低血清培养st细胞生产猪瘟c株病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒 的方法。
【背景技术】
[0002] ST细胞系猪睾丸（swine testis)细胞，体外培养呈贴壁生长，培养过程中增殖较 为缓慢，且细胞消化传代中容易成团。ST细胞对多种病毒比较敏感，如猪癌病毒（CSFV)、猪 细小病毒（PPV)、伪狂犬病毒等。目前，培养ST细胞生产疫苗多采用转瓶工艺，使用DMEM、 MEM培养基添加10 %的血清培养。
[0003] 目前，国内猪癌疫苗生产技术不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的生物反应 器息浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本高；不同 血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出复杂成 分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋紧，该 大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未有关 于低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒的相关文献报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养ST细胞生产猪癌C株病 毒的方法，该方法可W显著降低生产成本，同时可W提高下游纯化的效率，并且能够快速稳 定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
[0005] 本发明的目的通过W下技术方案来实现；低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒的 方法，它包括W下步骤：
[000引 S1.巧[J备用细胞的传代与培养：
[0007] 取T75瓶培养铺满单层ST细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长 液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将ST细胞置于温度为37 +2°C的二氧化碳培养箱 中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含量的 DMHM或MHM培养液；
[0008] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0009] S21.第一代细胞的驯化：
[0010] 将步骤S1扩大培养的ST细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一 代低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清培养 液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为 8. 3% ；
[0011] S22.第二代细胞的驯化：
[0012] 将驯化的第一代ST细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低 血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混 合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1: 1，其中血清的含量为7. 5% ;
[0013] S23.第H代细胞的驯化：
[0014] 将驯化的第二代ST细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第H代低 血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混 合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为6. 7% ;
[0015] S24.第四代细胞的驯化：
[0016] 将驯化的第H代ST细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低 血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
[0017] S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
[0018] 使用T75细胞瓶，37C静态培养驯化的第四代ST细胞，培养液为默克MD低血清培 养基和血清的混合液，血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
[0019] S4.细胞毒种的繁殖：
[0020] 用病毒培养液将猪癌C株病毒种毒按0. 5~1% (v/v)的比例接种到生产用种子 细胞单层中进行培养，培养7化后收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细胞 适应性连续传代，直至TCIDg。稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；
[0021] S5.制备毒液的繁殖：
[0022] 待生产用种子细胞形成单层，按0. 5~1% (v/v)的比例接入生产用种毒，置于培 养温度为37°C、5%的二氧化碳培养箱中培养，接种后72h收获病毒。
[0023] 进一步地，所述邸TA-膜酶细胞分散液为质量分数为0. 10~0. 25 %的膜酶和 0. 02%的邸TA的Hank' S液的混合液。
[0024] 进一步地，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清 的含量为1~5%。
[00巧]进一步地，步骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素 的混合液，其中，血清的含量为0~1%，抗菌素的含量为100~200IU/mL，且混合液的抑 值为7. 2~7.4。
[0026] 上述技术方案中，低血清培养基为默克MD系列干粉低血清培养基，培养基在使用 前，需按照说明书配成溶液，具体方法如下：1)将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注 射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温2(TC~3(TC)到17. 5升，轻 微揽拌溶解；2)加入23克碳酸氨轴；3)轻微揽拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要， 用Imol/L氨氧化轴溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至7. 2-7. 4 ;5)用0. 2 y m滤膜正压过滤 除菌；6)溶液应在2C -8C下避光保存。
[0027] 本发明具有W下优点：本发明低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒生产疫苗中使 用低血清培养基可有效降低培养液中的牛血清使用量，并能提高细胞密度及生物制品的产 率；本发明ST细胞在低血清培养基的生长情况甚至优于加入10%牛血清的传统培养基，且 能提高细胞密度、提高病毒滴度，获取同样的细胞量，用低血清培养基将比用传统培养基缩 短近1/3的时间，可提高生产效率。因此，本发明提供低血清培养ST细胞生产猪癌C株病 毒的方法可W显著降低生产成本，同时可W提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩 大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
【附图说明】
[002引图巧实施例3中血清添加比例为1%时ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养 时间为2化，图b的培养时间为48h，图C的培养时间为72h ;
[002引图2为实施例3中血清添加比例为2%时ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养 时间为2化，图b的培养时间为48h，图C的培养时间为72h ;
[0030] 图3为实施例3中血清添加比例为3%时ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养 时间为2化，图b的培养时间为48h，图C的培养时间为72h ;
[003。 图4为实施例3中血清添加比例为4%时ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养 时间为2化，图b的培养时间为48h，图C的培养时间为72h ;
[003引图5为实施例3中血清添加比例为5%时ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养 时间为2化，图b的培养时间为48h，图C的培养时间为72h ;
[003引图6为实施例3中对照组ST细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为2化，图 b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0034] 图7为实施例4中低血清培养液驯化的ST细胞接种猪癌病毒后病变情况，其中， 图a的血清添加比例为1%，图b的血清添加比例为2%，图C的血清添加比例为3%，图d 为对照组，图e的血清添加比例为4%，图f的血清添加比例为5%。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于W下所 述。
[0036] 实施例1 ;低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒的方法，它包括W下步骤：
[0037] S1.巧[J备用细胞的传代与培养：
[0038] 取T75瓶培养铺满单层ST细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，邸TA-膜酶 细胞分散液为质量分数为0. 15 %的膜酶和0. 02 %的邸TA的Hank' S液的混合液；用细胞 生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将ST细胞置于温度为37 +2°C的二氧化碳培 养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含 量的DMEM培养液；
[0039] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0040] S21.第一代细胞的驯化：
[0041] 将步骤S1扩大培养的ST细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一 代低血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合 液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8. 3% ;
[0042] S22.第二代细胞的驯化：
[0043] 将驯化的第一代ST细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低 血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1: 1，其中血清的含量为7. 5% ;
[0044] S23.第H代细胞的驯化：
[0045] 将驯化的第二代ST细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第H代低 血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为6. 7% ;
[0046] S24.第四代细胞的驯化：
[0047] 将驯化的第H代ST细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低 血清培养基为默克MD低