一种检测猪c反应蛋白的单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫检测领域，具体设及一种单克隆抗体，其可用于检测猪C反应蛋 白。
【背景技术】
[0002] C反应蛋白（c-reactive protein)是一种能在Ca"存在时与肺炎球菌细胞壁中 英膜多糖C反应形成复合物的急性时相反应蛋白。1930年，Tillett和Francis首次在急 性大叶性肺炎患者的血清中发现。1941年，Avery等测知它是一种蛋白质，故称为C反应蛋 白（CRP)。后来，人们在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了 CRP，于 是人们认为，CRP是组织损伤的一种非特异性反应的标志。
[0003] 在我国，兽用抗生素在兽医临床和动物饲养方面应用广泛、不可或缺，为了达到既 能促进生长又能防病治病的目的，大量的种类繁多的抗生素被应用于畜禽生产的许多环 节。抗生素的长期使用和滥用带来的负面作用和严重的后果已经引起重视甚至到了令人触 目惊屯、的地步。如何合理使用抗生素，保障我们食用的禽蛋奶肉等食品的安全成为关注焦 点。由于CRP通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高或增高不明显，所W常用来作为 鉴别细菌和病毒感染的一个首选指标。因此，血清中CRP的检测对于鉴别细菌还是病毒感 染、监测疾病的活动情况和严重性、观察治疗效果，特别是对抗生素的合理应用有很好的指 导作用。
[0004] 大肠杆菌表达系统是人们应用最多，研究最为透彻的外源蛋白表达系统，大肠杆 菌巧scherichia coli)表达系统的主要优点是其遗传背景和生化特性清楚、易于操作、生 长迅速、培养基成本低、易于制备等。因此对于一些非糖基化蛋白或只要求其抗原性的蛋 白，大肠杆菌表达系统是一个极好的选择。目前许多诊断试剂用的抗原都是由大肠杆菌表 达的。但大肠杆菌表达的蛋白多W包涵体形式存在，无生物学活性。
[0005] 目前，用于CRP的检测方法主要包括免疫比浊测定法、免疫标记测定法巧IA)、酶 联免疫吸附法巧LISA)。但缺乏使用免疫印迹法（Western-blot)对CRP的有效检测方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测猪体内CRP的单克隆抗体。
[0007] 本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体的应用。
[000引为了达到上述目的，本发明首先提供一株稳定分泌猪C反应蛋白单克隆抗体杂交 瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9345。该杂交瘤细胞株已于2014年7月4日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为Sus scrofa C-Reactive Protein杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 9345。
[0009] 本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
[0010] 本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的 应用属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No. 9345的杂交瘤细胞株在制备检测猪C反应蛋 白试剂盒或诊断试剂中的应用。
[0012] 本发明还提供了一种用于检测猪C反应蛋白的试剂盒，含有保藏编号为CGMCC No. 9345的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0013] 含有保藏编号为CGMCC No. 9345的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体的诊断试 剂属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明提供了一种制备能够分泌猪C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方 法，包括W下步骤：
[0015] (1)获得猪CRP基因，构建含有该基因的重组表达载体；
[0016] (2)重组表达载体转化感受态细胞，诱导表达重组蛋白，重组蛋白复性、通过分子 筛层析和离子交换层析纯化猪CRP蛋白得了高纯度的CRP重组蛋白；
[0017] 做将CRP蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，挑选阳性克隆，筛 选杂交瘤细胞株。
[001引其中，步骤（1)获得猪CRP基因采用PCR方法，引物如SEQ ID NO. 1-2所示。
[0019] 步骤似重组蛋白复性是采取分步加入包涵体的方法，先加入2ml包涵体，12小时 候再加入l-2ml包涵体，并将复性时间延长至4她。
[0020] 进一步地，步骤（2)中重组蛋白的复性具体方法为：
[002U (a)配制500血复性液具体配方如下；
[0022]
【主权项】
1. 一株杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 9345。
2. 由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3. 权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应 用。
4. 权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应 用。
5. -种用于检测猪C反应蛋白的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗 体。
6. 含有权利要求2所述单克隆抗体的诊断试剂。
7. -种制备能够分泌猪C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 获得猪CRP基因，构建含有该基因的重组表达载体； (2) 重组表达载体转化感受态细胞，诱导表达重组蛋白，重组蛋白复性、通过分子筛层 析和离子交换层析纯化猪CRP蛋白得了高纯度的CRP重组蛋白； (3) 将CRP蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，挑选阳性克隆，筛选杂 交瘤细胞株。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)获得猪CRP基因采用PCR方法，弓丨 物如SEQ ID NO. 1-2所示。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2)重组蛋白复性是采取分步加入包涵 体的方法，先加入2ml包涵体，12小时候再加入l-2ml包涵体，并将复性时间延长至48h。
10. 如权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，步骤（2)中分子筛层析和离子交换 层析法纯化猪CRP蛋白的方法为： (A) 用分子筛缓冲液平衡Superdex 200 16/60HiL〇ad凝胶层析柱，将浓缩并用分子筛 缓冲液换液完毕之后的蛋白样品于4°C离心除去沉淀，13000rpm，12min，取上清注入快速蛋 白液相色谱的上样环中；根据分子筛层析的结果检测复性效果，将相应分子量的蛋白峰收 集，SDS-PAGE 鉴定； (B) 将SDS-PAGE鉴定后为目的蛋白的蛋白峰收集用阴离子交换柱Resource Q进一 步纯化，用低盐缓冲液A液平衡柱子并上样，样品挂上柱子后用50 %高盐缓冲液B液洗脱 50min，收集洗脱峰进行SDS-PAGE检测。
【专利摘要】本发明提供一种检测猪C反应蛋白的单克隆抗体，本发明还提供该单克隆抗体的制备及其应用。通过基因工程的方法得了高纯度的CRP重组蛋白；用该重组蛋白筛选出分泌CRP蛋白抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC NO.9345。该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效，能够监测猪血清中CRP的含量，鉴别诊断细菌和病毒性疾病，辅助观察治疗效果，从而推动抗生素的合理使用，减少药物残留，保障动物性食品的安全。CGMCC No.934520140704
【IPC分类】G01N33-68, C12N5-20, C07K16-18, G01N33-577
【公开号】CN104630151
【申请号】CN201510025955
【发明人】夏春, 樊淑华
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月19日