，动物感染实验表明，鼠适应病毒MAV-W能导致7日龄的小鼠更严重的病症和死亡。
[0038]实施例2、腹腔注射MAV-W能有效感染2周龄ICR小鼠
[0039]为研究鼠适应病毒MAV-W对不同日龄小鼠的感染性，2 X 105TCID50和5X106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染7日龄的ICR小鼠，小鼠的死亡率分别为42.9%和87.5%(图2A)，5X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染7日龄的ICR小鼠后5天出现瘫痪，约100%(8/8)的小鼠出现运动失调，87.5%(7/8)的小鼠出现瘫痪(图2B)。
[0040]5X106TCID50和I X 107TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染14日龄的ICR小鼠，小鼠的死亡率分别为0%和57.1%(图2A)，5X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染14日龄的ICR小鼠后7天出现瘫痪，约57.1%(4/7)的小鼠出现运动失调，仅14.3%(1/7)的小鼠出现瘫痪(图2B)，而I X 107TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染14日龄的ICR小鼠后5天出现瘫痪，约100%(7/7)的小鼠出现运动失调，100%(7/7)的小鼠出现瘫痪(图2B)。
[0041]鼠适应病毒MAV-W感染两周龄及其以下的小鼠有一定的剂量效应和日龄依赖性，随着日龄的增加，鼠适应病毒对小鼠的致死率呈现下降趋势，在感染后小鼠表现出反应迟缓、共济失调、腿无力、瘫痪甚至死亡的临床病症，鼠适应病毒MAV-W能够有效感染2周龄的ICR小鼠。
[0042]实施例3、MAV-W感染c57小鼠
[0043]获得的MAV-W能通过腹腔注射感染ICR乳鼠，本实施例考察其他品系的小鼠是否也被该EV71病毒突变株感染。
[0044]与腹腔注射感染ICR乳鼠相同剂量的病毒，对c57乳鼠进行感染，感染后小鼠也表现出反应迟缓、共济失调、腿无力、瘫痪和死亡的临床病症(图3B)。2.5X107TCID50的G082腹腔注射感染I日龄c57小鼠，5 X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔注射感染7日龄c57小鼠，死亡率分别为66.7%和100%(图3A)，2.5X107TCID50的G082腹腔感染I日龄的c57小鼠后5天出现瘫痪，约100%(6/6)的小鼠出现运动失调，66.7%(4/6)的小鼠出现瘫痪(图3B)，而1X107TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染I日龄的c57小鼠后3天出现瘫痪，约100%(11/11)的小鼠出现运动失调，100%(11/11)的小鼠出现瘫痪(图3B)。说明获得的MAV-W通过腹腔注射能感染c57乳鼠。
[0045]实施例4、利用MAV-W评价EV71单抗D5的抗病毒保护效果
[0046]三组7日龄ICR乳鼠腹腔注射鼠适应株MAV-W (5 X 15TCID50)，24h后三组分别腹腔注射PBS、对照抗体和EV71特异单抗D5。结果显示，EV71单抗D5组的小鼠仅仅显示非常轻微的临床症状(行动迟缓)，并且死亡率为0(图4A)。但是，PBS组和对照抗体组的小鼠出现典型瘫痪症状(图4B)，瘫痪率分别为100%(8/8)和100%(8/8)，并且逐渐死亡，最终的死亡率分别为87.5%(7/8)和75%(6/8)，显示了单克隆抗体的对感染小鼠的治疗作用。因此，本发明的MAV-W由于其能有效感染小鼠的特性，能够用于在动物水平上评价抗病毒药物的治疗效果。
[0047]讨论
[0048]人类是EV71已知的唯一自然宿主，EV71不能感染成年小鼠，本发明人将一个对I日龄ICR小鼠有较弱致病性的G082通过小鼠体内传代获得了鼠适应性病毒突变株MAV-W，2.5X107TCID50的G082腹腔注射感染I日龄C57小鼠、1.0 X 106TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染7日龄ICR小鼠以及IX 107TCID50的鼠适应株MAV-W腹腔感染14日龄的ICR小鼠的死亡率分别为0%、85.7%和57.1%，鼠适应株病毒感染的小鼠出现典型的反应迟缓、共济失调、腿无力、瘫痪和死亡的临床病症，说明与比G082相比，MAV-W对小鼠的致病性大大增强，MAV-W腹腔注射能有效感染7-14日龄的ICR小鼠，是目前能感染小鼠日龄最大的EV71C4亚型病毒突变株；进而在此小鼠感染模型上评价了 EV71单克隆抗体对感染小鼠的治疗作用，说明本小鼠感染模型可以用于候选疫苗的评价、抗病毒药物的筛选以及病毒感染机制等方面的研究。
[0049]生物保藏
[0050]本发明的肠道病毒71型C4亚型MAV-W，已经于2013年9月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为CCTCC V201343。
[0051]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0052]参考文献
[0053]1.Solomon,T.,et al., Virology,epidem1logy,pathogenesis,and control ofenterovirus71.Lancet Infect Dis，2010.10 (11):p.778-90.
[0054]2.Li，Y.P.，et al.，Safety and immunogenicity of a novel humanEnterovirus71(EV71)vaccine:a randomized, placebo-controlled, double-blind,PhaseI clinical trial.Vaccine,2012.30(22):p.3295-303.
[0055]3.Zhu,F.C., et al.,Immunogenicity and safety of an enterovirus7lvaccinein healthy Chinese children and infants: a randomised，double-blind，placebo-controlled phase2clinical trial.Lancet,2013.381 (9871):p.1037-45.
[0056]4.Zhu, F.C.，et al.，Efficacy, safety, and immunology of an inactivatedalum-adjuvant enterovirus7Ivaccine in children in China:a multicentre，randomised， doubIe_bIind， placebo-controlled, phase3triaI.Lancet，2013.381 (9882):p.2024-32.
[0057]5.Lee, M.S.and L.Y.Chang, Development of enterovirus71vaccines.ExpertRev Vaccines，2010.9(2):p.149-56.
[0058]6.Ku, Z.，et al.，Neutralizing antibodies induced by recombinantvirus-like particles of enterovirus7Igenotype C4inhibit infect1n at pre-andpost-attachment steps.PLoS One，2013.8 (2):p.e5760L
[0059]7.Johnson, A.J.and J.T.Roehrig, New mouse model for dengue virus vaccinetesting.J Virol, 1999.73(1):p.783-6.
[0060]8.Khong, W.X.，et al.，Sustained high levels of interleukin_6contributeto the pathogenesis of enterovirus7Iin a neonate mouse model.J Virol,2011.85(7):p.3067-76.
[0061]9.Khong, W.X.，et al.，A non-mouse-adapted enterovirus71 (EV71) strainexhibits neurotropism， causing neurological manifestat1ns in a novel mousemodel of EV71infect1n.J Virol，2012.86(4):p.2121-31.
[0062]10.Bek, E.J.，et al.，Formal in-1nactivated vaccine provokescross-protective immunity in a mouse model of human enterovirus71 infect1n.Vaccine，2011.29(29-30):p.4829-38.
[0063]11.Liu, M.L.，et al.，Type I interferons protect mice againstenterovirus71infect1n.J Gen Virol,2005.86 (Ptl2):p.3263-9.
【主权项】
1.一种人肠道病毒71型的鼠适应株，其特征在于，所述适应株在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC V201343。
2.如权利要求1所述的人肠道病毒71型的鼠适应株，其特征在于，所述的人肠道病毒71型的鼠适应株对于鼠的致病力强。
3.权利要求1所述的人肠道病毒71型的鼠适应株的用途，用于制备试剂，所述的试剂用于制备感染人肠道病毒71型的鼠。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的感染人肠道病毒71型的鼠用于作为动物模型，评价抗病毒药物的治疗效果。
5.一种用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的人肠道病毒71型的鼠适应株；以及生理学可接受的载体。
6.权利要求5所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的试剂盒。
7.一种用于制备感染人肠道病毒71型的鼠的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1所述的人肠道病毒71型的鼠适应株或权利要求5所述的组合物。
【专利摘要】本发明涉及一种对于鼠具有感染性的人肠道病毒71型病毒突变株。本发明的毒株为评价候选疫苗和药物的有效性以及研究EV71的致病机制提供了有效途径。CCTCC NO:V20134320130926
【IPC分类】A61K49-00, A01K67-027, C12N7-00, C12R1-93
【公开号】CN104630152
【申请号】CN201310553509
【发明人】黄忠, 刘庆伟
【申请人】中国科学院上海巴斯德研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月8日