集菌体、裂解，用己烧抽提，通过气相色谱（GC-M巧检测菌体脂质抽提物，能够检测到 Cw醇，表明TaFARl基因在转基因酵母中可W催化产生C 2。醇。
[0014] 实施例2 ;转TaFARl基因的植物抗旱性实验 1、 TaFARl基因的克隆；与实施例1相同。 2、 构建TaFARl基因表达载体：将PCR扩增产物回收纯化后，连接到35S启动子驱动的 植物表达双元载体pCXSN，获得融合表达载体TaFARl-pCXSN，转化大肠杆菌D册a，挑选阳 性克隆测序确认。 3、 获得表达TaFARl基因的植物；提取质粒，转入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转 化小麦品种西农979,获得转TaFARl基因的转基因植株。利用SDS法提取转基因植株的 DM，具体步骤如下；（1)取半张至一张叶片（-80°C保存的叶片），在-20°C预冷的研鉢中用 液氮研取液氮粉末1/3~1/2管；（2)加入600 y 1 SDS提取液摇匀，65°C温浴30min，间或 振荡3~4次，温浴至样液变墨绿色；（3)加入100 y 15M KAC(l/4体积）、摇匀后置冰上 约半小时；(4)加入300~400 y 1 (等体积）氯仿-异戊醇（24 : 1)，在振荡器上充分摇 匀（120;rpm、30min) ;(5)离屯、化000~8000;rpm、15min)，要注意配平；（6)转移上清液至另 一巧pendo计管中，400 y 1左右；（7)加入等体积（400 y 1左右）氯仿-异戊醇（24 : 1)， 振荡器上摇匀巧0~90巧m、30min)(液面分S层，下层颜色较深，上层微带黄绿色）；（8) 离屯、（6000 ~8000;rpm、15min) ; (9)转移上清液至一新的 eppendo;rf 管中（300 ~400ul 左右）；（1〇)加入-2〇°c预冷的无水己醇（2倍体积）至一定刻度，稍微晃动；（ii)-2(rc 冰箱保存20min后离屯、（12000巧111、61