一种对于鼠具有感染性的人肠道病毒71型病毒突变株的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种对于鼠具有感染性的人肠道病毒71型病毒突变株。
【背景技术】
[0002]手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是5岁以下儿童常见的病毒性疫病，患病儿童表现为发热、口腔溃疡、手部足部等处皮肤红疹，严重患儿有呼吸系统、循环系统和神经系统等的病变甚至死亡，人肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)是HFMD的两个主要致病原[I]。人肠道病毒71型(EV71)是引起我国手足口病的最主要病原体。
[0003]中国最近爆发的手足口病主要与CA16和EV71有关，其中EV71是导致患者严重症状和重大死亡的主要病原，目前仍无可用的疫苗和特异的药物，EV71的单价灭活疫苗虽已经完成三期的临床试验[2-4]，但仍存在很多问题，而其他类型的疫苗仍在研发阶段[5]，其中基于病毒样颗粒的新型疫苗是最有潜力的候选疫苗[5，6]，但面临动物模型缺乏的问题。目前尚无针对性的预防性疫苗或治疗性药物，也缺乏用于评价疫苗和药物保护效果的小鼠模型。
[0004]小鼠感染模型为研究病毒的致病机制和宿主的免疫反应提供了可行性手段[7-11]，小鼠感染模型也方便评价疫苗有效性和筛选抗病毒药物。然而，EV71病毒不能有效感染成年小鼠[I]。因此，缺乏适宜的小动物感染模型大大限制了候选疫苗有效性的评价，本领域亟待尽快解决这一瓶颈问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种对于鼠具有感染性的人肠道病毒71型病毒突变株。
[0006]在本发明的第一方面，提供一种人肠道病毒71型的鼠适应株，所述适应株在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC V201343。
[0007]在一个优选例中，所述的人肠道病毒71型的鼠适应株对于鼠的致病力强。
[0008]在本发明的另一方面，提供所述的人肠道病毒71型的鼠适应株的用途，用于制备试剂，所述的试剂用于制备感染人肠道病毒71型的鼠。
[0009]在一个优选例中，所述的感染人肠道病毒71型的鼠用于作为动物模型，评价抗病毒药物的治疗效果。
[0010]在本发明的另一方面，提供一种用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的组合物，所述的组合物含有所述的人肠道病毒71型的鼠适应株；以及生理学可接受的载体。
[0011]在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的试剂盒。
[0012]在本发明的另一方面，提供一种用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的试剂盒，其中包括所述的人肠道病毒71型的鼠适应株或所述的组合物。
[0013]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
[0014]图1、EV71对ICR乳鼠的致病性，2.5X107TCID50的G082腹腔感染I日龄ICR小鼠(n=14)和1.0 X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染7日龄ICR小鼠(n=7)，感染后观察小鼠的存亡情况和临床病征14天。小鼠在感染EV71后的存亡曲线(A)和临床症状分级情况(B)。临床病征分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0015]图2、鼠适应株MAV-W腹腔注射，感染2周龄及较小的ICR小鼠，
[0016]不同剂量的鼠适应株MAV-W腹腔注射7日龄和14日龄的ICR小鼠后的存亡曲线
(A)和临床症状分级(B)。临床病征分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0017]图3.G08-MAV感染c57小鼠，2.5X107TCID50的G082腹腔注射感染I日龄c57小鼠(n=6)，鼠适应株MAV-W腹腔注射感染7日龄c57小鼠(n=ll)后的死亡曲线㈧和临床症状分级(B)。临床病征分级如下:0级，健康；I级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0018]图4、利用MAV-W评价EV71单抗D5的抗病毒保护效果。三组7日龄ICR乳鼠腹腔注射鼠适应株獻￥-1(5父1051'(:1050)，2411后三组分别腹腔注射？83、对照抗体(10 μ g/g)和EV71特异单抗D5 (10 μ g/g)。之后连续14天每天记录各组的临床症状评分(A)和死亡率
(B)。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。其中对照抗体为HBsAg特异的单抗。
【具体实施方式】
[0019]本发明人通过在小鼠体内连续传代人肠道病毒71型(EV71)G082分离株，获得一个鼠适应性的突变株，命名为MAV-W，并在已建立的小鼠感染模型中评价了 EV71单抗对病毒攻击小鼠的有效保护作用。本发明的毒株为评价候选疫苗和药物的有效性以及研究EV71的致病机制提供了有效途径。
[0020]与亲本株G082相比，本发明获得的MAV-W病毒对小鼠的致病性增强，MAV-W腹腔接种7日龄和14日龄ICR小鼠后引起共济失调、瘫痪等典型神经症状和较高死亡率，MAV-W腹腔感染7日龄c57小鼠，也出现严重瘫痪和死亡。因此，本发明的MAV-W病毒非常适合用于制备动物EV71感染模型，应用于科学研究。
[0021]应用本发明的MAV-W病毒制备的动物感染模型，其病情变化显著、利于观察和评估。适合应用于对一些潜在治疗病毒感染的药物进行疗效评估。在本发明的实施例中，利用基于MAV-W的EV71小鼠感染模型，发现EV71中和性抗体能够有效保护被病毒攻击的小鼠。
[0022]本发明还提供了一种组合物，含有有效量所述的人肠道病毒71型的鼠适应株以及生理学可接受的载体。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“生理学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。
[0023]本发明还提供了一种用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的试剂盒或药盒，其中含有所述的组合物，或所述的重组载体。
[0024]此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。
[0025]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0026]1、材料与方法
[0027]细胞和实验动物
[0028]RD细胞(购自中国科学院细胞库)和Vero细胞(购自中国科学院细胞库)用含有10%血清和100U/ml青霉素、ΙΟΟμ g/ml链霉素的DMEM培养基培养。ICR和c57孕鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海巴斯德研究所的ABSL2+动物房。
[0029]EV71鼠适应株的建立
[0030]EV71 病毒G082 株(即 Ku Z, Shi J, Liu Q, and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193-197 中的 EV71/G082 病毒株)在 RD 细胞上扩增，按照Reed-Muench法在RD细胞上测定病毒滴度TCID50为5.0X 108/ml，该分离株病毒通过腹腔感染一日龄的ICR小鼠，取一只出现明显瘫痪的小鼠脑组织，加入Iml冷的无菌PBS溶液后碾磨勻衆，反复冻融三次后，4000rpm/min在4°C离心30min,0.45 μ m滤器过滤,取上清液，在Veix)细胞上传代一次，腹腔注射I日龄的ICR小鼠，取一只病死的小鼠脑组织，同上处理后在Vero细胞上传代,如此反复进行在小鼠体内和Vero细胞上进行四个循环,最终筛选获得一株鼠适应的EV71病毒，命名为EV71-G082-Mouse Adapted Virus-W(MAV-W)，分装后_80°C保存，并在Vero细胞测定其TCID50值为1.0X 108/ml。
[0031]病毒感染小鼠实验
[0032]特定日龄的ICR或c57小鼠腹腔注射适当剂量的野生毒株G082或鼠适应株MAV-W,以后每日观察小鼠的临床病症和存亡情况。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0033]利用MAV-W评价EV71单抗对病毒攻击小鼠的保护效果
[0034]三组7日龄的ICR小鼠先通过腹腔注射感染MAV-W(5.0X105TCID50)，24h后三组ICR小鼠分别通过腹腔注射PBS、对照抗体(即Ku Z，Shi J，Liu Q，and HuangZ*.Development of murine monoclonal antibodies with potent neutralizat1neffects on enterovirus71.J.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的对照抗体)(10 μ g/g)和 EV71 的单抗 D5(即 Ku Z，Shi J，Liu Q，and Huang Z*.Development of murinemonoclonal antibodies with potent neutralizat1n effects on enterovirus71.T.Virol.Methodsl86 (2012) 193 - 197 中的 D5) (10 μ g/g)，之后连续 14 天每天记录各组的临床症状评分和死亡率。临床病症分级如下:0级，健康；1级，反应迟缓；2级，平衡失调，肌无力；3级，瘫痪；4级，死亡。
[0035]I1、实施例
[0036]实施例1、MAV-W对小鼠的致病力显著增强
[0037]为比较G082和MAV-W对小鼠的致病力，将2.5 X 107TCID50的G082腹腔感染I日龄ICR小鼠，1.0X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染7日龄ICR小鼠，小鼠的死亡率分别为0%和85.7%(图1A)，G082感染的I日龄小鼠约64%(9/14)出现运动失调，仅7%(1/14)的小鼠出现瘫痪。而7日龄的小鼠在感染1.0X106TCID50的MAV-W后表现出反应迟缓、共济失调、腿无力继而发生瘫痪甚至死亡的临床病症(图1B)，感染后第5天开始出现瘫痪，约85.7%(6/7)的小鼠出现瘫痪